Módulo 8 Biot 6230_Operaciones upstream PDF

Módulo 8: Las operaciones “upstream” en los bioprocesos BIOT 6230 Descripción del módulo • Este módulo número 8, es uno más extenso que anteriores, y que ya aborda de forma específica el tema de los procesos “upstream”, o más bien del cultivo de células como parte de los bioprocesos industriales....

Módulo 8: Las operaciones “upstream” en los bioprocesos BIOT 6230 Descripción del módulo • Este módulo número 8, es uno más extenso que anteriores, y que ya aborda de forma específica el tema de los procesos “upstream”, o más bien del cultivo de células como parte de los bioprocesos industriales. • Si han tenido experiencia tomando cursos en el área de Biotecnología, recordarán que estas etapas son las iniciales en el proceso para lograr que la línea celular productora pueda ser generada y pueda crecer en suficiente número dadas unas condiciones de cultivo óptimas. – El objetivo de estas etapas “upstream” o corriente arriba (etapas iniciales de proceso) es lograr que la célula productora genere la molécula o sustancia de interés en un biorreactor. • Las etapas “upstream” incluyen o se enfocan mayormente en tres elementos fundamentales: la línea celular, el medio de cultivo y el biorreactor, así como las condiciones del cultivo. Pretender abarcar todos los detalles relativos a las operaciones “upstream” en este Módulo no es posible. No obstante, el objetivo del mismo es que puedan conocer y evaluar los componentes principales del proceso “upstream”, que entiendan sus objetivos, y que analicen cómo estas etapas son parte integral de los bioprocesos comerciales. 2 Objetivos del módulo 8 • Identificar los componentes esenciales de la operación “upstream” • Explicar la importancia de las operaciones “upstream” para el éxito de los bioprocesos comerciales. • Describir el proceso de generación de una línea celular. • Explicar lo que es el API. • Evaluar la importancia de la línea celular en un bioproceso. • Explicar qué es el Master Cell Bank. • Describir cómo se obtiene el Master Cell Bank • Explicar qué es el Working Cell Bank • Diferenciar de forma correcta el MCB y el WCB • Describir la utilidad, y explicar la importancia de los medios de cultivo para células. • Diferenciar CIP de SIP y explicar por qué se utilizan • Describir qué es el proceso de “scale-up” • Explicar el rol de un biorreactor o fermentador en las etapas “upstream”. 3 Objetivos del Módulo 8 (continuación) • Describir la utilidad de las partes principales de un biorreactor. • Describir los biorreactores y explicar la importancia de los mismos en los bioprocesos. • Argumentar sobre la eficacia de materiales desechables en los bioprocesos actuales. • Especificar los parámetros que tienen que ser analizados en los procesos de cultivos celulares. • Diferenciar los modos de operación en los que funcionan los biorreactores. 4 Introducción • Un elemento esencial en los bioprocesos es las operaciones “upstream”. Las operaciones “upstream” son las iniciales o las que fomentan la generación de la molécula o sustancia de interés. • “Upstream” incluye tres elementos esenciales: – La línea celular – El medio de cultivo necesario para las células – El biorreactor y las condiciones de cultivo. • En este tema del curso se describirá de forma general los componentes y procesos relacionados a las operaciones “upstream”. 5 Las operaciones “upstream” son aquellas que permiten crear el ambiente necesario para que las células productoras generen la molécula de interés. Esos procesos en su desarrollo requieren la generación cuidadosa de la línea celular productora en las etapas de investigación, así como de su medio de cultivo idóneo, y de las condiciones de cultivo. “Upstream” Los procesos relacionados a las etapas que comprenden la fase “upstream” en la producción, son muy abarcadores. En este módulo del curso no se van a poder a cubrir todos de manera específica, sin embargo, en el mismo, se va a repasar los componentes del procesamiento “upstream” y se enfatizará en los puntos principales de estas operaciones en los bioprocesos. 6 Etapas “Upstream” • A nivel de biomanufactura, “upstream” incluye las unidades operacionales que facilitan el que las células productoras crezcan de forma adecuada, libres de contaminantes, y en unas condiciones óptimas dentro de un contenedor especializado. • Las células que se utilizan como líneas productoras pueden ser bacterias, en cuyo caso el contenedor utilizado para el crecimiento es denominado fermentador, o pueden ser células eucariotas (mayormente células de mamífero) en cuyo caso dichos contenedores se identifican como biorreactores. 7 Los Componentes esenciales de las etapas “upstream” Línea celular Medio de cultivo Fermentador/Biorreactor 8 Las etapas “upstream” • Como hemos visto en el tema inicial del curso, existen distintos tipos de bioprocesos que se llevan a nivel de producción industrial. El más complejo, sin embargo, es el que se enfoca en proteínas recombinantes, porque requiere de una intervención e investigación minuciosa y prolongada antes de lograr establecer el bioproceso comercial. • Otros productos son generados por unos bioprocesos tal vez con menos exigencias regulatorias, sin embargo, todos requieren buena planificación, investigación, validación y evaluación. • Así que el componente central de un bioproceso en etapas “upstream” es la célula productora. La célula se tiene que desarrollar desde que el equipo de R & D está diseñando los bioprocesos comerciales, en las etapas anteriores a las pruebas (proceso de desarrollo de productos), es decir, desde antes de que comiencen las etapas preclínicas ya se hace el diseño de estas operaciones. 9 La línea celular • La línea celular es el centro del bioproceso. Esta es la célula que va a tener las características necesarias para generar la molécula esencial del bioproceso, sea el que sea. • Por lo general, esta línea productora tiene unas modificaciones genéticas que pueden ser inducidas por aspectos naturales (células con mutaciones espontáneas), o lo que ocurre más comúnmente, por modificaciones inducidas en el laboratorio (por técnicas biotecnológicas). • Dependiendo del tipo de producto en que nos enfoquemos, las células productoras reciben más o menos manipulaciones genéticas. Aquellas líneas celulares de las que se obtienen productos biofarmacéuticos recombinantes, por lo general, son las que más manipulaciones genéticas experimentan. – Un concepto importante en la biomanufactura de productos terapéuticos es que la molécula de interés (la que tiene el efecto terapéutico) se denomina en inglés “Active Pharmaceutical Ingredient” o simplemente API (Es común ver el concepto bioprocesos API-es decir, aquellos que se enfocan en generar un producto o ingrediente activo con fines terapéuticos). – Ingrediente activo 10 Línea celular productora Existen unos requisitos claves que toda industria mantiene en perspectiva a la hora de establecer su línea productora. Lo inicial es tener una idea de cuál va a ser el producto o la molécula a generar. Luego, es necesario identificar qué modelo celular sería el ideal para lograr obtener dicha sustancia o molécula. Finalmente, se establece qué tipo de condiciones son las ideales para que la célula seleccionada pueda generar de forma efectiva la molécula interesada. En la etapa de diseño de la línea celular, interviene un equipo multidisciplinario que tiene el objetivo de lograr crear la línea celular productora con las características idóneas. 11 Selección de la línea celular productora • Para seleccionar la línea celular existen unos puntos claves que no importa cuál va a ser el bioproceso, se tienen que considerar por toda compañía. • Aun cuando los criterios finales son establecidos por el tipo de producto y el tipo de célula requerida, casi todas las industrias consideran los siguientes puntos claves al momento de seleccionar su línea celular productora: – Tiene que ser genéticamente y fisiológicamente estable (¿por qué creen que eso es importante?) – Debe crecer de una forma rápida y vigorosa. – Tiene que producir la sustancia de interés en el menor tiempo posible. – Tiene que estar disponible en cultivo puro (y debe ser caracterizada de forma efectiva). – Sus productos metabólicos de desecho no deben ser tóxicos, ni tampoco la célula debe generar demasiadas impurezas en el medio de cultivo en el que crece. (¿Por qué?) – Debe ser razonablemente resistente a condiciones difíciles (claro está, eso es más fácil para líneas celulares procariotas que para células de mamífero). 12 Otras características deseadas de la línea celular productora Deben crecer y generar la molécula de interés efectivamente a mayores escalas de producción. Debe ser manipulable ( eso es importante para permitir mejoras--tanto genética como fisiológicamente manipulables.) Deben crecer en un medio relativamente simple en el que no se tengan que añadir demasiados componentes exógenos. No debe presentar riesgos al ser humano. La recuperación de sus productos debe ser lo más fácil posible. 13 La línea celular productora • Se desarrolla y se selecciona en las etapas iniciales de investigación (R & D). • Requiere de una intervención multidisciplinaria. • Si es una línea celular recombinante, requiere de manipulaciones genéticas y desarrollo molecular de la misma (eso es mayormente para productos terapéuticos). Se utiliza la tecnología del DNA recombinante para obtener una línea celular que genera la molécula de interés. Por lo general, este tipo de líneas celulares son muy costosas ya que requieren mucho tiempo de diseño, manipulación, optimización, caracterización y desarrollo final. – La inversión es mayor • Así que en este proceso se depende de muchas técnicas genético-moleculares con las que ustedes deben estar familiarizados, incluyendo: – Secuenciación, análisis bioinformático, PCR, clonación molecular, análisis de restricción enzimática, transfecciones, análisis proteómico, entre muchas otras. 14 La naturaleza de la línea celular productora puede ser (dependiendo del bioproceso): Células de mamífero (una de las más usadas) Bacterias Hongos Otras células animales Células vegetales 15 Visión general del desarrollo de la línea celular para productos recombinantes Identificación del gen de interés (el que codifica para la molécula de interés): Conlleva: Análisis bioinformáticos, modelajes de ingeniería, diseño de los sistemas y de las estrategias moleculares Selección del sistema de clonación: Desarrollo del vector adecuado que contenga el gen de interés; luego clonación Selección del sistema de expresión y transfección: Transfecciones estables. El sistema tiene que expresar el API deseado 16 Desarrollo de la línea celular • Este proceso requiere conocer de forma efectiva los componentes de regulación genética y llevar a cabo manipulaciones genéticas específicas. • Requiere, además, conocer las secuencias de los genes deseados, y promover la clonación de dichos genes en vectores apropiados. • Igualmente es requerido el desarrollo del sistema de expresión. – Es necesaria la generación de vectores de expresión adecuados, con promotores fuertes y con sistemas de genes reporteros adecuados. • Este tipo de sistemas de expresión puede ser variado según el producto (procariotas; eucariotas). • Finalmente, la línea celular a la que se le inserta el gen recombinante tiene que tener las características deseadas para ser una línea productora (las que fueron mencionadas en diapositivas previas). 17 Esquema general de la creación de una línea celular productora http://www.detaibio.com/en/cell-line-development.html 18 Lectura recomendada • http://www.americanpharmaceuticalreview.com/FeaturedArticles/140494-Technology-Improvements-to-Accelerate-ProcessDevelopment-of-Biologics/ 19 El establecimiento de la línea celular productora • Una vez que una línea celular ha sido evaluada exhaustivamente, si cumple con los objetivos de la compañía, entonces pasa a ser la línea celular final. Esta línea celular es la que va a tener la capacidad de generar las moléculas de interés que serán distribuidas eventualmente al mercado. • Es importante establecer que una vez esta línea celular es finalizada y la FDA o cualquier agencia reguladora pertinente aprueban el bioproceso comercial, la compañía dedica estrategias estrictas en la preservación y en el mantenimiento de dicha célula. • Hay dos conceptos importantes cuando nos enfocamos en las líneas celulares para bioprocesos comerciales (sin importar cuál sea el mismo): – Banco maestro de células (“master cell bank”) – Banco de células de trabajo (“working cell bank”) 20 El “Master Cell Bank” (MCB) • Es la línea celular inicial o la que sale de la primera construcción, es decir, es la que resulta de la célula original que fue obtenida por el trabajo de diseño, clonación y de transfección. – Es un “stock” de la célula original. Es la que más valor económico tiene. – Recuerden que el desarrollo de la línea celular productora requiere una inversión económica elevada. • Un Banco de células: se refiere a las células que tienen una composición uniforme y que se almacenan bajo unas condiciones bien definidas. • Así que, en resumen, el MCB se deriva de la cepa inicial que tiene las modificaciones deseadas finales (cepa productora ya definida, caracterizada y pura) que van a permitir la generación de la proteína o molécula de interés. • Una vez desarrollada la línea celular, entonces se hacen múltiples alícuotas que son las que van a formar ese banco MCB. Con el establecimiento del MCB se garantiza que siempre va a quedar un “stock” con las células originales, es decir, éstas no van a ser agotadas. • Hay estándares para la generación del MCB que pueden ser encontrados en el CFR 21 Parte 610. 21 Caracterización del banco maestro de células Se realizan pruebas para confirmar: Identidad (expresión del constructo desarrollado) Pureza (verificar presencia de posibles contaminantes) Estabilidad genética (mayormente de la región codificante que incluye el gen de interés) Estas pruebas son realizadas como parte de la recopilación de data que es sometida a las agencias reguladoras antes de que éstas últimas autoricen la producción. 22 El banco maestro (“Master cell bank”) • Este se localiza en el llamado cuarto Dewar dentro de las facilidades de la compañía. • El Dewar (en honor a James Dewar) es el nombre que se le brinda a un recipiente especializado el cual provee las condiciones adecuadas para mantener las células productoras preservadas (en nitrógeno líquido), bajo unas condiciones de alta estabilidad. – Es a lo que comúnmente llamamos tanque de nitrógeno líquido • Este banco de células es sumamente valioso para cada compañía, por lo tanto, las facilidades donde se mantiene el banco maestro de células tienen unos estrictos niveles de seguridad y unas condiciones donde se brindan los mejores parámetros para el mantenimiento de esas células. https://mvebio.com/aluminum-dewars/mve-lab-series/ 23 La línea celular maestra (MCB) y la línea celular de trabajo (WCB) • Es importante mencionar que cuando el bioproceso comercial es llevado a cabo, el MCB no es e vial que va a estar directamente sembrado en el biorreactor o fermentador (según sea el caso). • Lo que hacen las compañías es que generan un banco de células adicional que sale del MCB y que se denomina el “Working Cell Bank” (WCB)-la línea celular de trabajo. – Ese WCB es el que se utiliza para la producción de cada ciclo de generación del producto a nivel comercial. • Así que el WCB sale de las alícuotas del MCB. Ese proceso es uno cuidadoso y requiere de operaciones estandarizadas. • La idea de tener un banco de trabajo es que el banco maestro no se agote, ni se manipule exageradamente. Así que de las alícuotas que salen del MCB salen los viales del WCB, que es el que se usa en cada lote de producción. 24 Así que, en resumen, el working cell bank: Se establece para que el banco maestro no se agote. El banco de células de trabajo Se genera un banco de células para el trabajo para cada bioproceso comercial (cada ciclo de producción). Este banco se deriva del banco maestro. Existe un protocolo cuidadoso en el que los bancos de trabajo (WCB) se van generando de forma planificada, y con el objetivo de que el banco maestro no se agote. 25 Esquema que presenta el desarrollo de la línea de trabajo a partir del banco maestro de células. Dutton, R.L. & Scharer, J.M., 2007. Advance technologies in biopharmaceutical processing. United Sates of America: Blackwell Publishing. 26 Esquema de resumen de la obtención del MCB y del WCB Generación del MCB Original cell line Generación del WCB Nitrógeno líquido https://mastercellbank.com/bio-technology/master-cell-banking 27 El medio de cultivo para la línea celular • Ya vimos el primer elemento esencial de “upstream” que es la célula productora. Ahora vamos a ver otro de los elementos esenciales en la etapa “upstream” de los bioprocesos comerciales que son los medios de crecimiento para esas células productoras. • Repaso: ¿Qué es y para qué se usa un medio de cultivo? • El medio de cultivo es cuidadosamente confeccionado de manera tal que se ajuste a los requisitos específicos de la línea celular productora. • Este tipo de medios puede variar según sea la línea celular. Es importante enfatizar que los medios de cultivo tienen una importancia considerable para el éxito del bioproceso. Sin esa materia prima adecuada, las células no pueden generar el producto deseado. – Así que cada compañía también dedica mucho tiempo en el diseño y en la evaluación del medio de cultivo para las células. 28 El medio de cultivo • Es extremadamente importante porque contiene el balance de nutrientes idóneo según la línea celular • Se confecciona una vez se tiene la línea celular • Se evalúa su efectividad y se optimiza • Es tratado de forma cuidadosa y se garantiza su asepsia para evitar contaminaciones en el proceso 29 El medio de cultivo para la línea celular Típicamente todos los medios contienen: •Fuente de carbohidratos y de energía •Fuente de nitrógeno para aminoácidos y otras macromoléculas •Ácidos grasos Dependiendo de la célula utilizada, entonces los medios pueden tener suplementos: •Factores de crecimiento específicos •Colesterol •Oligonutrientes •Sales •Amortiguadores •Otros Obtenido de: www.jgc.com 30 El medio de cultivo para la línea celular • El objetivo principal del medio de cultivo es que la línea celular produzca la molécula de interés de forma óptima sin la generación de muchos desechos. • Los medios tienen que brindar buenas fuentes de carbono, nitrógeno, factores de crecimiento, deben también suplir los requisitos energéticos, deben promover un balance osmótico, y minimizar eventos de contaminación o de toxicidad para las células. • Típicamente los medios usados para bacterias y para hongos son relativamente sencillos y menos costosos que aquellos medios necesarios para células eucariotas, en especial las células de mamífero (son más complejos y costosos). • Los medios de cultivo también se diseñan en las etapas de investigación, una vez se ha desarrollado la línea productora. 31 Medios de cultivo ¿Qué tienen los medios de crecimiento?: • Su formulación final depende del tipo de bioproceso, sin embargo, no importa si la línea celular es procariota, eucariota sencilla o eucariota compleja el medio tiene que brindar unos elementos mínimos para que la nutrición y el crecimiento de la línea celular puedan ser promovidos. 32 Por lo general, los medios de cultivo tienen: – Aminoácidos (esenciales y no esenciales) – Muchos tipos de vitaminas (dependiendo del tipo de célula) – Sales ( NaCl, CaCl2, KCl, otras) – Fuentes de Carbono (por lo general glucosa) – Fuentes de Nitrógeno En el curso de Biot 6130-Cultivo de Tejido Animal esta información se estudia al detalle – Amortiguadores o “buffers” (basados en CO2) / indicadores de pH – Elementos traza (oligoelementos) – Moléculas para energía metabólica – Otros – **Suero (En los bioprocesos modernos y donde se usan células de mamífero para generar productos terapéuticos, no se utiliza suero, sino medios libres de suero) – Para evitar variabilidad y mejorar reproducibilidad entre lotes de producción 33 El medio de cultivo para la línea celular • En las facilidades de los bioprocesos industriales, las áreas de preparación de medios son unas muy controladas. Existen condiciones que minimizan la contaminación y que promueven un alto nivel de asepsia. • La preparación del medio inicia en unos tanques especiales (estériles). – El medio o los ingredientes de éste se introducen (usualmente está en forma de gránulos) – Luego se añade la cantidad adecuada de agua (agua de alta calidad) • Para poder usar los tanques donde se preparan los medios, se requieren ciclos de limpieza y de esterilizaciones antes de un nuevo uso. • Esos ciclos de limpieza se denominan “cleaning in place” (CIP), y los de esterilización se llaman “Steam in place” (SIP). – Lo mismo ocurre con los biorrecatores en los que se cultivarán las células. • Esa combinación de CIP y SIP garantizan la remoción de posibles contaminantes. 34 ¿Qué es CIP? • CIP: Cleaning in Place • Es un proceso de limpieza de equipo, tanques, recipientes, líneas de transferencia de soluciones y de tuberías asociadas a los tanques donde se almacena medio de cultivo, materia prima que va a ser parte del medio de cultivo, y los tanques donde se sembrarán las células. • Este tipo de limpieza es mayormente automatizada y utiliza agentes alcalinos y agentes ácidos para limpiar el interior de esos materiales y recipientes que van a tener contacto con el medio y las células eventualmente. • Por regulación, todo equipo o tubería que va a tener contacto directo o indirecto con las células productoras, tienen que ser pasados por un ciclo de CIP y luego del CIP, por un ciclo de SIP. Si el bioproceso tiene como objetivo la generación de un producto para el consumo humano, más estrictas son las exigencias de calidad, y se tiene que incluir procesos de CIP y de SIP previo a la producción. 35 ¿Qué es SIP? • SIP: “Steam in place”-vapor estéril (se asemeja a lo que ocurre dentro de un autoclacve) • Las tuberías y equipos que ya fueron lavados por el proceso de CIP, son luego expuestas a vapor estéril (temperaturas iguales o mayores a las del autoclave-¿Cuál es la temperatura típica que alcanza un autoclave?) • Ese SIP esteriliza los biorrectores y las tuberías por las que va a pasar medio de cultivo y otros materiales hacia el biorreactor. Se eliminan microorganismos y endotoxinas. Eso es muy importante para garantizar mayor seguridad a los productos. 36 El proceso de cultivo celular/fermentación • El último componente de los procesos “upstream” es el proceso de cultivo de células o de fermentación (dependiendo de qué célula se utilice). • En esta etapa se utiliza un contenedor especializado (el biorreactor o fermentador). • Este equipo tiene el objetivo de permitir las condiciones necesarias para el crecimiento de la línea celular productora y, por consiguiente, la generación de la molécula de interés. 37 Biorreactor y fermentador es más o mneos lo mismo • Lo que los distingue principalmente es el tipo de célula que se use para el bioproceso: Biorreactor Células animales Fermentador Bacterias y hongos Cultivo de células 38 Así que, en resumen, hay unos elementos claves para el cultivo de células en estos tanques (biorreactores/fermentadores) Medio de cultivo Diseño y operación adecuada del biorreactor o fermentador Mantenimiento de condiciones óptimas para las células: Ejemplo: factores físico-químicos óptimos para las células 39 El proceso de cultivo de células • Requiere que se inocule el medio de cultivo en el biorrecator con la línea celular productora (WCB). • Luego viene la etapa del crecimiento de las células en el biorreactor (que viene a ser la etapa de producción). • Finalmente, luego de que las células crecen bajo unas condiciones adecuadas y a un tiempo determinado, sigue la etapa de recuperar las células y/o la molécula de interés (operaciones “downstream”). • A nivel comercial, las células se mantienen más en fase Log y estacionaria (claro está, eso no puede ser indefinido-llega el tiempo en que ya una célula no se divide o que se muere). Células que no se dividen o que se mueren no son útiles comercialmente hablando. 40 El proceso de cultivo de células • Dentro del biorreactor las células llevan a cabo un proceso de adaptación (fase Lag), luego se multiplican de forma acelerada (fase exponencial o Log) – Algunos productos se obtienen en esta etapa de crecimiento de células • Eventualmente las células pueden llegar a un nivel en el cual ya no crecen más (no se dividen) y pueden entrar a senescencia o algunas pueden morir. A esa fase se le conoce como la fase Plateau (o fase estacionaria). • Teóricamente luego de una fase Plateau, las células pueden morir a una razón mayor y llega el cultivo a una fase de declive o de muerte. 41 Fases de crecimiento celular (en cultivo in vitro) Fase Plateau Fase Log ¿En qué fase es que las células generarán la molécula de interés (vamos a decir una proteína)? Fase Lag 42 Adición del inóculo de las WCB al biorreactor • Este es un proceso altamente controlado en el cual un vial que contiene las células productoras preservadas es descongelado adecuadamente (con unas condiciones estrictas y siguiendo SOPs específicos) y luego es posteriormente sembrado en el medio estéril que está en el biorreactor. • Es importante recalcar que el inóculo tiene que proveer la suficiente cantidad de células activas para la producción adecuada en el biorreactor. • Una vez inoculado, un biorreactor ofrece las condiciones necesarias para que las células crezcan a densidades elevadas, en el menor tiempo posible. Una vez las células llegan a un nivel máximo de densidad celular, se llevan a otro biorrector con medio fresco, para permitir mayor crecimiento y un aumento en las células (y eventualmente en el producto de interés). 43 El inóculo de un biorrecator • Se hace de forma secuencial (por la metodología de “scale-up”) – ¿Qué es “scale-up” en la bioindustria? • El proceso inicia adaptando la célula en tubos de volúmenes pequeños (15mL por ejemplo) y va subiendo poco a poco a matraz (500 mL), botellas (1L), biorreactores de laboratorio (5-10L), y así sucesivamente hasta llegar a biorreactores de mayores volúmenes más de 100L hasta más de 1,000L. – La lógica es que las células no van a maximizar crecimiento si se cultivan de golpe en una biorreactor grande – Hay que irlas acostumbrando a crecer en volúmenes cada vez mayores – E ir estudiando el proceso en detalle en cada volumen de cultivo • Ese proceso es requerido para que la línea celular productora pueda maximizar su crecimiento en la etapa de mayor volumen de medio (la etapa comercial). 44 Resumen: Scale up del cultivo celular para bioprocesos comerciales Tubos de ensayo Matraz Botellas pequeñas Biorreactores pequeños (de menos de 20L) Primer semillero (biorreactor mayor al pequeño, pero de menor capacidad que el segundo y el comercial) Segundo semillero (borrecator de más capacidad que el primer semillero, pero de menor capacidad que el comercial) Biorreactor comercial (el de mayor volumen posible-miles de litros) 45 Scale-up en los bioprocesos • https://bioprocessingexplained.home.blog/2019/09/01/what-isupstream-processing/ 46 Biorreactor • Hemos estado viendo el concepto de biorreactor desde hace un rato, pero ¿qué es un biorreactor? – Es un contenedor especial que brinda las condiciones necesarias para que las células puedan crecer, proliferar y generar el producto de interés en un ambiente controlado y que minimice al máximo la contaminación. • Pueden ser hechos de acero inoxidable (“stainless steel”) • Sin embargo, relativamente reciente (cerca de 15 años para acá), las tecnologías desechables han incursionado en la producción industrial, incluyendo en los bioprocesos. – Tradicionalmente esta es la unidad más utilizada a lo largo de las décadas. – Existen ahora biorreactores desechables que son muy comunes principalmente en el cultivo de células eucariotas. • No importa la construcción del biorreactor, si es reusable (como los de acero) o si no es reusable (como los desechables) la operación o la lógica de funcionamiento de los biorreactores es la misma. 47 Los biorreactores/fermentadores Configuración típica de un biorrecator/fermentador Brinda las condiciones necesarias para el crecimiento de las células y la generación del producto. Requieren un excelente diseño, validación y constante evaluación a lo largo del bioproceso. 48 Biorreactor • Puede tener una capacidad variada. – Hay biorreactores pequeños, medianos, grandes y otros son de volúmenes muy grandes. • Los desechables tienden a ser pequeños a medianos. • La elección del biorreactor es un proceso que se completa desde la fase de investigación. El tipo de bioproceso en muchas ocasiones limita el tipo de tanque a utilizarse. – Porque hay células que no se pueden hacer crecer en todo tipo de biorreactor 49 Biorreactores • La creación y la operación de un biorreactor son responsabilidad principal de ingenieros. • Todas las condiciones requeridas para que el biorreactor promueva un cultivo celular exitoso, dependen de cuidadoso diseño y de intervención de ingenieros altamente preparados. • Muchos factores de transferencia de masa, energía, movimiento de materiales, formación de gradientes, entre otros aspectos físico-químicos del proceso de cultivo celular, tienen que ser considerados para el diseño del biorreactor. Todos estos factores serán cruciales para el éxito de cultivo celular que se pueda llevar a cabo en el biorreactor. 50 Partes de un biorreactor (de acero inoxidable) Por lo general los biorreactores/fermentadores cuentan con las siguientes partes o elementos: Sistema de enfriamiento-abrigo de agua-(“Water jacket”)-o simplemente el abrigo del tanque •También puede haber líneas de enfriamiento-utilizan glicolson unos alambres de acero por los que pasa el glicol y enfrían el tanque. (el glicol no tiene contacto con el medio de cultivo ni con el tanque en su interior. Sistema de entrada de oxígeno-Aireador(“sparger”) •Es un sistema de pequeños poros por los que sube el aire en forma de burbujas desde el fondo del tanque. El aire que ingresa al tanque es estéril (pasa a través de un sistema de filtros). Barras protectoras internas (para células de mamífero)-”bafles” •Las células de mamíferos son más delicadas y las colisiones las pueden destruir •Además, estos amortiguadores minimizan la generación de vórtices internos 51 Partes de un biorreactor (continuación) Aditamentos para agitación o propulsión-propulsores- (“impellers”) •Necesarias para mezclar bien la masa células, el medio y los gases •Evitan que se concentren los materiales en unas zonas específicas del tanque. Los biorreactores tienen unas líneas (tuberías) para entrada de: •Células (el inóculo) •Nutrientes (el medio de cultivo) •Amortiguadores (“buffers” específicos) •Otros agentes También tienen líneas de salida de materiales. •Células •Desechos •Otras soluciones 52 Tipos de biorreactores Biorreactor con agitadores (es el más común) Desechables Existen diferentes tipos de biorreactores, sin embargo, los más comunes incluyen: Tipos de biorreactores más comunes Biorreactor con burbujeo sin agitadores (“airlift boreactor”) “Packed-bed” bioreactor 53 El biorreactor con agitación • Por lo general, la mayoría de los bioprocesos requieren de un cultivo en condiciones aeróbicas. Por lo tanto, la configuración de los biorreactores requiere la diseminación adecuada de oxígeno. • El biorreactor con agitación mecánica es el diseño más común. Tiene propulsores mecánicos (“impellers”) y un dispositivo de aireación (“sparger”) que viene desde el fondo del tanque. • Este tipo de biorreactor puede ser uno simple o puede ser más complejo dependiendo del bioproceso. • Las otras configuraciones de biorreactores aeróbicos difieren en la configuración interna y en la manera en que el oxígeno es distribuido. 54 Características esenciales deseadas en un biorreactor • Su construcción debe minimizar el riesgo de contaminación. No debe permitir proliferación de microorganismos ni acumulación de materiales en su interior, por lo que sus superficies internas tienen que ser lisas. Las condiciones internas tienen que ser estériles para que las células productoras puedan crecer de forma adecuada. • Su diseño debe minimizar al máximo la exposición del interior. • Deben tener sistemas de sensores para monitoreo de factores como: – – – – – – – Temperatura Oxígeno disuelto pH Osmolalidad “Foam”-espuma Biomasa Otros 55 Factores que tienen que ser controlados efectivamente en un proceso de cultivo celular • Oxígeno: tiene que estar bien distribuido por todo el medio para que las células en todo el biorreactor puedan maximizar su metabolismo aeróbico. – Por lo general, la razón de aireación dentro del biorreactor se da en un rango de 0.1 y 2 volumen de gas por volumen de solución por minuto (vvm) • KLa (coeficiente de transferencia volumétrica de oxígeno): se refiere a la cantidad de oxígeno gaseoso que se disolverá en el cultivo de células. Es un coeficiente que se calcula utilizando diferentes variables entre las que se encuentran: los amortiguadores, la agitación, el tamaño de las burbujas y la velocidad del flujo. • Transferencia de calor: – Las operaciones para intercambiar el calor generado en el interior de tanque son importantes porque es necesario mantener unas condiciones constantes de temperatura. – La transferencia de calor depende de la capacidad del biorreactor, aunque típicamente se mantiene de 1.5-3.0 °C/minuto para un biorreactor de 10mm³ – Para mantener más bajas las temperaturas, se utiliza agua para enfriamiento, glicol o freón. 56 Factores que tienen que ser controlados efectivamente en un proceso de cultivo celular • Control de pH: por lo general, las reacciones dentro de un biorreactor requieren un pH constante. Los sistemas de biorreactores industriales tienen mecanismos automatizados para añadir amortiguadores de pH. • Control de la espuma (“foaming control”): por la agitación y la aireación normal de un biorreactor, se tiende a formar espuma. La espuma no es deseada ya que afecta la transferencia de nutrientes a las células y disminuye la efectividad del cultivo celular. Por ello, se tiene que añadir agentes anti-espumas que cumplan con requisitos de seguridad (no sean tóxicos a las células ni contaminen el producto). 57 Modos de operación de los biorreactores • Depende del tipo de bioproceso, un biorreactor puede operar (funcionar)en diferentes tipos de modalidades. En otras palabras, las estrategias de producción pueden variar y cada biorreactor puede ser utilizado en un modo de operación específico para lograr el cultivo celular. • Por lo general, los modos principales de operación para un biorreactor son: – Tanda (“batch”) – Tanda-alimentada (“fed-batch”) – Continuo-Perfusión 58 Operación en formato de tanda (“Batch culture”) • El biorreactor es inoculado con las células y se deja que las mismas crezcan y generen las moléculas de interés. Se dan las cuatro fases de crecimiento típicas de una célula en cultivo in vitro: Lag, Log, Plateau y Muerte. • El ciclo de producción es corto y las moléculas de interés son recuperadas al final del ciclo. • No es un modo común. Su uso es mayormente a unas escalas de producción pequeñas. Algunos productos son recuperados por este tipo de operación. • La generación de etanol es un ejemplo de este tipo de operación. 59 Operación de tanda alimentada (“Fed-batch”) • Es un modo de operación en el que se promueve que el cultivo se mantenga en las fases Log y estacionaria (Plateau) pero en la que se retrasa la fase de declive (muerte) de las células. • Se logra al añadir constantemente nutrientes antes de que las células lleguen a fase estacionaria. Eso facilita mayor crecimiento de las células y mayores rendimientos (más producción de las moléculas de interés). • En este tipo de sistema las células tardan en llegar a la fase de muerte, pero eventualmente lo hacen y ahí es que se recuperan las moléculas deseadas. 60 Operación en modo continuoperfusión • Un biorrecator que opera en modo continuo es uno en el que consistentemente se añade medio, y en el que constantemente se van removiendo desechos y moléculas generadas. • De esa forma las células siempre tienen medio fresco y pueden tener mayores rendimientos. Pueden generar muchas más moléculas de interés que un biorreactor tipo tanda o tanda alimentada. 61 Ejemplo de operación por perfusión (operación continua) http://www.cmcbio.com/Portals/0/CMC/docs/perfusion.pdf 62 Evolución de los biorreactores • En la actualidad hay nuevas tecnologías de biorreactores que son utilizadas con mayor frecuencia. • Por ejemplo: – Fotobiorreactores (bioprocesos para combustibles) – Biorreactores de membrana – Biorreactores desechables (wave bioreactor) • Una de las principales razones para los nuevos tipos de biorreactores es maximizar costo-efectividad (menor espacio, menor intervención de preparación y mantenimiento, menores volúmenes de producción) 63 Tecnologías desechables • Tienen la ventaja de que disminuyen los costos operacionales relacionados con las limpiezas, monitoreos, evaluaciones, preparaciones y mantenimiento de materiales y equipos requeridos en la biomanufactura. • Además, agilizan el proceso de producción. • Es importante establecer, sin embargo, que no en todos los bioprocesos se puede utilizar tecnologías desechables. • Los sistemas desechables tienen algunas desventajas si se comparan con los sistemas re-utilizables. Sistema desechable moderno 64 Pruebas realizadas durante las operaciones • Para el éxito de los cultivos celulares es necesario que se monitoreen diferentes factores entre los que se encuentran: – – – – pH, osmolalidad, temperatura, biomasa, niveles de oxígeno, niveles de bióxido de carbono, otros Viabilidad celular Niveles de nutrientes (carbono, nitrógeno, entre otros) Esterilidad – Y otras pruebas microbiológicas – Identidad – Otras • Los biorreactores tienen sensores y equipos integrados para medir los parámetros físico-químicos. • Además, los tanques tienen unas salidas para la toma de muestras a ser analizadas para: – Calidad microbiológica – Viabilidad celular – Hematocitómetro – Contadores celulares automáticos 65 Material adicional para ampliar información • http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/bit.25529/pdf • https://www.tandfonline.com/doi/full/10.3109/07388551.2015.1084266 66 Referencias • Dutton, R.L. & Scharer, J.M., 2007. Advance technologies in biopharmaceutical processing. United Sates of America: Blackwell Publishing. Bisaria, V.S. & Kondo, A. (2014). Bioprocessing of renewable resources to commodity bioproducts. John Wiley & Sons, Incorporated. http://site.ebrary.com/lib/interpuertorico/detail.action?docID=10856811&p00=bioproces • Flickinger, M.C. (2013). Encyclopedia of Industrial Biotechnology. John Wiley & Sons Inc. http://site.ebrary.com/lib/interpuertorico/detail.action?docID=10735224 • Ho, R.Y. (2013). Biotechnology and biopharmaceuticals: transforming proteins and genes into drugs. John Wiley & Sons. http://site.ebrary.com/lib/interpuertorico/detail.action?docID=10767016 • • Niazi, S. (2017). Fundamentals of modern bioprocessing First issued in paperback. CRC Press. TP248.3. N533 2017 • Okafor, Nduka, (2007). Modern industrial microbiology and biotechnology. Sciences Publishers. http://site.ebrary.com/lib/interpuertorico/detail.action?docID=10256230 67 Plan para el trabajo del Módulo 8 • Este módulo debe ser trabajado en no más tarde de dos semanas • Deben leerlo y analizarlo bien • Conteste las preguntas exploratorias que se incluyen, antes de seguir a las siguientes diapositivas 68