PIM Biología Celular Completo PDF

PIM BIOLOGÍA CELULAR TEMA 8: NIVELES DE ORGANIZACIÓN DE LOS SERES VIVOS 0 NIVELES DE ORGANIZACIÓN La materia se organiza en diferentes niveles que se clasifican según su complejidad. De esta manera, cada nivel incluye a los inferiores y conforma un nivel más complejo comenzando de la siguiente for...

PIM BIOLOGÍA CELULAR TEMA 8: NIVELES DE ORGANIZACIÓN DE LOS SERES VIVOS 0 NIVELES DE ORGANIZACIÓN La materia se organiza en diferentes niveles que se clasifican según su complejidad. De esta manera, cada nivel incluye a los inferiores y conforma un nivel más complejo comenzando de la siguiente forma: 1 Nivel molecular: Está compuesto por átomos y moléculas, como el ADN. 2 Nivel celular: Conjunto de moléculas que forman células, como una célula muscular lisa. 3 Nivel tisular: Un tejido es un conjunto de células especializadas en la misma función y que están unidas entre sí por cantidades variables de matriz extracelular. Tejidos de vertebrados: epitelial, conectivo, muscular y nervioso. Tejidos vegetales: meristemático, epitelial, parénquima, colénquima, xilema, floema. 4 Órganos: Un órgano es una unidad funcional constituida por dos o más tejidos. Órganos de vertebrados: riñón, corazón, pulmón, hígado, testículo, ovario, etc. Órganos de vegetales: raíz, tallo, hoja, flor y fruto. 5 Aparato o sistema: Ambos son conjuntos de órganos cuyas funciones están interrelacionadas. Sin embargo, se denomina sistema a un grupo de órganos homogéneos, con un origen embrionario común (nervioso, óseo y muscular). En cambio, un aparato está conformado por órganos heterogéneos (locomotor, digestivo, respiratorio...).  Sistemas en vertebrados: urinario, digestivo, respiratorio, nervioso... Sistemas en vegetales: dérmico, fundamental y vascular 6 Organismo: Agrupación de sistemas y aparatos que conforman un ser vivo (tanto unicelulares como pluricelulares). 1 DISCIPLINAS QUE CONVERGEN EN LA BIOLOGÍA CELULAR Estas disciplinas nos sirven para aproximarnos a técnicas de distintos tipos y las diferentes técnicas nos sirven para acercarnos a la biología celular. 2 TEORÍA CELULAR BASE DE LA TEORÍA CELULAR Propuesta por Schleiden, botánico (1838) y Schwann, zoólogo (1839): 1. Todos los organismos están formados por una o más células. 2. La célula es la unidad estructural y funcional de todos los seres vivos 3. Toda célula procede de otra célula preexistente (Virchow, 1855). La teoría celular surgió gracias a los avances técnicos y a la observación de células. La teoría celular sigue dando problemas actualmente porque hay seres vivos acelulares como los virus, priones o viroides. Hoy por hoy es la que manejamos. Puede que no sea compleja o no encaje con todas las entidades vivas, pero son los paradigmas en los que nos basamos y en los que trabajamos. ANTECEDENTES DE LA TEORÍA CELULAR Primeras observaciones microscópicas: El microscopio posibilitó la observación de estructuras no visibles por el ojo humano y el desarrollo de la Teoría Celular. 1590: Los Jansen (padre e hijo) fabrican el primer microscopio rudimentario (5x). 1610: Malpighi utiliza un microscopio elemental y observa “adiposi globuli”. 1665: Robert Hooke descubre las células en una lámina de corcho (30x) y las llamó “Cells”.  1670: Antón van Leeuwenhoek observó bacterias y protistas (eucariotas unicelulares) DESARROLLO Y CONSOLIDACIÓN DE LA TEORÍA CELULAR S. XIX: Se acelera el desarrollo de la Teoría Celular gracias al perfeccionamiento de los métodos y técnicas histológicas. 1889: Santiago Ramón y Cajal consigue la aceptación definitiva de la Teoría Celular aplicable a todos los tejidos, al demostrar la individualidad de las neuronas. A partir de la tinción de Golgi, Ramón y Cajal demostró la individualidad de las neuronas y consiguió́ la aceptación de la Teoría Celular. 3 LA CÉLULA Es la unidad estructural, fisiológica y genética de los seres vivos. Podemos diferenciar dos tipos: las células procariotas y las células eucariotas. Entre ellas existen diversas diferencias entre las que se encuentran: Las células eucariotas poseen un núcleo rodeado de una doble membrana. El ADN de las células procariotas se encuentra en una zona del citoplasma llamada nucleoide. Las células eucariotas presentan orgánulos membranosos, compartimentación, y por tanto ventaja para separar procesos (pero requiere mayor gasto de energía). Las células eucariotas son más grandes y más complejas. 4 DESARROLLO DE LOS CONOCIMIENTOS EN LA BIOLOGÍA CELULAR GRACIAS AL PROGRESO Un microtomo es un instrumento de corte que permite obtener rebanadas muy finas de material, conocidas como secciones. Un microscopio simple es como una lupa. Se ve directamente a través de una lente. El microscopio compuesto tiene más de un cristal de aumento y la luz atraviesa la muestra. Los microscopios más avanzados no son más importantes que los ópticos. Cuando observamos algo en el microscopio electrónico vemos una parte muy pequeña de la célula y no tenemos contexto de lo que ocurre alrededor. Obtenemos información concreta de lo que queremos observar, pero perdemos información del resto. TEMA 9: ORIGEN Y EVOLUCIÓN CELULAR 1 HIPÓTESIS EVOLUTIVA Charles Darwin: “La vida pudo comenzar cuando algunas sustancias químicas, estimuladas por calor, luz o electricidad, reaccionaron unas con otras y se generaron complejos orgánicos de complejidad creciente” (1871) Se plantea que la vida pudo originarse cuando de forma no dirigida sin intencionalidad ninguna algunas sustancias químicas reaccionaron unas con otras y se generaron complejos orgánicos cada vez más complejos. Importante: aleatoriedad del proceso y no intencionalidad. Es contraria al creacionismo (dios como creador) y la panspermia (los organismos llegaron a la Tierra ya formados, por meteoritos). Inciso: hipótesis La hipótesis nula es aquella que yo quiero demostrar que es falsa. Si no demuestro que es falsa entonces es verdadera. Las hipótesis directas son aquellas que yo quiero demostrar que son verdaderas. La mayoría de las hipótesis en ciencia son nulas. Si yo no puedo demostrar que Dios no existe entonces tengo que considerar que existe la posibilidad de que sea cierto. 2 POSTULADOS DE LA HIPÓTESIS EVOLUTIVA SOBRE EL ORIGEN DE LA VIDA Se trata de la Teoría Oparin-Haldane: 1. La vida surgiría en las condiciones que prevalecían en la Tierra primitiva. 2. Primero se sintetizarían moléculas orgánicas simples (monómeros), que posteriormente formarían moléculas más complejas (polímeros), y estas se organizarían hasta originar células muy sencillas. 3. La vida se habría originado poco a poco, de una forma gradual y continua, tardando millones de años. Fases de la evolución biológica: 1. Formación de la Tierra 2. Síntesis de monómeros 3. Polimerización de monómeros 4. Síntesis de moléculas autor replicantes sometidas a la selección natural 5. Las membranas definieron a las primeras células 3 SÍNTESIS DE MONÓMEROS: EXPERIMENTO DE MILLER-UREY (1953) Consistía en una simulación de las condiciones que existían en la tierra primitiva. En una campana se simula el caliente océano primitivo (tenía muchos volcanes acuáticos), eso daba lugar a vapor de agua. Luego había otra campana que simulaba la atmósfera primitiva (con metano, gases, H2O, oxigeno.) y daba lugar, por ejemplo, a tormentas eléctricas. Como resultado, tuvo lugar la síntesis de moléculas sencillas (ácido cianhídrico (HCN), aldehídos...) y la síntesis de moléculas complejas (azúcares, aminoácidos, nucleótidos...). Actualmente hay algunos cuestionamientos acerca del aislamiento (podría haber contaminación) de este experimento o si el cristal que se utiliza podría haber dado lugar a los compuestos que se formaron. 4 POLIMERIZACIÓN DE MONÓMEROS A partir de monómeros se forman polímeros (se unen entres sí y dan lugar a los polímeros). 5 MÓLECULAS AUTORREPLICANTES SOMETIDAS A LA SELECCIÓN NATURAL ¿Qué fue primero? ¿Polinucleótidos de ADN o ARN autor replicantes o proteínas autor replicantes? Probablemente el ARN: ciertas moléculas pequeñas de ARN, llamadas ribozimas, actúan como enzimas que catalizan reacciones celulares, entre ellas la síntesis de moléculas de ARN. No se sabe cómo se pasó ́ de una célula basada en el ARN a las células actuales basadas en el ADN. Lo que sí se sabe es que:  ́ el - Todos los organismos vivos actuales proceden de una única célula que fue la que adquirió código genético actual. - El código genético es el mecanismo que utiliza el ADN para sintetizar proteínas. 6 LAS MEMBRANAS DEFINIERON A LAS PRIMERAS CÉLULAS En el laboratorio puedo emular las condiciones primitivas, puedo sintetizar ARN, ADN, proteínas, etc. Para crear una célula es necesario crear una membrana. Se ha demostrado que cuando las estructuras orgánicas que generan la membrana se encuentran en ambiente acuoso tienden a formar las micelas y las bicapas lipídicas (para las micelas no hacen falta fosfolípidos, pueden ser ácidos grasos). Los fosfolípidos de la membrana lipídica tienen 2 colas y una de ellas tiene múltiples insaturaciones. Esto hace que no puedan unirse en paralelo sino dando lugar a una curvatura que hace que se forme la bicapa porque termodinámicamente es la estructura más estable, aumenta la entropía del sistema. Se forma de manera espontánea. Esto sí lo sabemos, pero lo que no sabemos es cómo se crea una célula totalmente funcional con todos sus orgánulos y estructuras en coordinación. No se sabe cómo de pronto una serie de moléculas empiezan a trabajar de forma coordinada. No se puede crear una célula en el laboratorio desde 0, hay que utilizar otra célula. 7 ORIGEN EVOLUTIVO DE LAS CÉLULAS EUCARIOTAS La teoría más aceptada es el proceso de invaginación, a partir de una célula procariota. Su membrana invaginó introduciéndose hacia adentro de manera que quedaron trozos de la membrana dentro de la propia célula. Esto dio lugar a la formación del núcleo y del retículo endoplasmático. TEMA 10: DE LOS ORGANISMOS UNICELULARES A LOS PLURICELULARES 1 ORIGEN DE LOS ORGANISMOS PLURICELULARES Organismos unicelulares Colonias Organismo pluricelular Organismos unicelulares: la célula realiza todas las funciones que necesita. Colonias: están formadas por células iguales y todas realizan las mismas funciones. Organismos pluricelulares: están formados por distintos tipos de células y cada tipo realiza funciones diferentes. Volvox representa el paso hacia la pluricelularidad. Es un género de algas clorofíceas que tienen forma de esfera hueca, constituidas por 50.000 o más células. En Volvox las células se especializan: 1. Células reproductoras/germinales: poco numerosas y de gran tamaño. 2. Células somáticas: muy numerosas y pequeñas, tapizan la superficie. Son biflageladas y están unidas por uniones comunicantes, responsables de que todos los flagelos se muevan sincrónicamente. 2 ESPECIALIZACIÓN Los organismos pluricelulares presentan especialización. Esto quiere decir que están compuestos por varios tipos de células y cada tipo realiza funciones diferentes. Se trata de una especialización tanto morfológica como funcional (además de tener diferente función tienen diferente forma). La especialización es posible gracias a la capacidad de las células eucariotas de expresar su información genética de forma diferente, es decir, a su capacidad para diferenciarse. También requiere la capacidad de las células de funcionar de manera coordinada gracias a la comunicación celular. Los organismos unicelulares pueden llevar a cabo todas las funciones vitales, por lo que pueden vivir de manera aislada. En cambio, los pluricelulares no pueden vivir aislados porque tienen células que se especializan (las células especializadas no pueden vivir de forma independiente). La única función que no pierde ninguna célula es la de nutrición, las demás sí pueden perderlas. 3 DIFERENCIACIÓN CELULAR Es el proceso por el que la célula, durante el desarrollo embrionario o la vida de un organismo pluricelular, experimenta un cambio progresivo hasta adquirir la maquinaria molecular y una forma por la que se especializa en desarrollar una determinada función con alta eficacia. En el proceso se seleccionan genes para su expresión, según las enzimas y todo lo que necesite. La forma de la célula cambia, pero el material genético no, salvo excepciones (mutaciones). Conlleva una pérdida progresiva de potencialidad para formar otro tipo celular, es decir, pierde la capacidad de poder tener otras funciones para ser otro tipo celular diferente. Interviene tanto la localización de la célula como las interacciones con las células colindantes. De un tipo celular inicial obtenemos otro. 4 MADURACIÓN CELULAR Es el proceso en el que se terminan de desarrollar los orgánulos que cada célula hija necesita. De un tipo celular inmaduro obtenemos otro igual pero maduro. MADURACIÓN CELULAR EN ORGANISMOS UNICELULARES La célula progenitora se divide y da lugar a dos células hijas idénticas. Estas células no se especializan, solamente sufren un proceso de maduración. Viven de forma aislada. MADURACIÓN CELULAR EN COLONIAS La célula progenitora se divide y da lugar a dos células hijas idénticas. Estas células no se especializan, solamente sufren un proceso de maduración. Viven juntas, en asociación. MADURACIÓN CELULAR EN ORGANISMOS PLURICELULARES De células progenitoras se obtienen hijas iguales a la progenitora. Estas células hijas tienen que especializarse y para ello deben pasar por el proceso de diferenciación para silenciar y expresar los genes determinados para cada caso, llegando a ser células diferenciadas distintas tanto de la célula madre como de otras células hijas. Además, las células especializadas tienen que pasar por un proceso de maduración. Las células resultantes son dependientes entre sí, viven juntas y realizan funciones diferentes. 5 EVOLUCIÓN DE LOS ORGANISMOS PLURICELULARES Un paso clave en la especialización fue la aparición de los epitelios. El epitelio se define como la capa que separa al organismo del medio externo, reviste todo el organismo tanto por dentro como por fuera. Permite el desarrollo de varios tipos celulares y el aumento de la complejidad, aumentando también la coordinación entre ellos por el sistema nervioso. 6 CONCEPTO DE TEJIDO Tejido: conjunto de células y matriz extracelular que se organizan de una forma determinada para el desarrollo de funciones concretas. Las células de un tejido se relacionan entre sí mediante interacciones celulares directas o mediadas por la matriz extracelular. Distintos tejidos se asocian entre sí para formar los órganos Histología: ciencia que estudia los tejidos, en su estructura microscópica, desarrollo y funciones. TEMA 11: ESTUDIO DE LA ESTRUCTURA CELULAR Los microscopios son necesarios para estudiar las células. Una célula típica mide entre 10 y 100 μm. Las células son aproximadamente cinco veces más pequeñas que la menor partícula visible por el ojo humano. 1 CARACTERÍSTICAS ÓPTICAS DE LAS LENTES/OJOS PODER DE RESOLUCÓN El poder de resolución es la capacidad de un sistema de lentes de distinguir como dos imágenes independientes/separadas dos puntos que están muy próximos entre sí. Dicho de otra manera, es la capacidad que tiene la lente para diferenciar dos imágenes que son diferentes como independientes. Cuanto mayor sea el poder de resolución de un instrumento óptico, menor es la distancia existente entre dos puntos que se pueden distinguir como puntos separados. Cuanto menor sea el límite de resolución, mayor poder de resolución tiene. El poder de resolución es directamente proporcional a la calidad de la imagen. LÍMITE DE RESOLUCIÓN Es la menor distancia a la cual dos puntos pueden ser distinguibles de forma separada. Es decir, es el número a partir del cual ya no podemos diferenciar dos cosas como separadas. Cuanto menor sea el límite de resolución, mayor calidad tiene la lente, puesto que puedes diferenciar dos cosas más cercanas entre sí. α es la mitad del ángulo que se forma en el triángulo que se genera cuando observamos una muestra. Me interesa una longitud de onda muy pequeña para que el límite de resolución sea menor. Podemos distinguir dos grandes tipos de microscopios: los microscopios ópticos, que utilizan la luz como base para conseguir la imagen, y los microscopios electrónicos, que emplean electrones como base. 2 MICROSCOPIO ÓPTICO SIMPLE Se trata de la lupa o el microscopio estereoscópico. La lupa es un microscopio simple ya que posee solo una lente. Posee una lente curva (convergente) de corta distancia focal, que desvía la luz incidente de modo que se forma una imagen virtual ampliada del objeto. En el microscopio compuesto la luz atraviesa la muestra, en la lupa no. La luz tiene que rebotar en la muestra, no atravesarla. Aumenta la imagen de objetos y organismos que son visibles a simple vista. Proporciona una imagen estereoscópica (3D) de la muestra. Se utiliza para observar la morfología de las colonias, para cortar/seccionar/diseccionar un tejido para realizar un cultivo organotípico, etc. 3 MICROSCOPIO ÓPTICO COMPUESTO Aumenta la imagen de muestras biológicas que NO SON VISIBLES A SIMPLE VISTA. En este tipo de microscopios la luz atraviesa la muestra. La fuente lumínica pasa por el condensador, la luz atraviesa la muestra y luego llega a los objetivos. En este caso tenemos 3 sistemas de lente: Los oculares, que permiten una mayor magnificación.10X, 15X. El condensador, que concentra los rayos de luz sobre la muestra. El revólver con los objetivos, que magnifican la imagen. 4x, 10x, 20x, 40x, 60x y 100x. La magnificación es cuánto me aumentan las lentes el tamaño de la muestra, es decir, los aumentos totales: aumentos del objetivo x aumentos del ocular La magnificación total de una imagen fotográfica es el no de aumentos del microscopio x los aumentos de la imagen. La magnificación de la imagen se suele representar con una escala. Forma de indicar los aumentos: Signo x seguido de un número que indica los aumentos Barra de aumento con una longitud determinada que indica la correspondencia con el tamaño real. Es la forma más idónea. Características ópticas de los microscopios ópticos Poder de resolución Límite de resolución Apertura numérica. Es la capacidad del objetivo de utilizar un mayor o menor número de rayos luminosos en la formación de la imagen. Depende del semiángulo de entrada de la luz al OBJETIVO (α) y del ÍNDICE DE REFRACCIÓN DEL MEDIO (n) que existe entre el objetivo y la muestra. 3 TIPOS DE MICROSCOPIOS ÓPTICOS COMPUESTOS (LUZ VISIBLE) MICROSCOPIO ÓPTICO COMPUESTO DE CAMPO CLARO Aumenta la imagen de muestras biológicas que NO SON VISIBLES A SIMPLE VISTA. Un haz de LUZ BLANCA atraviesa la muestra. MICROSCOPIO ÓPTICO COMPUESTO INVERTIDO Los objetivos se encuentran por debajo de la platina y el sistema de iluminación está por encima de la platina. Sirve para la observación de cultivos celulares, para observar células muertas o vivas, para la observación y manipulación de gametos o embriones vivos, etc. En el microscopio óptico no podemos meter la placa con el cultivo porque choca y si separamos el objetivo pierdo límite de resolución. Por eso se utiliza este microscopio en estos casos. El microscopio invertido se utiliza muchísimo más porque se puede usar para observar cualquier muestra. Como está el objetivo por abajo nunca va a chocar con la muestra. Cuando se hace una inversión en un microscopio caro se compra el invertido porque abre más puertas. *Todos los microscopios siguientes (que utilizan la luz visible) pueden ser convencionales o invertidos. MICROSCIPIO ÓTICO COMPUESTO DE CAMPO OSCURO Posee un condensador con un filtro que deja pasar únicamente los rayos lumínicos oblicuos que llegan a la muestra. Así́, solo me permite ver el borde de mi muestra. Los objetivos reciben la luz dispersada por los diferentes componentes celulares. Aplicación: observar partículas dispersas en un medio homogéneo, preparaciones vivas (sin teñir), estudiar los bordes de las muestras, ver microorganismos con diámetro superior a 0,2 μm. Se puede ver sobre todo cuantos elementos tengo. Es muy útil para conteos de células, ya sean células muertas o vivas. También se usa mucho en inorgánica. Además, también sirve para observar/estudiar la morfología de las partículas a observar. MICROSCOPIO ÓPTICOCOMPUESTO DE CONTRASTE DE FASE Cuando la luz pasa a través de una célula viva, la que atraviesa una zona más gruesa o más densa (ej. núcleo) se retrasa y su fase queda desplazada respecto a la luz que atraviesa una zona menos densa (ej. el citosol). Las diferencias de fase se traducen en diferencias de amplitud de onda que pueden ser detectadas como diferencias de intensidad luminosa. El sistema de lentes magnifica la diferencia entre las fases de los rayos de luz que atraviesan la muestra. Aplicación: estructuras incoloras (cultivos celulares y cortes histológicos sin teñir) TRUCO DE EXAMEN: CÓMO DIFERENCIO CAMPO OSCURO DE CONTRASTE DE FASE: en la imagen de contraste de fase se ve el interior y se ve un halo alrededor de la muestra que es típico de contraste de fase. MICROSCOPIO DE INTERFERENCIA, DE COLNTRASTE DIFERENCIAÑL (DIC) O NORMASKI Su creador (Nomarski) quiso combinar el campo oscuro con el contraste de fases. Presenta dos tipos de haces luminosos: oblicuos (como el de campo oscuro) y haces que atraviesan la muestra y se retardan según la zona que atraviesan (similar a microscopio de contraste de fase). Parece que la muestra tiene volumen, relieve. Se aplica en estructuras incoloras (cultivos celulares y cortes histológicos sin teñir). MICROSCOPIO DE LUZ POLARIZADA Características de tejidos o componentes celulares: Isótropos: No producen ningún cambio en la luz polarizada. Anisótropos (birrefringentes): modifican el plano de la luz polarizada. Sustancias cristalinas o fibrosas. Imagen brillante. Consta de dos filtros polarizadores: 1) Polarizador: se encuentra en el condensador. Polariza la luz que incide sobre la muestra. Sólo deja pasar los rayos que entran en sus huecos. 2) Analizador: en el ocular. Despolariza la luz que incide en la retina. Va girando y cuando coincide con la estructura de mi célula va a pasar a través de las zonas claras y es absorbida por las zonas oscuras. Por ejemplo, sirve para ver la estructura del polen o acumulación de metales pesados en músculo. En general, estructuras ALTAMENTE organizadas. 4 TIPOS DE MICROSCOPIO ÓPTICOS (FLUORESCENCIA) Los microscopios de fluorescencia detectan moléculas autofluorescentes (fluorocromos endógenos) o moléculas acopladas a un fluorocromo. Un fluorocromo es un componente de una molécula que absorbe energía de una longitud de onda especifica y que la devuelve en otra de mayor longitud de onda (menos energía). La fluorescencia consiste en estimular una molécula (fluorocromo) con luz de una determinada longitud de onda (de absorción) y se emite luz de una longitud de onda mayor, es decir, menor energía (longitud de onda de emisión). El emisor produce la longitud de onda que estimula el fluorocromo y el detector detecta la longitud de onda que emite, que recuerdo que es diferente. MICROSCOPIO DE EPIFLUORESCENCIA La luz que se utiliza es luz ultravioleta, que se genera gracias a una lampara de mercurio. Antes de llegar a la lente del ojo hay un filtro barrera para que la luz UV no llegue a nuestro ojo. Si lo vemos azulado es que el filtro está mal y tenemos que retirar el ojo inmediatamente. Este microscopio nos permite ver interacciones que no se pueden ver con el microscopio de campo claro porque hay cosas que me estorban (solo visualizamos aquello que nos interesa, lo que hemos tenido). Esto es tanto una ventaja como una desventaja, ya que nos quedamos sin “contexto”. Las imágenes de fluorescencia tienen la ventaja de que lo que veo lo veo bien. Se ve perfectamente aquello que he marcado. A pesar de ello, no ver lo que no queremos ver nos limita la información sobre el entorno. No vemos la realidad, sino solo lo que hemos marcado, lo que queremos ver. MICROSCOPIO LÁSER CONFOCAL Está basado en un microscopio de fluorescencia y utiliza rayos láser como fuente de iluminación. Los rayos láser son rayos lumínicos que salen solo en una misma dirección. Permite la captura informática de las imágenes. El microscopio de láser confocal me ilumina desde el lado, y solo un plano de mi muestra. Se ve mucho más nítido (mayor definición y resolución) que el microscopio de fluorescencia “normal”. De una misma muestra puedo sacar imágenes de distintos planos. Los pinholes son condensadores que dejan pasar únicamente la longitud de onda que me interesa para estimular el fluorocromo. Con ellos se alcanza la nitidez característica del microscopio confocal. 5 MICROSCOPIOS ELECTRÓNICOS Existen dos tipos de microscopios electrónicos: el microscopio electrónico de transmisión y el microscopio electrónico de barrido o “scanning”. Ambos utilizan los electrones como base para obtener la imagen, pero: En el electrónico de transmisión los electrones atraviesan la muestra, mientras que en el de barrido rebotan en la muestra.  En el de transmisión la muestra está cortada en lonchas finitas y se genera una ́ cortado y se genera una imagen en 3D, imagen en 2D. En el de barrido el tejido no está pseudo-3D. MICROSCOPIO ELECTRÓNICO DE TRANSMISIÓN (MET) Podemos diferenciar dos tipos de zonas en una muestra para el MET: Zonas electro claras, a través de las cuales los electrones pasan. Zonas electrodensas, a través de las cuales los electrones no pasan. AUMENTO DE CONTRASTE Las muestras suelen procesarse para aumentar el contraste. Se añaden átomos pesados a la muestra para generar zonas electrodensas (actúan como colorantes histológicos). Suelen ser un metal en el que rebota el electrón, aumentando el contraste (al rebotar lo negro se ve más negro y lo blanco se ve más blanco). El aumento de contraste sirve para observar material particulado como microorganismos (virus, bacterias...) o fracciones celulares (orgánulos, proteínas, membranas...). Por ejemplo, se utiliza el tetróxido de osmio (O4Os), que se une a radicales cargados de las moléculas (ej. cabezas polares de fosfolípidos de membranas celulares, grupos ionizables de las proteínas). Contraste negativo: Es una técnica que consiste en llenar la superficie del tejido con metales pesados en fase líquida. Tras el secado, se forma una película sólida muy densa a los electrones. Las partículas se observan con el MET como estructuras claras (sin contraste) rodeadas de una sustancia densa. La parte blandita se llena de metales pesados. Las partes duras (proteínas) no, ya que no las atraviesan. Sombreado metálico: Teñimos las partículas en lugar de desde arriba desde el lado. Al echarlo desde el lateral se me acumulan en un lado. Permite la observación con el MET de detalles superficiales a alta resolución. Cuando hacemos la foto al haber una mayor concentración de metales pesados a un lado se produce rebote y da la sensación de sombra y volumen. Se observan objetos oscuros (partícula) junto a “sombras” (zona sin metal, claras) RÉPLICAS Consiste en obtener una copia de la superficie de una muestra. Obtención de la réplica: se vierten soluciones de plástico en la superficie y se secan. Aislamiento de la réplica: eliminación de la muestra por medios químicos. Recogida y sombreado de la réplica para la visualización en el MET. CRIOFACTURA Sirve para visualizar las superficies y el interior de las membranas celulares. Criofijación: congelación rápida con nitrógeno líquido (- 196oC) con crioprotector.  Fractura: la muestra se golpea con una cuchilla, y la línea de fractura pasará por la zonas menos resistentes. Réplica: metalización de la muestra y posterior eliminación de la muestra. Sombreado y observación con el MET. MICROSCOPIO ELCTRÓNICO DE BARRRIDO O “SCANNING” (MEB) El MEB permite visualizar tridimensionalmente la superficie de las muestras. Pongo la muestra abajo y dejo que los electrones reboten (los e que rebotan se llaman e secundarios). Para que la muestra no se llene de agujeros al recibir el impacto de los electrones se recubre de un metal, normalmente oro. TEMA 12: PROCESAMIENTO ESTÁNDAR DE MUESTRAS BIOLÓGICAS PARA MICROSCOPÍA ÓPTICA Y ELECTRÓNICA DE TRANSMISIÓN Y BARRIDO 1 PLANIFICACIÓN DE LOS MÉTODOS Y TÉCNICAS En primer lugar, es necesario considerar el tipo de proceso que se va a estudiar, que puede ser: Procesos dinámicos. Por ejemplo, la circulación de elementos dentro de una célula, la migración o la división celulares. En este caso se utilizan experimentos de localización y dinámica celular, pulso caza, BrdU, colorantes vitales, etc. Procesos estáticos. Por ejemplo, estudios morfológicos y cuantitativos, la presencia/ausencia de marcadores, etc. En este caso se puede llevar a cabo una tinción general o específica (histoquímica, inmunolocalización, hibridación in situ, autorradiografía...) Ambos tipos de procesos se pueden estudiar in vivo o post-mortem. Luego hace falta decidir el tipo de procesamiento de la muestra biológica en función del proceso a estudiar o la propia naturaleza de la muestra. Por último, para visualizar e interpretar los resultados, hay que decidir el tipo de microscopio o sistema de visualización de los resultados o la técnica de cuantificación adecuada si procede. IMPORTANTE: si queremos observar células vivas no hay que fijar, porque si fijamos nos cargamos las células. Si fijamos la muestra podemos estudiar procesos estáticos y dinámicos, pero siempre post-mortem. 2 PROCESAMIENTO DE MUESTRAS BIOLÓGICAS EN BIOLOGÍA CELULAR 1. Disección: Exposición de la muestra que yo quiero observar. 2. Fijación: Me permite preservar el tejido. Evita que se desnaturalicen proteínas, evita que haya degeneración, evita la entrada de patógenos. Evitamos la apoptosis de las células: desnaturalizamos las enzimas que llevan a la apoptosis. 3. Endurecimiento: Se hace sobre todo si tenemos que cortar. Es dar consistencia a la muestra biológica y así́ permitir la obtención de cortes histológicos. 4. Corte: Obtener secciones histológicas delgadas, para teñir o visualizar. No es siempre necesario, si hacemos microscopía de barrido no se corta. 5. Tinción: Dotar de contraste a las estructuras biológicas y marcar lo que queremos ver. No es dar color, es dar contraste. Tampoco es necesario siempre y realizaremos una tinción u otra en función de lo que queramos observar o discernir. 6. Montaje: Permitir la observación al microscopio óptico o electrónico. También sirve para preservar la muestra evitando que entren patógenos que degraden la muestra. 7. Visualización: Usar el aparataje oportuno para ver muestras muestras tras el procesamiento requerido. 3 FIJACIÓN OBJETIVOS Detener los procesos que ocurren tras la muerte celular por autolisis. La velocidad de degradación depende de la riqueza de enzimas y de la temperatura. Inmovilizar las moléculas, mediante puentes cruzados o desnaturalización, para mantenerlas tal y como estaban en la célula cuando ésta estaba viva. Preservar la composición química y la estructura original de los tejidos, de forma que muestren el mayor parecido posible a su estado in vivo. Destruir bacterias y gérmenes que pudieran encontrarse en la muestra. Dotar a la muestra de cierta consistencia. FIJACIÓN FÍSICA Fijación por calor. Se alcanzan temperaturas elevadas por aproximación a una llama u horno microondas. El objetivo es desnaturalizar las proteínas. Se utiliza calor leve, ya que si uso mucho calor me cargo la muestra porque desnaturalizo todo, mi intención solo es separar las enzimas. Es un método poco preciso que tiene baja penetración. Solo sirve para microscopía óptica. Fijación por congelación (criofijación). Consiste en una congelación rápida de la muestra. Usamos nitrógeno líquido, que está a -196oC. Detiene los procesos celulares e inmoviliza las moléculas. Se utilizan agentes crioprotectores (ej. glicerol, isopropanol...) para evitar la formación de cristales de hielo. Siempre hay que utilizar equipamiento especial porque si te cae en algún sitio se congela automáticamente y se te mueren todas las células. Sirve para microscopía óptica o biología molecular. No es lo más normal, pero se puede usar para observar exovesículas en el microscopio electrónico. FIJACIÓN QUÍMICA Es el método de fijación más efectivo y utilizado. Se utilizan compuestos químicos que poseen grupos aldehído en disolución acuosa. Son sustancias que pueden establecer puentes cruzados con las enzimas/proteínas cambiando su estructura tridimensional, lo que hace que pierdan su conformación nativa y por tanto se desnaturalicen. Se pueden modificar enzimas, lípidos y lugares antigénicos. Ambos tipos sirven tanto para microscopía óptica como microscopía electrónica. Fijación química por inmersión. Se introduce el tejido en un bote para que el compuesto vaya introduciéndose en el tejido, que está sumergido en él. Lleva un tiempo. Solo se utiliza para muestras pequeñas o muestras que tengan agua dentro para que pueda esparcirse rápidamente. No puedo meter muestras grandes porque cuando llega el fijador el músculo ya se ha degradado.  Fijación química por perfusión. Consiste en sustituir la sangre del animal por fijador, aprovechando el bombeo del corazón. Dicho de otra forma, es hacer pasar una solución fijadora a través del sistema circulatorio del animal. ¿Cómo se hace? Se le da una sobredosis de anestesia al animal. Se abre el animal, se rompe la pleura y el animal muere por muerte cerebral. Se hace un agujero en la aurícula derecha. Se introduce un tubito por la aurícula izquierda con una aguja conectada a una bomba peristáltica que introduce solución de lavado para quitar la sangre. Una vez se ha limpiado (toda la sangre ha salido por la aurícula derecha) se sustituye la solución de limpiado por solución fijadora. Cuando se ha acabado la fijación el animal queda totalmente tieso. Cuando hemos obtenido el órgano que nos hace falta se vuelve a fijar (post-fijación) por inmersión. PROPIEDADES DE LOS FIJADORES Evitar la degradación del tejido por ataque microbiológico y procesos de autolisis (enzimas lisosomales). Mantener las propiedades del tejido. Evitar distorsiones y retracciones de los tejidos. Conservar la reactividad química de los tejidos (sitio de unión del colorante, actividad enzimática, capacidad de formar complejos antígenos-anticuerpos, etc.) TIPOS DE FIJADORES Sirven tanto para inmersión como para perfusión. 1. Microscopía óptica: Formol, ácido pícrico, metanol, ácido acético, etanol, solución de Bouin (mezcla de ácido pícrico, formol y ácido acético glacial), paraformaldehido 4% (sirve para cualquier microscopio).  2. Microscopía electrónica: Paraformaldehído 16-32% y glutaraldehído (es muy necesario para muestras muy finas del microscopio de transmisión). Cuando esterilizas con alcohol la superficie de trabajo estás fijando la pared celular de las bacterias, de forma que no pueden llevar a cabo sus procesos fisiológicos. 4 ENDURECIMIENTO CONGELACIÓN Congelación lenta. Se realiza con nieve carbónica (trocitos de hielo a una temperatura muy baja) o directamente al congelador a -20ºC o a -80ºC. En los dos casos se necesita crioprotección. Necesito preparar el tejido para las temperaturas bajas, para evitar la rotura de las membranas por congelación. Se hace con azúcar, sacarosa o glucosa, mediante un gradiente de concentraciones (5% a 30%). Sirve para microscopía óptica. Congelación rápida. Se hace con nitrógeno líquido. Al congelar en nitrógeno líquido vuelvo a la muestra frágil. Por ello, no se utiliza cuando se quiere hacer un corte. Está a -196ºC. INCLUSIÓN Metemos el tejido en una sustancia para darle dureza y consistencia. Consiste en la infiltración dentro del tejido de un material líquido que por polimerización o enfriamiento se solidifica. En la inclusión estamos haciendo que la sustancia de endurecimiento entre en la muestra, por lo que hacemos un gradiente creciente, como cuando deshidratamos, para que se produzca intercambio entre la muestra y el medio y la sustancia pueda penetrar en la muestra. Inclusión en parafina La parafina es una mezcla de hidrocarburos insoluble en agua, sólida a temperatura ambiente y líquida a 60oC. Se utiliza para microscopía óptica. Le da bastante dureza (dureza media) a la muestra. Es un bloque duro, pero si lo aplastas con fuerza tiene cierta flexibilidad. La parafina implica que vamos a aumentar la temperatura, por lo que no sirve en todos los casos. En algunos casos la muestra no puede someterse a temperaturas altas porque se desnaturalizan proteínas o la muestra se estropea en general. Me permite cortar con el microtomo de parafina, dando lugar a cortes de 5-20 μm. Inclusión en resina La resina es líquida a temperatura ambiente y polimeriza con calor, es insoluble en agua y suelen ser acrílicas o epoxi. Es durísima. Sirve para el microscopio EMT Para cortarla hace falta una cuchilla de diamante porque es el único material que me permite hacer cortes muy precisos. Me da unos cortes muy muy muy delgados. Se hacen con un ultramicrotomo, genera cortes ultrafinos. Como mucho los cortes para el microscopio electrónico son de 50 nm. Cuando recogemos los cortes se recogen en rejillas de 3mm de diámetro. Hay que cuadrar la colocación del corte de manera que cuando vayamos a verlo al microscopio la rejilla no me tape la zona que me interesa. INMERSIÓN Inmersión en agarosa Dureza baja. Se utiliza para microscopía óptica. Tiene estructura de gelatina. Se usa para muestras fijadas muy muy blandas, para que no haya grandes diferencias entre el medio y la muestra a cortar. O bien para muestras vivas. El aparato que utilizo para cortar muestras inmersas en agarosa se llama vibratomo, que da lugar a cortes de 30-200 micras. El vibratomo también sirve para cortar muestras no fijadas, como cultivos. En el vibratomo el bloque de la muestra se pone en vertical, fija, y la cuchilla es la que se mueve. Los cortes se recogen en un tampón, se quedan flotando en una sustancia que permite que la muestra siga viva. Inmersión en OCT El OCT es una composición de glicoles y resinas hidrosolubles que proporcionan una matriz adecuada de la muestra para el seccionamiento del criostato en temperatura de –10 °C e inferiores. Es gel a temperatura ambiente y sólido a -20oC. Se elimina en medio acuoso. Se utiliza para el microscopio óptico. Se mete la muestra en OCT, luego se pone en hielo seco (CO2 sólido, nieve carbónica), que es muy frio, y solidifica el OCT. Cuando la muestra está congelada se utiliza un aparato llamado criostato, que además mantiene la muestra a la temperatura adecuada. Tiene un funcionamiento similar al microtomo de parafina. Permite hacer cortes muy finos, de 4 a 40 micras. 5 CORTE El objetivo del corte es obtener secciones histológicas delgadas que puedan ser atravesadas por los fotones o electrones. El aparato que se utiliza para realizar cortes histológicos es el microtomo. MICROTOMO RANVIER O DE MANO Solo para órganos vegetales MICROTOMO DE PARAFINA Se utiliza para obtener corte de material incluido en parafina. Se obtienen secciones de 5-10 micras para microscopio óptico. CRIOSTATO Se utiliza para cortar material congelado, esté fijado o no. Da lugar a cortes de 5-40 micras para microscopio óptico. La cuchilla y la muestra se encuentran en una cámara a -25ºC. VIBRATOMO Se utiliza para cortar material fijado o sin fijar (fresco). La muestra SUELE estar encastrada en gelatina, agarosa, etc. Se obtienen secciones de 30-200 micras para microscopio óptico. La cuchilla avanza con un movimiento de cizalla (vibración). ULTRAMICROTOMO Se utiliza para cortar material fijado e incluido en resina. Se obtienen cortes semifinos para el microscopio óptico (0,5-1 micras) o ultrafinos para el microscopio electrónico (50nm). La cuchilla es de vidrio o de diamante. 6 MONTAJE Sirve para preservar y conservar la muestra teñida para visualizarla al microscopio óptico. El corte histológico (que está sobre un portaobjetos) se cubre con un cubreobjetos que se adhiere con una resina sintética. Las resinas suelen ser insolubles en agua, por lo que se requiere una deshidratación del corte histológico. El medio de montaje es hidrofóbico para evitar que crezcan los microorganismos, a excepción de casos puntuales en los que sí que se necesita un medio hidrofílico (microscopía de fluorescencia; en este caso se sella la muestra después de aplicar el medio de montaje con pintauñas transparente). FROTIS Hay muestras que no requieren inclusión ni corte para su estudio, como es el caso de muestras de sangre, esputo (moco espeso), orina, lavado bronquioalveolar, etc. Consiste en extender las células en una monocapa sobre un portaobjetos, con o sin centrifugación previa. Las células quedan separadas, lo que facilita su estudio. Se fija la preparación secándola al aire y se tiñe con colorantes específicos según la naturaleza de la muestra.. TEMA 13: IDENTIFICACIÓN Y ESTUDIO DE LOS COMPONENETES CELULARES Y TISULARES A MICROSCOPIA ÓPTICA Y ELECTRÓNICA 1 TINCIONES-CONCEPTO ¿POR QUÉ SE TIÑEN LAS MUESTRAS BIOLÓGICAS? Las células, los tejidos y sus componentes son en su gran mayoría incoloros. Sólo presentan color aquellos que poseen un pigmento natural. Para estudiar las células y los tejidos se necesita poner de manifiesto las estructuras de interés. La tinción es uno de los procesos que se llevan a cabo en el procesamiento de muestras biológicas, como tejidos, para su observación al microscopio. Las técnicas de tinción se aplican a células animales y vegetales, tejidos animales y vegetales, organismos pequeños y embriones, órganos completos y cromosomas. MORDIENTE Un mordiente es una sustancia que nos ayuda a establecer un puente o modifica nuestro tejido para permitir que realmente el tinte se una al tejido. Es decir, es una sustancia que sirve para unir un colorante a un sustrato. Se utiliza cuando el colorante no es capaz por sí solo de unirse a un determinado elemento tisular. El mordiente ayuda a la formación de complejos coloreados insolubles y normalmente es un ion metálico. Por ejemplo, el ácido peryódico en la tinción con PAS. El reactivo de Schiff solo se une a grupos aldehído (formando un pigmento magenta) por lo que se utiliza el ácido peryódico como mordiente para que pueda unirse a los azúcares. El ácido peryódico reacciona con los azúcares, formando grupos aldehídos (-CHO). TINCIONES VITALES La tinción vital permite teñir células vivas sin matarlas. Por ejemplo, cuando queremos hacer estudios en cultivos celulares. Los tintes vitales se introducen en la célula por endocitosis, si la célula está muerta no va a obtener el colorante porque las células muertas no hacen endocitosis. Nos permite diferenciar las células vivas de las muertas. COLORANTES DE EXCLUSIÓN Son colorantes que sólo son incorporados por las células muertas. La membrana plasmática de las células muertas no funciona como barrera de entrada para el colorante. 2 TINCIONES GENERALES Consiste en dotar de contraste a las estructuras biológicas utilizando uno o más colorantes, que se caracterizan por unirse a ciertas moléculas presentes en células o tejidos, gracias a afinidades químicas. Son muy poco específicas y diferencian en función de la carga, según si la estructura es ácida o básica. La estructura de un colorante típico consiste en un anillo aromático (que es incoloro), un grupo llamado auxocromo que es la región por la que el colorante se une al tejido y el cromóforo que es la región que aporta el color. Los colorantes según su origen los diferenciamos en naturales o artificiales. Según su carga, los colorantes se clasifican en: Ácidos (aniónicos). Tienen carga negativa. Son basófilos, puesto que tienen afinidad por lo básico, tiñen estructuras básicas. Las estructuras básicas son catiónicas, tienen carga neta positiva, por ej. grupos amino de proteínas. Colorantes ácidos: fucsina ácida, eosina, azul de anilina, naranja G, etc. Básicos (catiónicos). Tienen carga neta positiva. Son acidófilos, puesto que tienen afinidad por lo ácido, tiñen estructuras ácidas. Las estructuras ácidas son aniónicas, tienen carga neta negativa, ej. grupos fosfatos de ADN y ARN, grupos carboxilo de proteínas, grupos sulfatos. Colorantes básicos: verde de metilo, azul de metilo, azul de toluidina, hematoxilina, etc. Neutros 3 TÉCNICAS HISTOQUÍMICAS Son moderadamente específicas. Diferencian azúcares, lípidos, proteínas o ácidos nucleicos. Me permiten diferenciar tipos de moléculas, no dentro de cada tipo. TÉCNICAS HISTOQUÍMICAS SIMPLES Detección de ácidos nucleicos o Tinción de Feulgen: tiñe específicamente el ADN, pero no el ARN. Permite cuantificar la cantidad de ADN en la célula. Detección de lípidos o Rojo Sudán: coloración de la gota lipídica de las células adiposas. o Negro Sudán: coloración de vainas de mielina de las fibras nerviosas. Detección de carbohidratos o Técnica de PAS (ácido periódico-reactivo de Schiff): el ácido periódico reacciona con los azúcares, formando grupos aldehídos (-CHO). El reactivo de Schiff se une a los aldehídos formando un pigmento magenta insoluble. o Azul alcián: tinción en azul de hidratos de carbono asociados a grupos sulfatos o carboxilos. TÉCNICAS HISTOQUÍMICAS DE LECTINAS Son más selectivas que las histoquímicas simples. Las lectinas sirven únicamente para detectar azúcares, es decir, ponen de manifiesto secuencias de azúcares. Las lectinas son proteínas incoloras de origen no inmune que proceden de plantas y reconocen y se unen específicamente a determinados residuos de azúcares de la muestra. Detectan la parte del glúcido que está más expuesta. TIPOS EJEMPLO Lectina de ricino, reconoce galactosa. Aglutinina de Limax flavus (LFA), afinidad por ácido siálico terminal. El ácido siálico está envolviendo todos los glóbulos rojos y está en el epitelio de los vasos sanguíneos. Aporta cargas negativas. Evita que los glóbulos rojos se adhieran a los epitelios y a los azúcares, para que avancen rápido y sin impedimentos. Lectina de tomate, reconoce N-acetil-galactosamina. Las lectinas son incoloras, por lo que para verlas hay que acoplarlas a un fluorocromo o a una enzima. HISTOENZIMOLOGÍA Consiste en poner de manifiesto la localización de una determinada enzima mediante la visualización de los productos derivados de su actividad. El objetivo es detectar la actividad de un enzima. Para ello sustituyo el sustrato con un sustrato adicional para que dé lugar a un producto coloreado. Detecto el enzima in situ, el que hay en el tejido. REQUISITOS DE LA TÉCNICA Evitar la inactivación de la enzima con la fijación (baja, débil, ojo con la temperatura). La fijación tiene que ser débil para evitar que la proteína se desnaturalice. No puedo hacer la inclusión en parafina porque sería someter a la enzima a temperaturas  demasiado altas. Podríamos hacer inclusión en agarosa o congelación para el endurecimiento. 4 TÉCNICAS DE INMUNOLOCALIZACIÓN Son muy específicas y sirven para diferenciar proteínas entre sí. Consisten en la detección y localización de antígenos in situ (secciones de tejido, células en cultivo, pequeños organismos u órganos) utilizando anticuerpos que reconocen específicamente dichos antígenos. Los anticuerpos se marcan utilizando una enzima (inmunocitoquímica), fluorocromo (inmunofluorescencia) o partícula de oro (inmuno-oro). La inmunolocalización se aplica en células en cultivo y tejidos, pequeños organismos y órganos, y sirve tanto para microscopía óptica como electrónica. CONCEPTOS Anticuerpo: proteína de tipo inmunoglobulina, producida por el sistema inmune, para la defensa contra antígenos que el organismo reconoce como extraños. Antígeno: cualquier sustancia que, introducida en el interior de un organismo, provoca una respuesta del sistema inmune estimulando la producción de anticuerpos. Normalmente son proteínas. Epítopo: región del antígeno que estimula la producción de un anticuerpo y que es reconocida por él. Un antígeno puede tener distintos epítopos. Para cada epítopo se une un anticuerpo diferente. ANTICUERPOS MONOCLONALES Y POLICLONALES Las células plasmáticas son los linfocitos B que dan lugar a los anticuerpos. Estas células se dividen y crean clones. Una célula plasmática da lugar a un solo tipo de anticuerpo. Podemos diferenciar dos tipos de tinciones en función del número de anticuerpos diferentes para un mismo antígeno utilicemos: Tinción con anticuerpos monoclonales: utilizo un solo clon de anticuerpo para un epítopo. Tinción con anticuerpos policlonales: utilizo varios clones de anticuerpos para varios epítopos. TÉCNICAS DIRECTAS E INDIRECTAS Técnicas directas: Se utilizan solo anticuerpos. Se lleva a cabo cuando tengo mucha cantidad de antígeno. La marca se une al anticuerpo primario. Técnicas indirectas: Se utilizan anticuerpos primarios y secundarios, para cuando no tengo mucha cantidad del antígeno y así amplificar la señal. La marca se une al anticuerpo secundario. Los anticuerpos secundarios reconocen la fracción constante de los anticuerpos primarios MARCAJE DE LOS ANTICUERPOS Para ver los anticuerpos se marcan con fluorocromo o enzimas: Inmunohistoquímica/inmunocitoquímica: Marcaje con enzima. Añado el sustrato de la enzima y produce un producto coloreado. Inmunofluorescencia: Marcaje con fluorocromo. Si quiero hacer una tinción para microscopía electrónica no puedo utilizar ni fluorocromo ni enzima, porque el tejido está demasiado dañado. Se utiliza oro porque es electrodenso y rebota los electrones. No siempre se puede utilizar la inmunolocalización en muestras para el microscopio electrónico porque las proteínas con el procesado se desnaturalizan tanto que ya no se pueden unir a los anticuerpos. PROTOCOLO ESTÁNDAR DE INMUNIHISTOQUÍMICA PARA UN ÓRGANO ANIMAL Se parte de secciones obtenidas con un microtomo de parafina. 1. Hidratación 2. Pretratamientos Podemos realizar uno, dos o los tres tratamientos si es necesario. La inhibición de la peroxidasa endógena se debe al exceso de sustrato, y solo se lleva a cabo cuando realizamos una técnica histoquímica, ya que solo entonces se emplean enzimas peroxidasas.  La permeabilización con Tritón X-100 se utiliza cuando lo que queremos detectar no ́ expuesto. está La incubación con suero normal no inmune es para evitar uniones inespecíficas. 3. Inmunomarcaje 4. Relevado 5. Controles 5 TÉCNICAS DE HIBRIDACIÓN IN SITU Son muy específicas y sirven para diferenciar ácidos nucleicos entre sí. Consiste en la identificación in situ de secuencias específicas de ADN o ARN en secciones de tejido, células en cultivo, pequeños organismos, órganos, embriones o cromosomas. Sirve tanto para microscopía óptica como para electrónica. Las técnicas de hibridación in situ se utilizan para localizar secuencias de ARN o ADN en el tejido o para averiguar si un gen que codifica X proteína da menos proteína porque hay errores en la transcripción (ARNm) o en la traducción (síntesis de proteína). SONDA Una sonda es una secuencia de ADN o ARN que se sintetiza en el laboratorio y que hibrida específicamente con la secuencia de ADN o ARN de la célula que se quiere detectar. Se crea un fragmento de ADN o ARN marcado que es complementario y se une a la secuencia complementaria, que es mi secuencia de interés. GENERACIÓN DE UNA SONDA MARCADA Tomamos una cadena de ADN o ARN igual a la que quiero identificar. Marcamos uno de los tipos de nucleótidos (por ejemplo, el uracilo) y añadimos la enzima que sintetiza la cadena complementaria. HIBRIDACIÓN DETECCIÓN DE HÍBRIDOS Los nucleótidos no se pueden marcar con fluorocromo o enzimas porque sería demasiado grande para que la enzima que coge el nucleótido para colocarlo en la cadena lo coja. El enzima no coge el nucleótido si es “raro”. Existen dos tipos de marcaje de la sonda: Marcaje isotópico Algunos nucleótidos de la sonda se marcan con un isótopo radiactivo. Tras incubar la muestra biológica en presencia de la sonda, al hibridar con su ADN, y utilizando una placa fotográfica, la radioactividad desprendida excita las sales de plata de la placa y se forma la imagen. Marcaje no isotópico La sonda se marca con un antígeno (ej. digoxigenina) que se detecta con técnicas inmunohistoquímica o con inmunofluorescencia. La digoxigenina es una molécula muy pequeña que no interfiere en la morfología o tamaño del nucleótido. No tiene color, pero existen anticuerpos contra ella. La detección consta de dos pasos: 1. Marcaje de la sonda con un antígeno (ej. digoxigenina) 2. Uso de anticuerpo para detectar la digoxigenina (inmunodetección) TEMA 14: ESTUDIO DE LA DINÁMICA CELULAR 1 ESTUDIOS DINÁMICOS Y NO DINÁMICOS ESTUDIOS NO DINÁMICOS Observamos los efectos del experimento a punto final, es decir, en un único tiempo. Implican el tipo de procesamiento de muestras biológicas que hemos estudiado en los temas anteriores (disección -> fijación -> endurecimiento -> corte -> tinción -> montaje -> visualización directa). Algunos ejemplos son: Estudiar el efecto de toxinas/medicinas. Estudiar el efecto de mutaciones dirigidas. Detectar moléculas específicas en tejido/células. ESTUDIOS DE DINÁMICA Conjunto de fenómenos que manifiestan las células y sus componentes a lo largo del tiempo. Estudiamos procesos en los que la célula no está́ muerta o estudiamos el mismo proceso en diferentes réplicas con tiempos de fijación diferentes. Ambos casos incluyen la dimensión temporal, la evolución en el tiempo, por lo que son dinámicos. Son estudios en los que queremos ver la evolución en el tiempo. Incluyen: Para diferenciar entre estudios dinámicos y no dinámicos hay que saber si tenemos que teñir solo o si tenemos que llevar a cabo alguna técnica. 2 HIBRIDACIÓN CELULAR Y FOTOBLANQUEAMINETO (PHOTOBLEACHING) Ambas técnicas se utilizan para el estudio del movimiento de moléculas en las membranas. Por ejemplo, para estudiar la fluidez, es decir, la libre difusión de lípidos y proteínas. HIBRIDACIÓN CELULAR La hibridación celular consiste en marcar las moléculas (por ejemplo, proteínas) de la membrana de una célula con un fluorocromo y las moléculas de la membrana de otra célula con otro fluorocromo diferente. Luego hibrido las células, es decir, fusiono las membranas de ambas células para que las moléculas difundan y se mezclen por toda la membrana. Sirve para observar el movimiento de las moléculas de la membrana y su fluidez. Las balsas lipídicas son agrupaciones de fosfolípidos que se mueven con cierta libertad y fluidez por la membrana. FOTOBLANQUEAMINETO (PHOTOBLEACHING) Los lípidos o las proteínas de membrana se marcan con un compuesto fluorescente. Posteriormente, se elimina la fluorescencia (rompo una pequeña parte de la membrana) en una zona determinada (blanqueamiento), irradiando con una luz intensa (rayo láser). La fluidez se mide determinando la velocidad a la que difunden las moléculas fluorescentes al área blanqueada. 3 EXPERIMENTOS DE TIME-LAPSE Consiste en la adquisición secuencial de imágenes que se observan después a gran velocidad para observar un proceso celular. Es decir, se trata de hacer fotografías de la célula en distintos tiempos y luego montar un video time-lapse. Solo sirve para células vivas. Por ejemplo, en el microscopio de contraste de fase se hace un marcaje de la célula con ordenador o un marcaje físico (enzima) y podemos ver sus cambios o su desplazamiento a lo largo del tiempo. Se utiliza para: Estudio de la dinámica de células en poblaciones: MIGRACIÓN (células previamente marcadas). Cuando las células no realizan la migración correctamente se puede deber a dos motivos: 1. Que las células que tienen que migrar estén mutadas 2. Que las células que guían el camino de las células que migran estén mutadas. Entonces, si cogemos un tejido mutado e insertamos células no mutadas podemos ver si el problema es que las células migrantes están mutadas (si las células normales son capaces de migrar) o si las células guía son las mutantes (las células normales no migran). Estudio de la dinámica de células: DIVISIÓN (células previamente marcadas) Estudio de la dinámica de orgánulos de células: ORGÁNULOS PREVIAMENTE MARCADOS 4 EXPERIMENTO DE PULSO Y CAZA El pulso es la administración, en un momento concreto (t0), de un precursor biológico o molécula marcada. La caza es la detección de la molécula marcada en otro(s) momento(s) (t1, t2, t3….) y lugar(es). TÉCNICAS ISITÓPICAS: MARCAJE RADIACTIVO O ISOTÓPICO Se emplean moléculas maduras o precursores biosintéticos marcados con un radioisótopo. Una molécula marcada radiactivamente tiene las mismas características biológicas y destino metabólico en el organismo que la molécula equivalente no marcada. Los isótopos que se utilizan más son el fósforo 32 o el hidrógeno 3 (tritio). No nos interesa tener la radiactividad durante mucho tiempo, por eso no se utilizan otros. La radiación ionizante de los radioisótopos tiene el mismo efecto sobre una emulsión fotográfica que la luz visible. ¿CÓMO SE HACE? 1. Incubación de las secciones con la molécula marcada radiactivamente (EXPERIMENTO DE PULSO Y CAZA). 2. Exposición a una película o emulsión fotográfica. Las partículas de plata de la emulsión se impresionan por las radiaciones beta emitidas en la desintegración de los radioisótopos, poniendo de manifiesto la localización de las moléculas que los contienen. TÉCNICAS NO ISOTÓPICAS: MARCAJE NO READIACTIVO O NO ISOTÓPICO Se emplean moléculas marcadas con fluorescencia o por un compuesto reconocible por tinción. La molécula marcada tiene las mismas características biológicas y destino metabólico en el organismo que la molécula equivalente no marcada. Los compuestos marcados con fluorescencia se detectan mediante fluorescencia directa o fijación y detección. Para los compuestos marcados con moléculas susceptibles de ser detectadas por tinción se realiza una técnica histoquímica o una inmunolocalización. TIPOS DE EXPERIMENTO DE PULSO Y CAZA Podemos diferenciar tres tipos de experimentos de pulso y caza: Estudio de la dinámica (síntesis y migración) de MOLÉCULAS dentro de las células Estudio de la dinámica (síntesis y migración) de ORGÁNULOS dentro de la célula Estudio de la dinámica de células en poblaciones: ESTUDIOS DE LINAJE SÍNTESIS Y MIGRACIÓN DE MOLÉCULAS Y ORGÁNULOS ¿CUÁNDO SE REALIZA EL MARCAJE ISOTÓPICO? Si estudiamos la síntesis de moléculas desde precursores. Si necesitamos resolución de MET o procesamos la muestra para MET. Si necesitamos la detección en orgánulos. Se utiliza cuando necesitamos mucha resolución, cuando necesito una resolución de MET. Por ejemplo, si queremos ver cuánto tarda una molécula en sintetizarse hasta llegar a la cisterna trans del aparato de Golgi. Los aminoácidos no se pueden marcar con fluorescencia/enzima, solo con átomos radiactivos porque si o las enzimas los discriminan (no lo usan). Por eso para estudiar la síntesis de moléculas sólo se utilizan radiactivos. ¿CUÁNDO SE REALIZA UN MARCAJE NO ISOTÓPICO? Cuando solo necesitamos ubicar la región celular pero no hace falta ver el orgánulo en alta resolución. Es un método menos peligroso. Además de utilizar enzimas o fluorocromos, se puede hacer una tinción vital. En los casos en los que no se fija, el proceso de un experimento de pulso y caza es equivalente al time-lapse porque no tengo que fijar y solo tengo que utilizar una muestra. En estos casos decimos que puede tratarse de un time-lapse o un experimento de pulso y caza. ESTUDIO DE LINAJE Consiste en el seguimiento de la descendencia de una célula utilizando un nucleótido modificado (se incorpora a la cadena de ADN durante la replicación). Conforme la célula se va dividiendo va disminuyendo la cantidad de marca (nucleótido modificado), por lo que se puede saber cuánto se ha dividido y se puede distinguir entre células madre y células hijas (las células madre tienen un marcaje más intenso que las hijas). En este tipo de experimentos no se utiliza fluorescencia. El marcaje puede ser de dos tipos: Marcaje isotópico: se realiza con timina tritiada (timina 3H). Se utiliza una película fotográfica para detectar la radiactividad. Marcaje no isotópico: se realiza con BrdU (5-bromo-2-desoxiuridina), análogo de la timina. Para detectarlo se realiza una inmunolocalización con enzima o fluorocromo. 5 CITOMETRÍA DE FLUJO Es una técnica de análisis celular que se utiliza para caracterizar o separar poblaciones celulares sin matarlas para poder hacer un cultivo posterior. Se basa en hacer pasar una suspensión de células alineadas de una en una por delante de un haz de láser. Permite detectar y separar una población celular, marcada con un fluorocromo, en una muestra en la que existen otras poblaciones celulares no marcadas. Ofrece además información de varios parámetros de cada una de las células analizadas. FUNCIONAMIENTO Antes de empezar con la técnica, es necesario incubar las células con anticuerpos marcados con fluorocromo. Estos anticuerpos son muy pequeñitos, se unen a proteínas de la membrana y no interfieren en la viabilidad de la célula. También tenemos que pasar el cultivo a suspensión. Para despegar a las células del sustrato necesitamos una enzima. El citómetro de flujo tiene un capilar, un tubo muy fino de vidrio. Es tan fino que solo pasa una célula cada vez. En la parte de abajo tengo un láser que incide sobre las células que van cayendo. Las gotitas que contienen una célula reciben una carga negativa o positiva, según sea la célula fluorescente o no. Las gotitas son desviadas mediante un campo eléctrico, en función de su carga, hacia los tubos de recogida. Las gotitas que no contengan ninguna célula o las que contengan más de una, irán a parar al contenedor residual. 6 TÉCNICAS DE CUANTIFICACIÓN E INTERPRETACIÓN Nos permiten determinar: Número de elementos: estructuras, células, etc., por unidad de superficie o volumen. Ejs: número de leucocitos en sangre. Intensidad de marcaje, por medida de densidad óptica. Volumen, área, perímetro, circularidad, etc, de células o estructuras. RÉPLICAS Implican repetir el experimento, es el número de repeticiones del experimento. Sirven para confirmar el resultado de un experimento. En todos los experimentos se realizan réplicas y normalmente se usan 5. Se realizan porque los individuos son diferentes, hay diferencias que pueden hacer que los resultados varíen. TIPOS DE MUESTREO Las cuantificaciones tienen una variable estadística importante, por lo que deben emplearse métodos apropiados. La elección del tipo de muestreo es fundamental para llevar a cabo una cuantificación correcta. A la hora de cuantificar células debemos tener en cuenta qué zona elegimos para contar. Tengo que elegir un tamaño de muestra adecuado que contenga un valor representativo de la muestra total. ESTEREOLOGÍA Utiliza métodos morfométricos para obtener información sobre estructuras tridimensionales a partir de datos de secciones histológicas, que son bidimensionales. Es un método similar al microscopio láser confocal. Las secciones histológicas muestran imágenes bidimensionales de estructuras tridimensionales. Para conocer la forma tridimensional se deben hacer reconstrucciones. Una imagen bidimensional puede dar una interpretación errónea de una estructura tridimensional. Es necesario realizar secciones seriadas consecutivas para poder interpretar la forma tridimensional de la estructura que se quiere investigar. DIFERENCIAS ENTRE CONTROL EXPERIMENTAL Y CONTROL TÉCNICO Control técnico: control para ver si el procedimiento técnico es correcto. Control experimental: control para comprobar si mis resultados son correctos, comprobarlos, etc. EJERCICIO DE CLASE Quiero ver cómo se produce la digestión de un azúcar incorporado desde el medio de cultivo en un cultivo primario de macrófagos. Necesito saber cuánto tarda la incorporación y ver en qué orgánulo se degrada. Experimento de dinámica realizado en un cultivo primario celular. Los compuestos se añaden al medio. Hay que marcar el azúcar, ya que es la molécula que se quiere seguir. Necesito ver cómo el compuesto se degrada en el orgánulo, por lo que el timelapse no serviría, se necesita un marcaje con isótopo para observar correctamente el orgánulo en el MET. Entonces, realizamos un experimento de pulso y caza. Como quiero utilizar el MET hay que fijar con glutaraldehído. Hay que procesar la muestra para utilizar el MET (endurecimiento en resina, corte en ultramicrotomo). En realidad habría que usar un control por cada tiempo de fijación, es decir, un control para cada caza para comparar. TEMA 15: TÉCNICAS DE CULTIVOS CELULARES Y ORGANOTÍPICOS 1 CULTIVOS CELULARES Y ORGANOTÍPICOS Sirven para estudiar el comportamiento de distintos organismos in vitro (puesto que antiguamente se realizaba en placas de vidrio, se dice que las células están en condiciones in vitro). CULTIVOS CELULARES Consisten en el mantenimiento de células dispersas fuera de los organismos, en situaciones controladas. Las células de partida están obtenidas de un tejido u órgano, a partir de su disgregación mecánica, enzimática o química. Dicho de otra manera, en los cultivos celulares cultivamos células, que tienen que estar separadas. CULTIVOS ORGANOTÍPICOS Consisten en el mantenimiento de órganos o tejidos en condiciones in vitro. En los cultivos organotípicos cultivamos un trozo de órgano, no separamos las células. Pueden contener 1 tipo de tejido o varios tipos de tejidos. Las células tienen que estar juntas. Cuando las células están juntas interactúan y van a coordinarse para realizar una misma función conjunta. 2 OBTENCIÓN DE LOS CULTIVOS CELULARES DE ORGANISMOS PLURICELULARES Si decimos que vamos a obtener cultivos celulares a partir de una estructura pluricelular, tenemos que seguir los siguientes pasos: 1. Disgregación celular. Es esencial si parto de un organismo pluricelular. Puede ser de dos tipos: a) Separación mecánica: se utiliza un objeto que permita físicamente separar las células. Ej. bisturí, mortero. También se pueden separar con micropipetas, cogiendo y soltando el tejido hasta que se separen las células. b) Separación enzimática: Las enzimas son proteínas que van a romper la matriz extracelular mediante colagenasa, tripsina, etc. El tiempo de actuación de las enzimas y la fuerza física que se aplica cuando vamos a separar células va a depender de la dureza de mi tejido. Es necesario tener cuidado para no romper las células. 2. Suspensión celular. Es un medio de cultivo que tiene suero salino. Recrea lo máximo posible la situación en la que se encuentra la célula en medio natural. Contiene las células que han sido separadas.  3. Cultivo primario. Es el que obtengo cuando cojo la suspensión celular y la cultivo en un medio de cultivo adaptado. Es únicamente el que yo obtengo a partir de la célula separada de mi tejido. 4. Colonización de la placa. Las células van a dividirse y van a ocupar toda la superficie de la placa. Esto depende del número de divisiones celulares. La confluencia es el porcentaje de la superficie de la placa que está ocupada por células. Cuando llegamos a un porcentaje determinado las células, estas cambian sus características, actúan diferente. 5. Disgregación celular. Cuando tenemos un porcentaje alto de confluencia (depende del tipo de cultivo, normalmente el 80%) tenemos que volver a separar las células. En este paso ya no se suele aplicar disgregación mecánica, solo enzimática. 6. Cultivo secundario. Volvemos a cultivar las células separadas. Todos los cultivos que hagamos a partir de ahora, después de volver a disgregar, se van a llamar secundarios, puesto que proceden del primario. Cada vez que repetimos el procedimiento de disgregar y cultivar, es decir, cada vez que sembramos un cultivo secundario, estamos haciendo un PASE. Los pases se cuentan desde el principio. El pase 0 es el del cultivo primario. El pase 1 es el primero del cultivo secundario, y así́ sucesivamente. Cuando separo las células que están en comunicación celular (no se dividen cuando están en tejidos) van a dividirse porque van a encontrarse “solas”. La potencialidad es el número de veces que una célula se puede dividir. Las células de estructuras pluricelulares tienen un número determinado de divisiones que pueden hacer. Las células madre son las que son capaces de dividirse más. 3 PROPIEDADES DE LAS CÉLULAS EN CULTIVO ADHERENCIA Las células se adhieren al sustrato (base de la placa o del bote). CONFLUENCIA Las células, al dividirse, ocupan toda la superficie del sustrato y cuando contactan, dejan de hacerlo, produciéndose una inhibición por contacto de la división celular. Cuando las células están en contacto entre sí, cuando empiezan a establecer contactos, tienen memoria de haber permanecido en un tejido pluricelular y va a intentar volver a comportarse como una célula diferenciada, que solo se divide cuando el tejido está roto y tienen que repararlo. Si sienten que tienen relación con otras células y no es necesario reproducirse no van a hacerlo. Las células que ya no se dividen porque sienten que están totalmente rodeadas y van a segregar factores que hacen que las células que hay alrededor tampoco se dividan, por una cuestión de competencia por los nutrientes. El porcentaje de confluencia (% de placa que hay ocupada) al que se puede llegar va a depender de cada célula, es específico del tejido. Sin embargo, se establece que a más del 80% se considera que hay un grado de inhibición por contacto de la división celular muy alto. En los cultivos de células tumorales, cuando llegan a un porcentaje determinado de confluencia, las células empiezan a crecer unas encima de otras. Se denominan células transformadas, líneas transformadas (una línea celular es el tipo de célula al que pertenece una célula). La transformación puede ocurrir de forma natural o en laboratorio. Las células tumorales tienen uno de los puntos de control del ciclo celular dañados, o bien no tienen los receptores que indican que tienen que detener el ciclo, así que se reproducen de forma indefinida. No todos los cultivos celulares dan lugar a transformación celular, solo los de aquellas líneas que tengan una mutación. SENESCENCIA Envejecimiento y muerte celular. La senescencia es el envejecimiento de la célula que lleva a la muerte. El envejecimiento se debe a que las células ya no se dividen. Las células tienen un número limitado de divisiones, incluidas las células madre. Si yo sigo sembrándolas voy a agotar la capacidad de las células para dividirse. Cuando yo las vuelvo a sembrar ya no me van a crecer, se produce la senescencia. Puede deberse al acortamiento de los telómeros cromosómicos. La potencialidad me indica el no de divisiones de la célula. Por ejemplo, si mi línea celular tiene una potencialidad de 13 pases puedo hacer 13 pases sin que cambien las características o se dé la senescencia. ¡¡¡COSAS A TENER EN CUENTA!!! De una placa de cultivo primario, cuando disgrego y vuelvo a cultivar porque ya llegó al 80% de confluencia, reparto y siembro en dos placas. En el siguiente pase siembro en tres placas. Cuando llevo 3 pases ya tengo 9 placas. No nos hacen falta tantas placas. En vez de utilizarlas todas, congelo las que no voy a usar. No las tiro por si acaso tengo contaminación en las placas que he seleccionado. Así también tengo reservas para futuros experimentos. Cuando saco un cultivo congelado lo tengo que sembrar en una placa. Solo en una placa. Cuando congelamos mueren muchas células, por lo que no podemos separar. De manera que al sembrar después de descongelar no hay amplificación del número de células. Masa crítica: no mínimo de células que tengo que sembrar para que el cultivo salga adelante. Los factores de crecimiento que emiten las células al crecer no son suficientes si el no de células no es el adecuado. La masa crítica depende exclusivamente del tipo de célula. Lo normal es que una célula conforme se diferencia y especializa pierda su capacidad de división, a no ser que su función sea dividirse. La diferenciación celular y la proliferación celular son dos vías diferentes. Lo normal es que las células que no son células madres se dividan poco, es decir, tienen una potencialidad baja. La potencialidad es el no de veces que puedo hacer pases. A partir de ese momento las células envejecen y mueren, es decir, se produce la senescencia. EJERCICIO Tengo en cultivo una línea celular procedente de progenitores de osteoblastos (células inmaduras del hueso). Tengo una placa en pase 3 y tengo una placa en pase 5. a) Tengo demasiadas células y quiero congelar una de las dos placas para futuros experimentos. Mi experimento lo tengo que hacer a pase 10. La potencialidad de mi línea celular se mantiene hasta pase 12. ¿Cuál de los dos pases es más conveniente congelar? Razona tu respuesta. 1. Decir si el experimento es o no viable. 2. Ventajas e inconvenientes del pase 3 3. Ventajas e inconvenientes del pase 5 El experimento es viable porque se realiza en el pase 10 y tiene potencialidad hasta el pase 12. Cuando decidimos congelar un pase más viejo (más pases), el arranque va a ser más ineficiente y se producirá́ mayor muerte celular. El crecimiento va a ser más lento. Si utilizamos la de pase 5 está más cerca del pase 10 y tendríamos que hacer menos pases. A pesar del inconveniente anterior se utilizaría la del pase 5 porque se tarda menos tiempo en alcanzar el pase 10 y normalmente nos dan un plazo de tiempo concreto para el experimento. Es más importante la velocidad. Además, en la fase 5 hay más células y conviene más porque podemos congelar y utilizar más células. b) Si el cultivo es de la bacteria intestinal de E. Coli, ¿su respuesta sería la misma? Daría lo mismo, porque E.Coli, al ser una bacteria, no tiene límite de divisiones. 4 OBTENCIÓN DE CULTIVOS CELULARES DE ORGANISMOS UNICELULARES El proceso es parecido al de los pluricelulares, pero sin algunos de los pasos. Los organismos unicelulares no tienen el proceso de envejecimiento celular y no pierden la capacidad de división. Por ello, el concepto de cultivo primario y secundario y pase no tiene sentido. Podemos mantener cultivos de organismos unicelulares para siempre prácticamente porque cuando las células se dividen dan lugar a dos células totalmente nuevas. No obstante, sí existe una cierta inhibición de contacto por competir con el medio. ́ : la Por tanto, cuando obtenemos cultivos celulares de organismos unicelulares se dará adherencia SÍ, la confluencia SÍ, la senescencia NO, inhibición por contacto SÍ, la transformación NO, líneas celulares NO. 5 OBTENCIÓN DE CULTIVOS ORGANOTÍPICOS Consiste en el mantenimiento de órganos o tejidos en condiciones in vitro. No se utiliza ningún tipo de disgregación. Desventajas: cada vez que quieres reproducir el cultivo se tiene que sacrificar a un animal, es más costoso y estos se degradan más rápido. Ventajas: aquí́ las células sí mantienen las mismas condiciones fisiológicas, no como ocurría en cultivos celulares que no se mantienen. PROCEDIMIENTO 1. Aislamiento y disección del órgano de partida. 2. Corte o disección de la porción a cultivar. Todas las células tienen que estar en contacto con el medio de cultivo puesto que tienen que obtener nutrientes de él. No es lo mismo que cuando el órgano está en el cuerpo y le llegan los nutrientes por el sistema circulatorio. Para cortar la porción utilizamos una cuchilla que vibra, un vibratomo. No puedo fijar un cultivo porque yo lo que quiero ver es el proceso que ocurre por eso no lo puedo fijar, necesito que el tejido esté vivo y se pueda dividir. Ahora bien, cuando el experimento finalice sí lo puedo fijar. 3. Cultivo. Coloco unas membranas para cultivo. Es como una malla de un colador en la que pongo el tejido encima y está en contacto con el medio. El “colador” lo introduzco en la placa, por eso está en contacto con el medio de cultivo. La membrana permite que este tejido no esté flotando y moviéndose, sin que se disgreguen las células, simulando el estado en el que se encuentran in vivo. 4. Cultivo combinado. Una vez tenemos el cultivo así podemos combinarlo con un cultivo celular. Puedo marcar células obtenidas por otros métodos e introducirlas en el medio. Sirve para probar tratamientos, por ejemplo. Y reducir de esta manera la experimentación en animales (se matan menos animales). 6 VENTAJAS E INCONVENIENTES DE CULTIVOS CELULARES Y ORGANOTÍPICOS VENTJAS Control de las condiciones fisicoquímicas (pH, temperatura, presión osmótica, saturación de O2 y CO2) y fisiológicas (nutrientes, metabolitos, hormonas,etc.) La muestra es homogénea Ventajas éticas (no uso de animales) INCONVENIENTES Contaminaciones (asepsia). Se necesitan conocer bien las condiciones adecuadas para cada tipo celular. Costes elevados. Se eliminan las influencias in vivo (relaciones celulares, controles nervioso y hormonal) 7 CULTIVOS DE ORGANOIDES Consisten en crear un órgano a partir de células en una placa de Petri, es decir, in vitro. Parto de células y genero un órgano, es decir, partimos de un cultivo primario. Para llevar a cabo este proceso necesitamos células madre. Las únicas células madre que pueden producir todo tipo de célula son las del embrión, las que forman el embrión. Las pluripotenciales no pueden dar lugar a todos los tipos de células. Como no se pueden utilizar células madre embrionarias en investigación por temas éticos, se utilizan células madre inducidas, que son células diferenciadas a las cuales se le añaden determinadas sustancias químicas en el medio para producir una desdiferenciación. La desdiferenciación es el proceso por el cual genero una célula no diferenciada a partir de una célula diferenciada. Estas células madre artificiales se denominan iPS. No todas las células diferenciadas tienen el mismo potencial para transformarse en células madre. Los fibroblastos tienen potencial alto para desdiferenciarse. A partir de esas células madre inducidas, introduciendo factores que hacen que se diferencien, se obtienen las células diferenciadas que forman tejidos. Cuando ya tengo la célula madre artificial puedo “ordenarle” que se diferencie en la célula específica que necesito. El proceso por el cual desdiferenció y reprogramo las células para transformarlas en iPS se llama reprogramación. CÉLULAS MADRE: DIVISIÓN Y POTENCIALIDAD Cuando una célula madre se divide puede producir 2 tipos de divisiones: división simétrica (dos células madre totipotenciales) o división asimétrica (una célula madre totipotencial y otra célula con menor potencialidad, que puede dar lugar a menos tipos de células). Las células madres totalmente totipotentes o totipotenciales son las embrionarias, las del embrión. A partir de ahí́ se van a producir células con menor potencialidad. La potencialidad de una célula madre es cuántos tipos celulares puede producir. Una célula madre unipotente viene de una célula madre multipotente que viene de una célula madre pluripotente que viene de una célula madre totipotente. Los cultivos de organoides son muy recientes y no se suelen utilizar para estudiar el funcionamiento, sino mayoritariamente la estructura. Tampoco se pueden crear órganos demasiado complejos. 8 EQUIPAMIENTO PARA CULTIVOS CELULARES MEDIOS Solución con los nutrientes necesarios para permitir el crecimiento de células aisladas. Deben estar tamponados o isotónicos. Contienen un indicador de pH. Se suplementan con antibióticos, sueros sanguíneos, hormonas, moléculas de adhesión, etc. Para acabar con un tumor se elimina el aporte de azúcares para reducir la división de las células tumorales. Siempre intentamos que el pH sea óptimo para las células, normalmente 7. Hay algunas células que crecen mejor a pH más ácidos. También se suelen crear ambientes artificiales ácidos para recrear un ambiente de infección (?) Se utiliza rojo fenol para ver si hay un crecimiento anormal que libera productos de desecho o una contaminación por bacterias u otros microorganismos patógenos. El indicador puede detectar un pH demasiado ácido o básico, que indica contaminación, senescencia, o fallo en la concentración de CO2. Con solo ver el cultivo se puede apreciar si hay alguna contaminación o no. Se suele ver rojo , por lo que, si se ve naranja o amarillo se pude tirar, ya que estaría contaminado. Si se ve rosa se puede arreglar, pues significa que hay un fallo de concentración de CO2 o que hay contaminación de hongos. SUSTRATOS La mayoría de las líneas celulares que vamos a usar necesitan sustrato para adherirse. Los sustratos actúan muchas veces como matriz extracelular para las células y así facilitar la unión. Los frascos de cultivo se utilizan para células madre. ESTERILIDAD Se tiene que trabajar en condiciones de asepsia, todo lo que mis células vayan a tocar debe estar esterilizado. Para eso está la cámara de flujo laminar, la cual filtra el aire y mantiene la asepsia. Con cultivos pluricelulares siempre se utilizan cámaras de flujo laminar para garantizar la esterilidad. EQUIPAMIENTO Microscopio invertido. Incubador de CO2: Mantiene el cultivo en las condiciones adecuadas de T y presión de CO2 con una humedad elevada para evitar la evaporización del medio de cultivo. Contador de células: Puede ser manual (hemocitómetro, cámara de Neubauer) o automático (electrónico). TEMA 16: CÉLULAS Y ORGANISMOS COMO MODELOS EXPERIMENTALES 0 INTRODUCCIÓN Las propiedades fundamentales de todas las células se han conservado durante la evolución. Los principios básicos obtenidos de los experimentos desarrollados en un tipo celular son generalmente aplicables a otras células. Cuando no usamos cultivos celulares tenemos que saber qué organismo modelo utilizar. Esto va a depender de la pregunta que se nos formula. Los modelos que se utilizan son organismos animales, vegetales, hongos, bacterias, etc. que nos permitan responder preguntas generales del campo de estudio que estemos utilizando. Si intentas estudiar el gen de un gusano (que solo se expresa en ese gusano) no te van a dar apoyo, tienes que usar un organismo modelo. REQUISITOS DE LOS MODELOS EXPERIMENTALES Obtención y mantenimiento fácil del modelo. Disponibilidad de sus secuencia genómica Universalidad de los resultados obtenidos con el modelo. Modelo muy usado y conocido por la comunidad científica. 1 MODELOS EXPERIMENTALES EN BIOLOGÍA CELULAR Procariotas :Escherichia coli Eucariotas unicelulares: Levaduras Eucariotas pluricelulares (plantas): Arabidopsis thaliana y Populussp.(chopo) Eucariotas pluricelulares (animales): Mosca de la fruta (sobre todo para estudios genéticos), Rana (presencia de huevos grandes, se modifican los huevos), Pez cebra (modelo esencial en el desarrollo del sistema nervioso humano), Ratón y rata. RATÓN Y RATA Prototipo de modelo de ensayos clínicos (fármacos, interacciones, toxinas...). También se utilizan el gato, el perro, el mono, la zarigüeya o la cobaya. Fácil reproducción y mantenimiento.Se reproducen con mucha facilidad y dan lugar a un gran número de crías. El periodo de gestación del ratón es muy corto, dura 18 días. Gran homología con el ser humano. Obtención de modelos de enfermedades humanas. Obtención de animales modificados genéticamente. Se usa más el ratón que la rata. Esto es porque los mutantes y transgénicos son muy difíciles de generar en rata (la nutación inducida en rata es muy difícil de conseguir). ASPECTOS FUNDAMENTALES DE LA BIOLOGÍA MOLECULAR, GENÉTICA Y BIOLOGÍA CELULAR Desarrollo de tejidos corporales.  Sistema inmune de mamíferos. Formación y función del cerebro y del sistema nervioso. Modelos de enfermedades humanas Regulación génica y herencia. Enfermedades infecciosas. 2 MODIFICACIONES DE ORGANISMOS PARA LA OBTENCIÓN DE MODELOS MUTANTES Un mutante es un organismo con un cambio o alteración (espontáneas o inducidas, no de forma artificial) en su información genética. La mutación puede ser natural, la evolución se basa en la mutación espontánea,o bien inducida. Los animales con mutación inducida se denominan quimeras. TRANSGÉNICOS Un organismo transgénico es un organismo modificado genéticamente (OMG). Se introduce o modifica un gen de interés, de forma artificial. Todo lo que se ha modificado genéticamente son herramientas de laboratorio. Los CRISPR dan lugar a organismos transgénicos puesto que se introducen secuencias génicas en el organismo KNOCKOUT Se trata de un organismo modificado genéticamente para eliminar o silenciar un gen concreto. 3 ASPECTOS ÉTICOS DE LA INVESTIGACIÓN CON ANIMALES Principio de las tres erres REEMPLAZO (replace): evitar o sustituir el uso de animales cuando sea posible (modelos informáticos, cultivos celulares, animales con menor percepción del dolor, etc.). Si puedo utilizar otro sistema que no sea animal tengo que usarlo. REDUCCÓN (reduce): usar el menor número de animales para obtener datos que respondan al problema biológico a resolver, o maximizar la información obtenida por animal. REFINAMIENTO (refine): modificar los protocolos y procedimientos para minimizar el dolor y la angustia, así como mejorar el bienestar de los animales utilizados en ciencia desde su nacimiento hasta su muerte. En definitiva, intentar que el animal sufra lo menos posible.