Poly Copie Biologie Moléculaire et Génie Génétique - 1ère Année S1 PDF

Pr. T. ROCHD Poly cours 1ère année 1/28 FACULTE DE MEDECINE DENTAIRE MODULE : BIOLOGIE CELLULAIRE, MOLECULAIRE ET GENETIQUE POLYCOPIE DE BIOLOGIE MOLECULAIRE ET GENIE GENETIQUE 1ère ANNEE « S1 » Pr. T. ROCHD  Pr. T. ROCHD Po...

Pr. T. ROCHD Poly cours 1ère année 1/28 FACULTE DE MEDECINE DENTAIRE MODULE : BIOLOGIE CELLULAIRE, MOLECULAIRE ET GENETIQUE POLYCOPIE DE BIOLOGIE MOLECULAIRE ET GENIE GENETIQUE 1ère ANNEE « S1 » Pr. T. ROCHD  Pr. T. ROCHD Poly cours 1ère année 2/28 SOMMAIRE I. LES ACIDES NUCLEIQUES I-1- Définition I-2- Structure des acides nucléiques I-2-1- Le nucléotide I-2-2- L’ADN I-2-3- L’ARN II. LA RÉPLICATION II-1- Définition II-2- Caractéristiques de la réplication II-3- Les outils de la réplication 4. Les étapes de la réplication 1. L’initiation de la réplication 2. L’élongation ou la synthèse d’ADN 3. La terminaison III. MUTATIONS ET SYSTEME DE SAUVEGARDE ET REPARATION 1. Les mutations : 1. Définition 2. Les mutatio ns et leurs conséqu ences 3. Les mécanis mes de réparati on de l’ADN IV. MECANISMES DE LA TRANSCRIPTION 1. Définition  Pr. T. ROCHD Poly cours 1ère année 3/28 V. L’EXPRESSION DU GENOME (LA TRADUCTION) V-1- Définition V-2- les étapes de la traduction V-2-1- Initiation V-2-2- Elongation V-2-3- Terminaison V-3- Modifications post- traductionnelles VI. LE GENIE GENETIQUE VI-1- Définition VI-2- Les outils enzymatiques pour étudier l’ADN : VI-2-1- Les enzymes de restriction : VI-2-2- Les vecteurs VI-2-3- les sondes VI-3- Le clonage VI-3-1- Définition VI-3-2- Clonage d’un gène VI-4- Applications du génie génétique VI-4-1- Diagnostic des maladies VI-4-2- Thérapie génique  Pr. T. ROCHD Poly cours 1ère année 4/28 Chapitre 1 : BIOLOGIE MOLECULAIRE Définition La Biologie Moléculaire est une discipline consacrée à l'étude des molécules porteuses du message héréditaire (ADN, ARN), de leur structure, synthèse et altérations. I- LES ACIDES NUCLEIQUES I-1- Définition Sont des enchaînements de nucléotides. Ces polynucléotides (ADN ou ARN), jouent un rôle fondamental dans le stockage, le maintien et le transfert de l'information génétique chez les êtres vivants. I-2- Structure des acides nucléiques I-2-1- Le nucléotide : est l’unité de construction des acides nucléiques. Un nucléotide = sucre P + base + groupement phosphate P Nucléoside tri- P P Structure d’un nucléotide tri-phosphate (S= sucre et B= base) Il existe 4 nucléotides différents pour l'ADN : adénine (A), thymine (T), guanine (G), cytosine (C) et 4 nucléotides différents pour l'ARN : adénine (A), uracile (U), guanine (G), cytosine (C). C'est la succession des bases résultant de l'enchaînement des nucléotides dans l'acide nucléique qui constitue le message génétique. I-2-2- L’ADN  Pr. T. ROCHD Poly cours 1ère année 5/28 I-2-2-1- Définition : L’ADN est la molécule support de l'information génétique héréditaire. L'ADN forme des pelotes qui, chez les organismes eucaryotes, sont localisées dans le noyau des cellules et une partie au niveau des mitochondries. Il est constitué par un enchaînement (séquence) précis de nucléotides. I-2-2-2- Structure de l’ADN Dans le noyau, il est linéaire et est scindé en plusieurs ADN formant des chromosomes. Il est plus ou moins compacté et associé aux histones. Dans les mitochondries et les chloroplastes, l'ADN peut prendre de nombreuses formes différentes, circulaires, linéaires ou encore ramifiés. Structure et localisation d’un chromosome eucaryote La structure originale de l'ADN est formée de 2 brins complémentaires, antiparallèles enroulés en hélice. Les bases azotées s’hybrident entre elles (A avec T et C avec G). On dit que les bases sont complémentaires.  Pr. T. ROCHD Poly cours 1ère année 6/28 3’ 5 1 2 3 5’ 4 1’ 4 3 ’ 5 2’ ’ HYBRIDATION DES BACSES AZOTEE S 5’ 3’ 3’ 5’ I-2-2-3- Fonction L'ADN humain est une macromolécule contenant 3,3 milliards de paires de bases. Seules environ 10% codent dont 1,5% pour la synthèse protéique. Les fonctions de l’ADN : 1.Sa fonction principale est de stocker l'information génétique. Cette information est contenue dans l'enchaînement non-aléatoire des nucléotides. 2.La transmission de cette information de génération en génération. Cela permet l'hérédité. 3.Possibilité de modification de l'information portée par l'ADN (= mutation). Cela aboutit à une diversité des individus et à une évolution possible des espèces. 1.2.2.4. Les différents types d’ADN : ADN polymérase : enzyme catalysant la formation d'ADN à partir des nucléotides ADN répétitif : séquences d'ADN identiques qui se répètent dans le génome. C’est un ADN non codant  Pr. T. ROCHD Poly cours 1ère année 7/28 ADN circulaire : ADN formant une molécule circulaire. ADN ribosomique ou ADN ribosomal ou ADNr : ADN codant pour les ARN ribosomiques. ADN mitochondrial ou ADNmt : ADN constituant le génome des mitochondries. I-2-3- L’ARN I-2-3-1- Définition et structure : L’ARN est un polynucléotide similaire à l'ADN, aussi bien en termes structurels qu'en termes fonctionnels (matérialisation et traitement de l'information génétique). L’ARN présente 4 différences par rapport à l'ADN : - l’ARN est toujours simple brin sauf chez certains procaryotes, - le sucre est un ribose et non désoxyribose (ADN), - la base complémentaire de l’adénine est l’uracile et non la thymine (ADN), - l'ARN est court (50 à 5 000 nucléotides et non pas des millions comme dans l'ADN). I-2-3-2- Les différents types d’ARN et leurs fonctions biologiques : Dans la cellule eucaryote, il existe 5 familles d’ARN assurant chacune une fonction : ARNr = ARN ribosomique Participent, avec les protéines ribosomiques, à la formation des ribosomes ARNt = ARN de transfert Transfert les acides aminés vers le lieu de synthèse des protéines ARNm = ARN messagers Portent l’information génétique de l’ADN vers le lieu de synthèse des protéines ARNsn = ARN small nuclear Présent dans le noyau uniquement  Pr. T. ROCHD Poly cours 1ère année 8/28 II. LA RÉPLICATION 1. Définition : La réplication de l'ADN est un phénomène physiologique au cours duquel l'ADN est synthétisé grâce à l'ADN pol. Ce mécanisme permet à l’ADN d'être dupliqué (donc doublé). La duplication (ou réplication) a lieu pendant la phase S du cycle cellulaire. 2. Caractéristiques de la réplication La réplication de l’ADN est semi-conservatrice et bidirectionnelle À l’issue de la réplication, chacune des 2 molécules d’ADN nouvellement formée est constituée d’un brin parental et d’un brin néoformé. On qualifie ce processus de semi- conservateur. La réplication de l’ADN débute à partir d’une origine de réplication et progresse dans les 2 sens à partir de ce point créant ainsi une fourches de réplication. On dit que la réplication de l’ADN est bidirectionnelle. 3. Les outils de la réplication La réplication de l’ADN nécessite :  Une matrice d’ADN (brin parental)  Des bases puriques et pyrimidiques (A, C, G,T,U)  Des enzymes ► Hélicase : permet la séparation des 2 brins ► les protéines de liaison empêchent les 2 brins de se recoller. ► ARN polymérase ou primase (fournit les amorces ARN) ► l’ADN polymérase ► Topo-isomérase : coupe un brin, pour déroulement ► ADN ligase resoude le brin ADN (rétablit les liaisons phosphodiesters) ► RNase H enlève les amorces  Pr. T. ROCHD Poly cours 1ère année 9/28 4. Les étapes de la réplication 1. L’initiation de la réplication : L’initiation de la réplication a lieu à l’origine de la réplication. Il existe plusieurs origines de réplication. Comme il existe aussi des protéines capables de reconnaître ces origines et d’initier la réplication. La fourche de réplication est créée par l’action des hélicases qui brisent les liaisons hydrogènes entre les 2 brins de la double hélice d’ADN ce qui permet leur séparation. D’autres protéines (=protéines de liaison) peuvent se lier à l’ADN simple brin ainsi formé et éviter la reformation de la double hélice. 2. L’élongation ou la synthèse d’ADN L’élongation de l’ADN progresse toujours dans le sens 5' vers 3' pour le brin en création. C’est l'ADNpol, qui ajoute à l'extrémité 3' de la molécule en formation, des désoxyribonucléotides. Etant donné que les 2 brins de la double hélice d’ADN sont antiparallèles. Il existe de ce fait des mécanismes différents selon le brin d’ADN répliqué. Il existe ainsi un « brin direct » et un « brin indirect»: le « brin direct » est le brin complémentaire du brin parental orienté 3’ vers 5’. Il est donc créé de façon continue, dans le sens 5’ vers 3’ ;  Pr. T. ROCHD Poly cours 1ère année 10/28 Le « brin indirect » est le brin complémentaire du brin parental orienté 5' vers 3’. Il est créé de façon discontinue, sous forme de fragments d’Okazaki, dans de sens 5’ à 3’. L'ADNpol. a besoin d'une amorce pour fonctionner, c'est L'ARNpol (primase) qui fournit cette amorce. Il y aura donc sur le brin retardé (= fragments d’Okazaki) des jonctions ARN-ADN, qui seront par la suite éliminées par une RNase H. D’autres ADN pol. vont ensuite combler les lacunes laissées par l'ARN. Sur l'ADN double brin précédant l'hélicase se fixe une topo-isomérase I qui va permettre d'éviter les torsions entraînées par l'ouverture de la double-chaîne par l'hélicase (comme pour une ficelle dont on écarte les 2 brins), en coupant un des brins, puis le ressoudant après déroulement. II.4.3. La terminaison Cette phase correspond à l’arrêt de la réplication lorsque 2 fourches de réplication se rencontrent.  Pr. T. ROCHD Poly cours 1ère année 11/28 III. MUTATIONS ET SYSTEME DE SAUVEGARDE ET REPARATION La réplication et la réparation de l'ADN sont 2 processus cellulaires régulés de manière stricte. Ils permettent le maintien de l'intégrité de l'information génétique, laquelle est nécessaire à l'activité cellulaire normale et à la mitose. Beaucoup de cancers sont caractérisés par une instabilité génétique. 1. Les mutations : 1. Définition : Le terme mutation est utilisé en génétique pour désigner une modification irréversible de la séquence d'un génome (ADN ou ARN). Les mutations peuvent être spontanées lors de la réplication, dues à l'exposition à des agents mutagènes (radiations (ex: UV, X, ɤ), agents chimiques (ex: pesticides) ou une modification du système de réparation de l'ADN, qui cesse alors de corriger les erreurs. Chez les animaux pluricellulaires, les mutations de la lignée germinale peuvent être transmises à la descendance, contrairement aux mutations somatiques. Un défaut dans l'ADN peut engendrer des maladies "héréditaires", comme le diabète, l'alzheimer, et bien d'autres. La probabilité de mutation = 10-9 à 10-10 2. Les mutations et leurs conséquences :  substituti = remplacement 1. Les différents types de mutations : d’une base par une on autre  délétion = perte d’une base La mutation peut correspondre à une :  insertion = ajout d’une base  Pr. T. ROCHD Poly cours 1ère année 12/28 Brin parental ……………….……TGG CAT GTT CGA Brin complémentaire …………….ACC GTA CAA GCT Substitution …………………..… ACC GCA CAA GCT Délétion ………………………… ACC GAC AAG CTN Insertion ………………………… ACC GAT ACA AGC La mutation peut aussi toucher l’ARN : Elle est possible mais moins importante car ne concerne qu’une protéine. La mutation peut toucher les chromosomiques : Cas de la trisomie III.1.2.2. Effets des mutations :  Mutations silencieuses : Changement de base ne modifie pas l’acide aminé (Aa) (ex : UUU → UUC = Phe)  Mutations conservatrices : Changement de base induit un changement d’Aa, mais ayant les mêmes propriétés (ex : AAA (Lys) → AGA (Arg) : 2 Aa basiques)  Mutations faux sens : Changement de base induit un changement d’Aa, n’ayant pas les mêmes propriétés donc la protéine est non fonctionnelle (ex : AAA (Lys, basique) → GAG (Gly, acide))  Mutations du codon stop : Changement d’un codon Aa en codon stop = protéine tronquée Changement d’un codon stop en codon Aa = protéine allongée  Pr. T. ROCHD Poly cours 1ère année 13/28 Alanine (Ala) Leucine (Leu) Arginine (Arg) Lysine (Lys) Acide asparagique Méthionine (Met) (Asp) Asparagine Phénylalanine (Asn) Cystéine (Cys) (Phe) Proline (Pro) Acide glutamique Sérine (Ser) (Glu) Glutamine Thréonine (Thr) (Gln) Glycine (Gly) Tryptophane Histidine (Trp) Tyrosine (His) (Tyr) Valine (Val) Isoleucine (Ile) DU CODON A LA PROTEINE III.1.2.3. Conséquences des mutations : Avantages : principe de l’évolution : individus portant la mutation sont mieux adaptés à leur environnement  Maladies : ex1 : Anémie falciforme = maladie génétique caractérisée par une hémoglobine anormale. ex 2 : Mutation de certains gènes peut participer à l’apparition de tumeur (bénigne ou maligne)  Pr. T. ROCHD Poly cours 1ère année 14/28 III.1.3. Les mécanismes de réparation de l’ADN : La plupart des mutations sont corrigées par des enzymes de réparation au cours de la réplication. Ces enzymes reconnaissent le brin néoformé.  Les endonucléases coupent l’ADN en amont et en aval de la mutation  L’ADNpol comble la brèche selon le modèle du brinparental  Et enfin la ligase relie les 2 parties du brin néoformé REPARATION D’UNE MUTATION DUE AUX UV L’erreur peut aussi être corrigée pendant la réplication La correction se fait dans le sens 3’ 5’ l’exonucléase dégrade la nouvelle extrémité 3’ si l’appariement n’est pas correct. L’ADNpol reprend son travail et insert le bo nucléotide On parle d’une fonction d’édition (« proofreading ») REPARATION D’UNE ERREUR DE REPLICATION  Pr. T. ROCHD Poly cours 1ère année 15/28 IV. MECANISMES DE LA TRANSCRIPTION 1. Définition : La transcription est un processus biologique permettant la copie des régions dites codantes de l'ADN en molécules d’ARN. C'est la 1ère étape du mécanisme qui permet de passer de l'ADN à la protéine. IV.2. Mécanismes de transcription de l’ADN en ARNm Une unité de transcription (= gène) s'étend toujours d'un site d'initiation de la transcription jusqu'à un site de terminaison de la transcription. 5’ 3’ 3’ site site de 5’ GENE d'initiation terminaison Le mécanisme général de la transcription pourra donc être divisé en 3 étapes distinctes : a. L'initiation : reconnaissance du début de l'unité de b. L'élongatio transcription polymérisation de la chaîne n: c. La terminaisond'ARN : reconnaissance de la région de terminaison.  Pr. T. ROCHD Poly cours 1ère année 16/28 La transcription se fait dans le sens 5’ vers 3' Attention : un seul des 2 brins d'ADN est transcrit = brin matrice = brin antisens. Le brin matrice sera transcrit en ARN. Cet ARN est la copie complémentaire du brin matrice. Il est aussi la copie conforme du brin opposé : le brin codant (à l'exception de la Thymine qui sera de l'Uracile). 1. L'initiation de la transcription :  L’ARN polymérase est l’enzyme qui assure la transcription, il reconnaît et se fixe sur une région particulière de l'ADN = le site promoteur. 2. L’élongation : La transcription se fait dans le sens 5’ vers 3' ce qui signifie qu'elle s'agrandit en 3'. Lors de la transcription, les 2 brins d’ADN se séparent devant l’ARN pol permettant sa progression. Une fois l’ARN pol passé, les 2 brins d’ADN se referment par rétablissement des liaisons hydrogènes.  Pr. T. ROCHD Poly cours 1ère année 17/28 La boucle de transcription comporte environ 17 bases ouvertes. La vitesse de polymérisation est d'environ 30 à 80 nucléotides par seconde. IV.2.3. La terminaison de la transcription : La transcription d'un gène s'achève quand l'ARN pol arrive à la fin de l'unité de transcription. L'ARN pol se décroche de la matrice et la boucle de transcription se referme. Cette terminaison de transcription se produit en une région appelée "site de terminaison". La terminaison est assurée par des signaux spécifiques dont le signal de polyadénylation AAUAAA. L’ARN pol continue sa transcription un peu après ce motif puis est libérée sous l'action de divers facteurs. La transcription proprement dite est terminée mais l'ARN obtenu n'est pas fonctionnel pour autant et doit subir 3 étapes de maturation. IV.3. Maturation de l’ARNm La maturation post-transcriptionnelle a lieu au niveau du noyau. En effet, l'ADN chez les eucaryotes possède des séquences codantes (Exons) et des séquences non codantes (Introns). Seuls les exons participent à la synthèse des protéines. La maturation se déroule en 3 étapes Etape 1 : Addition d’une queue poly A L'ARN est clivé au niveau du signal de polyadé-nylation et une polymérase spécifique (la polyA Polymérase) ajoute de nombreux résidus Adénine (200 chez les  Pr. T. ROCHD Poly cours 1ère année 18/28 eucaryotes) : c'est la queue polyA, essentielle à la stabilité de l'ARN. Il est à noter que cette partie de l'ARN n'est pas codée dans l'ADN sous forme de polyT. Etape 2 : Addition d’une coiffe À l'autre extrémité 5', l'addition d'une coiffe ou cap méthylguanosine est nécessaire pour la reconnaissance par les ribosomes lors de l'étape de traduction. Etape 3 : Excision-épissage Il s’agit d’une excision des introns et réunion (= épissage) des exons. L'épissage permet en outre d'obtenir différentes protéines à partir d'un même gène en sélectionnant Excision quels - exons Epissage seront conservés : c'est l'épissage alternatif). Intron ARNm Exon 1 Exon 2 Protéines à activité Endonucléase et ligase Coiffe 5’ AAAAAAA 3’ Exon Intron Exon Intron Exon Coiffe 5’ AAAAAAA 3’ Exon1 Exon2 Exon3 Résumé maturation du transcrit 1 Queue poly A en 3’ : AAAAAAAAAAAAAAAAAA 2 Coiffe en 5’ : CH3-G-ppp 3 Exision – Epissage : exon-intron-exon-intron- exon exon-exon- exon  Pr. T. ROCHD Poly cours 1ère année 19/28 Remarque : en fait, la maturation du transcrit primaire a lieu en même temps que la transcription. V- L’EXPRESSION DU GENOME = TRADUCTION V-1- Définition La traduction est l'interprétation des codons de l'ARNm en acides aminés (Aa). Le code génétique est le système de correspondance permettant à l'ARN d'être traduit en protéine. codon = groupe de 3 nucléotides V-2- les étapes de la traduction La traduction s'effectue dans le cytoplasme, elle nécessite des Aa qui sont polymérisés selon l'ordre donné par les codons de l'ARNm. Elle a besoin d'énergie, de ribosomes, d’ARNt, d’enzymes et de l’ARNm. V-2-1- Initiation Une fois que le brin d'ARNm a atteint le cytoplasme, il se fixe à un ribosome, qui va assembler une séquence d’Aa selon les "instructions" du code génétique. Chaque codon correspond à un Aa, sauf 3 codons, appelés codons « stop », qui provoquent l'arrêt de la traduction. Le codon AUG, appelé codon-initiateur, va  Pr. T. ROCHD Poly cours 1ère année 20/28 permettre de commencer la traduction, comme son nom l'indique, en formant l’Aa méthionine, qui se détachera plus tard de la chaîne polypeptidique. ARNm mature prêt pour la traduction V-2-2- Elongation Le ribosome va parcourir le brin d'ARNm codon par codon (= translocation) et va par l'intermédiaire d'un ARNt ajouter un Aa à la protéine en cours de fabrication selon le codon lu. V-2-3- Terminaison Une fois le codon « stop » atteint (UAA, UGA ou UAG), la protéine est complète : le ribosome se détache de la protéine et du brin d'ARNm, et la protéine est libérée dans l'organisme. Le ribosome va se disloquer en ses 2 sous-unités (60s et 40s) et pourra faire une autre synthèse sur un autre ARNm. Le même filament d'ARNm peut servir à la fabrication simultanée de plusieurs protéines, lorsque plusieurs ribosomes s'en chargent. Avant d'être détruit, cet ARNm participe, en effet, à la fabrication de 10 à 20 protéines. La protéine ainsi synthétisée soit reste à l’intérieur de la cellule soit la quitte pour aller dans le système sanguin.  Pr. T. ROCHD Poly cours 1ère année 21/28 RESUME : La traduction se décompose en 3 étapes : 1. l'initiation qui correspond à la formation du complexe d'initiation, 2.l'élongation qui permet d'accrocher de nouveaux Aa à la chaîne peptidique en cours de synthèse, 3. la terminaison qui conduit à la libération de la chaîne peptidique. V-3- Modifications post-traductionnelles Avant d'être opérationnelle, une protéine subit souvent des modifications post- traductionnelles. Elle doit tout d'abord adopter la conformation dans laquelle elle est active. Pour cela, elle est aidée par des molécules appelées chaperonnes. Il peut y avoir formation de ponts disulfure et établissement de liaisons hydrogène pour maintenir cette conformation. D'autre part, il peut y avoir ajout de molécules non protéiques, comme des lipides, des glucides ou des groupements phosphate, ainsi que de petits peptides. Il y a aussi parfois clivage d'un peptide situé à l'extrémité N- terminale, exemple enlever le peptide signal qui a dirigé la protéine non mature dans un compartiment particulier de la cellule.