Méthodes Analytiques - Sciences Analytiques et Contrôle Qualité PDF

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1 OPTION 5BIM-5BB Sciences Analytiques et Contrôle Qualité Module 1 Méthodes analytiques Département Biosciences Aborder les différentes méthodes analytiques qui interviennent lors du Contrôle Qualité des produits biologiques. Raphaël Vigan 2024  2 Objectifs du module Donner une vue d'ensemble des méthodes analytiques utilisées pour contrôler la qualité des produits Présenter les principes scientifiques et technologiques de quelques méthodes clefs Construire le profil de contrôle d’un produit  Au Programme 3 INTRODUCTION TESTS D’IDENTITE TESTS D’EFFICACITE CHAPITRE UN CHAPITRE DEUX CHAPITRE TROIS TESTS D’INNOCUITE CAS CONCRET QUESTIONS ? CHAPITRE QUATRE CHAPITRE CINQ CHAPITRE SIX INTRODUCTION 4 Le Contrôle Qualité CHAPITRE UN Le contrôle de la qualité concerne l’échantillonnage, l’établissement de spécifications et l’analyse, ainsi que l’organisation, l’établissement des documents et des procédures de libération qui garantissent que les essais nécessaires et appropriés ont bien été effectués, que les matières premières et articles de conditionnement ne sont pas libérés en vue de leur utilisation, ni les produits libérés en vue de leur vente ou de leur distribution, avant que leur qualité n’ait été jugée satisfaisante. INTRODUCTION 5 Cycle de vie nouveau produit CHAPITRE UN Parcours Médicament INTRODUCTION 6 Le Contrôle Qualité CHAPITRE UN I n trodu c tion au x Sc ien c es A n aly tiq u es et au C on trôle Q u alité LES NOMBREUX représentent 70 % du temps de production. TESTS AU CONTRÔLE Des tests répétés par différentes QUALITÉ… autorités.  INTRODUCTION CHAPITRE UN Introduction 7 Mission de l’entité « Contrôle Qualité » Le contrôle qualité, à ne pas confondre avec l’assurance qualité est un département clef au sein d’une entreprise pharma / biotech puisqu'il rassemble les activités de tests analytiques dont le but est de s’assurer que tous les produits mis sur le marché à disposition des patients sont de « qualité ». Notion de CQA « Critical Quality Attribute » Un attribut qualité critique est une propriété ou une caractéristique physique, chimique, biologique ou microbiologique qui doit demeurer dans des limites définies pour assurer le niveau de qualité requis pour le produit. PARAMETRES ATTRIBUTS QUALITE QUALITE DU CRITIQUES - CPP CRITIQUES PRODUIT IDENTITE PROCESS ANALYTIQUE MARCHE EFFICACITE étape d’inactivation virale § Concentration en agent inactivant INNOCUITE § T°C Absence de virus non inactivés Absence d’agents pathogènes § Durée + vitesse agitation  Le contrôle des lots de production est réalisé grâce à trois types de contrôles : - Les contrôles libératoires, réalisés à la fin des différentes étapes de fabrication par le contrôle INTRODUCTION CHAPITRE UN Introduction - qualité, un lot de vaccin ne pourra être libéré que si les contrôles libératoires sont validés 8 Les contrôles IPC (In Process Control), réalisé par le producteur sur la chaîne de production. permettent de vérifier le bon déroulement de la production. En cas de détection d’un problème Ils grâce à un test IPC la production peut être arrêtée (évite de devoir attendre le résultat des tests de contrôle) - Les contrôles de monitoring, réalisés par le producteur sur la chaîne de production. Ils permettent d’ajuster certains paramètres si nécessaire (ex : si une culture cellulaire n’est pas arrivée au bon niveau de pousse, le temps d’incubation est allongé). Un seul produit mais 2 vies distinctes. Les contrôles des lots de production ont pour but d’assurer l’identité du principe actif, l’activité du vaccin et l’innocuité du vaccin. Tous les tests ne sont pas réalisés au même moment. Par exemple, on retrouve § Tout au long du procédé de fabrication des échantillons les tests de sécuritésont prélevés majoritairement etduenvoyés au niveau dans les laboratoires produit réparti. des contrôles qualité pour y effectuer des analyses § Le procédé analytique « vit » en parallèle du procédé de fabrication § Des tests à chaque étape du cycle de production Plusieurs types de tests. Selon l’étape de production, il y aura : § Tests Libératoires § Tests de Contrôle procédé (IPC) § Tests de Suivi procédé (Monitoring) INTRODUCTION CHAPITRE UN Introduction 9 Un panel large et diversifié de tests analytiques répartis en 3 catégories selon le but. Tests d’identité § Contient le « bon » le principe actif, antigène ou anticorps, afin que la protection immunologique soit celle recherchée Tests d’efficacité (activité) § Sera efficace une fois administré chez le patient à capable de déclencher une réaction immunitaire protectrice en cas d’infection Tests d’innocuité / sécurité § Aucun risque de santé pour le patient à aucun risque d’innocuité (« sécurité ») INTRODUCTION ANALYTIQUE & CHAPITRE UN SANOFI PASTEUR IDENTITÉ EFFICACITÉ Introduction INNOCUITÉ CONTEXTE TECHNICO-REGLEMENTAIRE Quality By Design 10 LA COMPLEXITÉ D’UN ÉCHANTILLON ET LES CARACTÉRISTIQUES ASSOCIÉES La composition d’un produit biologique et ses caractéristiques. ANTIGÈNE / PRINCIPE ACTIF Identité Quantité MILIEU / Activité EXCIPIENTS Pureté Stérilité Aspect Identité Quantité 9 INTRODUCTION CHAPITRE UN Introduction 11 Plusieurs disciplines scientifiques. Les tests analytiques peuvent également être répartis en fonction du type de méthode analytique utilisée. à On pourra donc avoir des méthodes analytiques faisant appel à: § Biologie moléculaire + Physico-Chimie + Immunologie + Biologie animale à Pour tous types de produits § Virologie à Produits de types viraux + Banques cellulaires et virales + Matières premières … § Bactériologie à Produits de types bactériens / viraux + Contrôles environnementaux …  Au Programme 12 INTRODUCTION TESTS D’IDENTITE TESTS D’EFFICACITE CHAPITRE UN CHAPITRE DEUX CHAPITRE TROIS TESTS D’INNOCUITE CAS CONCRET QUESTIONS ? CHAPITRE QUATRE CHAPITRE CINQ CHAPITRE SIX TESTS D’IDENTITE CHAPITRE DEUX Tests d’identité 13 Assurer l’identité du principe actif. § Mise en œuvre de méthodes immunologiques utilisant la propriété de reconnaissance spécifique entre l’antigène/principe actif et un anticorps spécifique § Mise en en œuvre des propriétés biochimiques des bactéries (exemple: activité enzymatique) Sélection de tests d’identité. § Test d’Ouchterlony § Chromatographie d’exclusion stérique § Technologie Luminex § Galerie API § Test de Neutralisation § Western Blot  23 TESTS D’IDENTITE Test d’Ouchterlony Ouchterlony – Double diffusion en gel14 CHAPITRE DEUX Immunologie Epreuve d’identité par Ouchterlony. La double diffusion en gel, ou test d’Ouchterlony, est une technique d’immunologie. La dou diffusion en gel permet d’identifier un antigène grâce à la reconnaissance spécifique av Contexte à Identification de molécules l’antisérum type anticorps (anticorps) associé. (immunoglobulines) ou antigène Principe à Principe § Méthode basée sur la propriété de: diffusion des immunoglobulines et substances antigéniques dans un milieu de type gélose La double diffusion en gel se base sur la propriété de reconnaissance spécifiq sanofi pasteur § Si un sérum contient des anticorps spécifiques antigène/anticorps.194Un d'une des RAGEsubstances anticorps IMOGAM antigéniques est spécifique PASTEURISEE USAd’un présentes, antigène - EPREUVE donné. D'IDENTITE ilUn PARyOUCHTERLONY aura alors et s antigène formation, à égale distance des deux anticorps puits concernés, correspondant d'ununprécipité vont former complexeen forme d'arc correspondant au protéique. complexe immun L’échantillon à analyser doit d’abord être purifié afin d’iso l’antigène à analyser. L’antigène à identifier est placé dans le puits central d’un gel. Divers anticorps sont placés dans des puits périphériques. Les différentes molécules, antigène et anticorps, vont diffuser da le gel. Anticorps et antigènes vont donc finir par se rencontrer. Le complexe antigène/anticorps ne va plus pouvoir diffuser dans gel et va précipiter formant un arc de précipitation. L’arc de précipitation est révélé par coloration du gel.  Une séparation chromatographi stationnaire (phase fixe qui va TESTS D’IDENTITE Chromatographie d’Exclusion Stérique entraîne le mélange dans 15 la pha CHAPITRE DEUX La colonne chromatographique filtre. Les molécules de petites dans le gel. A contrario les molé Identification via la taille moléculaire. dans les interstices du gel. Ainsi plus une molécule est de Contexte à Séparation et identification des composants en fonction de leur rapidement. taille moléculaire Principe à § L'échantillon injecté est élué au travers d'un gel poreux sous pression § Les molécules de dimension supérieure aux plus gros pores du gel ne peuvent y pénétrer à elles restent dans la phase mobile circulante et quittent la colonne les premières § Les molécules plus petites diffusent plus ou moins vite dans les pores du gel, suivant leur taille et leur forme, et quittent la colonne dans l'ordre des masses moléculaires décroissantes § Les molécules ainsi séparées sont détectées par des systèmes de détection - exemple : détection UV ou réfractomètre § Le temps de rétention (temps entre le dépôt du mélange et la détection du composé en sortie) est proportionnel à la taille du composé Remarque : HPLC à Il est donc possible d’estimer la taille moléculaire des différents composants Aujourd’hui, les chromatographies du mélange et donc d’en déduire leur identité Chromatography » (HPLC).L’HPLC  La technologie Luminex bille (complexe bille/Ac) TESTS D’IDENTITE CHAPITRE DEUX Technologie Luminex 16 Les anticorps liés aux b Un mélange de technologies. Contexte à Identification de molécules type anticorps (immunoglobulines) ou antigène Principe à La technologie Luminex est basée sur la propriété de reconnaissance spécifique antigène/anticorps § Utilisation de « billes » liées à un anticorps spécifique. Chaque type de bille (complexe bille/Ac) est marqué par un fluorochrome spécifique ( ). Les anticorps liés aux billes sont choisis en fonction des antigènes à détecter § Le mélange de billes est mis en contact avec l’échantillon. Il y a formation des complexes billes- Ac/Ag spécifiques à étape de capture de l’antigène ( ) § Un mélange d’anticorps est alors introduit. Les types d’anticorps introduits sont spécifiques des antigènes à détecter. Les anticorps de détection sont conjugués à des systèmes fluorescents à formation d’un deuxième complexe Ag/Ac ( ) § Le mélange est alors composé de complexe bille-Ac/antigène/anticorps ; bille et anticorps sont fluorescents ( )  de détection sont conjugués à des systèmes fluorescents. Il y a TESTS D’IDENTITE Technologie Luminex formation d’un deuxième complexe Ag/Ac. 17 CHAPITRE DEUX Le mélange est alors composé de complexe bille/antigène/anticorps ; bille et anticorps sont fluorescents. Un mélange de technologies. La fluorescence spécifique des billes et des Ac est Principe à détectée grâce à deux lasers. § La fluorescence spécifique des billes et des Ac est détectée grâce Le laser rouge excite le fluorochrome présents dansà deux lasers les billes § Le laser rouge excite et permet présent le fluorochrome de classer lesbilles dans les différents types et permet de de billes. classer les différents types de billes Le laser vert § Le excite l’Ac laser vert de détection excite et permet l’Ac de détection ainsiainsi et permet de détecter les de détecter lesbilles qui billes qui ont fixé un antigène ont fixé un antigène. La combinaison de la de § La combinaison détection des la détection desbilles marquées billes marquées et deet leur declassification leur classification permet permet d’identifier les antigènes présents dans l’échantillon de départ à ce d’identifier les antigènes présents dans l’échantillon de départ : ce sont sont ceux pour lesquels la bille correspondante a été détectée par l’Ac de ceux pour lesquels la bille correspondante détection a été détectée par l’Ac de détection. Propriétés du test : Simple et rapide de mise en œuvre (pas de préparation de l’échantillon) ; Grande  de détection sont conjugués à des systèmes fluorescents. Il y a TESTS D’IDENTITE Technologie Luminex formation d’un deuxième complexe Ag/Ac. 18 CHAPITRE DEUX Le mélange est alors composé de complexe bille/antigène/anticorps ; bille et anticorps sont fluorescents. Un mélange deLa technologies. fluorescencespécifique des billes et des Ac est détectée grâce à deux lasers. Le laser rouge excite le fluorochrome présents dans les billes et permet de classer les différents types de billes. e laser vert excite l’Ac de détection et permet ainsi de détecter les billes qui nt fixé un antigène. a combinaison de la détection des billes marquées et de leur classification permet ’identifier les antigènes présents dans l’échantillon de départ : ce sont ceux pour lesquels la ille correspondante a été détectée par l’Ac de détection. Propriétés du test : Simple et rapide de mise en œuvre (pas de préparation de l’échantillon) ; Grande TESTS D’IDENTITE CHAPITRE DEUX Galerie API 19 Une galerie de réactions colorimétriques. Contexte à Permet l’identification biochimique des genres bactériens Automatisation possible de la méthode Principe à Les galeries API se basent sur une série de tests biochimiques qui impliquent des réactions colorimétriques § Une galerie API se présente sous forme d’une plaque constituée de plusieurs tubules § Chaque tubule permet de réaliser un test biochimique particulier à Recherche d’une activité enzymatique, fermentation de glucides… § Les substrats contenus dans chaque tubule sont choisis pour entraîner un changement de couleur suivant le résultat du test Une petite quantité de la suspension bactérienne à tester est introduite dans chaque tubule. Le profil obtenu (coloration des tubules) est caractéristique d’un genre bactérien. Le résultat est comparé à une base de données. On peut ainsi identifier un genre bactérien.  ou de rechercher la présence d’un vir L’observation d’un ECP est utilisée p TESTS D’IDENTITE CHAPITRE DEUX Test de Neutralisation caractéristique de l’agent pathogène) culture cellulaire. 20 Principe : Neutralisation – Inhibition de l’effet du pathogène. Une cu vérifier Principe à d’atténu § Test basé sur la capacité des anticorps à se lier de manière spécifique à un antigène donné et ainsi d’en inhiber les effets La cul éventue Neutralisation de l’effet cytopathique – cas du virus Polio. Si un cellulai § Mise en présence du virus Polio sérotype 1 avec un anticorps spécifique produit § Infection d’une nappe cellulaire avec le mélange virus – anticorps Figure 8 Absence d'ECP, culture § S’il s’agit du virus Polio type 1 alors à Neutralisation des effets cytopathiques Dans le celulairedu virus (ECP) confluente l’ECP c à Le tapis cellulaire reste intègre Dans le utilisée l’incuba Absence d’ECP – nappe cellulaire intègre Figure ECP 9 ECP,dediminution – diminution de cellules vivantes cellules vivantes TESTS D’IDENTITE CHAPITRE DEUX Western Blot 21 Western Blot. Flux de travail d’un Western Blot Principe à § Les protéines de l’échantillon à analyser sont séparées par électrophorèse SDS-PAGE (séparation suivant la taille des protéines). (1) § Les protéines du gel sont transférées sur une membrane. Le transfert est réalisé par l’application d’un champ électrique ; les protéines migrent du gel vers la membrane. (2) § Les protéines sont détectées par un anticorps spécifique. Il y a formation d’un complexe stable anticorps/antigène (4) § Un second anticorps est introduit au mélange ; il permet la révélation du complexe Ac/Ag. (6) § L’anticorps de révélation est lié à une enzyme. L’enzyme permet la transformation de son substrat en agent coloré. (8)  Au Programme 22 INTRODUCTION TESTS D’IDENTITE TESTS D’EFFICACITE CHAPITRE UN CHAPITRE DEUX CHAPITRE TROIS TESTS D’INNOCUITE CAS CONCRET QUESTIONS ? CHAPITRE QUATRE CHAPITRE CINQ CHAPITRE SIX  31 TESTS D’EFFICACITE CHAPITRE TROIS Tests d’efficacité L’EFFICACITE d’un vaccin est reliée à l’activité du vaccin. L’activité d’un vaccin peut être mesurée de différentes manières. 23 mesurée par l’injection du vaccin et la mesure du taux de protection, le dosage des anticorps induit par l’injection du vaccin, soit elle est m principe actif (Test de contenu). L’utilisation des deux derniers types Assurer l’efficacité du produit biologique. l’activité du vaccin n’est possible que si il a été démontré au pré L’EFFICACITE d’un vaccin est reliée à l’activité du vaccin. corrélat de protection entre le dosage d’anticorps (ou le dosage protection induite par l’injection du vaccin. L’activité du produit peut être mesurée de différentes manières : § Activité biologique à injection du produit sur animaux suivie de la mesure du taux de protection par : - Mesure du taux de mortalité - Quantification des anticorps induits § Dosage / Titrage du contenu en principe actif à Test de « content » (potency) Sélection de tests d’efficacité. § Test d’activité sur animaux - DE50 § Dosage par ELISA § Test RFFIT § Test d’immunodiffusion radiale § Test d’immunogénicité § Titrage infectieux - DICC50 TESTS D’EFFICACITE CHAPITRE TROIS Test d’activité sur animaux 24 Dose efficace médiane – DE50 (test de challenge). Contexte à Le test de challenge est une méthode de mesure de l’efficacité du vaccin face à une infection chez l’animal § Détermination de la dose qui protège 50% des animaux (DE50) contre les effets nocifs d’un agent pathogène § Cette dose est comparée à celle d’un produit de référence nécessaire pour assurer la même protection § Le test tend à être remplacé par des tests de content in vitro Principe à § Différentes doses (dilutions) de vaccins sont inoculées à des animaux § Après quelques jours, une dose d’agent infectieux est injectée aux animaux (dose identique pour tous les animaux) § On observe, le déclenchement, ou non, de la maladie et l’apparition de symptômes § La dose de vaccin qui protège 50% des animaux (DE50) est déterminée. Cette dose est comparée à un vaccin standard. Le vaccin testé doit avoir une DE50 au moins égale à celle du standard. Vaccination Epreuve Observation Fin de test Schéma de test TESTS D’EFFICACITE CHAPITRE TROIS Dosage par ELISA 25 ELISA Sandwich – Double capture de l’antigène. Contexte à Automa2sa2on possible de la méthode § Quantification du contenu en principe actif basée sur la reconnaissance spécifique antigène – anticorps § Quantification de l’activité biologique d’un vaccin à partir de sa concentration en principe actif Principe à Méthode immuno-enzymatique § Les anticorps de capture et les anticorps primaires (anticorps de détection) reconnaissent spécifiquement un antigène donné § L’anticorps secondaire est conjugué à une enzyme et est dirigé contre l’espèce animale des anticorps primaires § Le substrat est ajouté et va réagir avec l’enzyme du conjugué § Réaction enzymatique colorimétrique entre le substrat et l’enzyme § Quantification de la luminescence émise par un spectrophotomètre - Lecture de densités optiques § L’intensité du signal émis est proportionnelle à la quantité d’antigène présent  ♦ Contre color ♦ Répartition des dilutions à tester sur les labteks (§ 7.4) Test RFFIT ♦ Préparation et distribution de la J2 TESTS D’EFFICACITE dilution "0" du virus (§ 7.5) 26 ♦ Titrage de la dilution "0" du virus et CHAPITRE TROIS incubation 90 minutes (contact ♦ Lecture (§ 8 échantillon/virus) (§ 7.6) ♦ Calcul (§ 8.2 ♦ Préparation de la suspension cellulaire et distribution dans les Rapid Fluorescent Foci Inhibition Test – « RFFIT ». labteks (§ 7.7) ♦ Incubation de 24 heures (§ 7.8) Contexte à Dosage des immunoglobulines antirabiques Principe à § Une dose constante de virus rabique d'épreuve est neutralisée par des quantités variables d'immunoglobulines obtenues par dilution § Après contact virus-anticorps, le mélange est mis en présence de cellules sensibles BHK21 § Après 24 heures d'incubation, la présence dans les cellules de virus non neutralisé est révélée par un conjugué fluorescent spécifique § Le titre de la solution d’anticorps est obtenu par comparaison avec le titre connu de la référence - DE50 de la référence versus DE50 de l’échantillon à tester Information Confidentielle Page 16 de 40 TESTS D’EFFICACITE CHAPITRE TROIS Test RFFIT 27 Rapid Fluorescent Foci Inhibition Test – « RFFIT ». Protéines virales rabiques Cellules fluorescentes infectées par Pas de cellules infectées fluorescentes l’antigène TESTS D’EFFICACITE CHAPITRE TROIS Test d’immunodiffusion radiale 28 Single Radial Immunodiffusion – « SRID ». sanofi pasteur VACCIN RAGE - TENEUR EN GLYCOPROTEINE RABIQUE ET IDENTITE PAR RADIALE Automatisation possible de la méthode Contexte à Technique utilisée en immunologie pour déterminer la quantité d’antigène PROCEDURE : - Exemple : quantification de la glycoprotéine G du virus rabique Q_0011452 : "Flux et gestion des échantillons, des déchets et du matériel au M4-M5, M6 – F4 Nord et local 140A – F1 Nord – laboratoire CV1 Nord " Principe à 2 PRINCIPE § Des puits sont percés dans un gel d’agarose qui est tout imprégné d’une suspension d’anticorps. Ces anticorps sont dirigés directement contre 2.1 Quantification de la glycoprotéine rabique (test quantitatif) l’antigène à quantifier La quantification de la glycoprotéine rabique peut être effectuée par la méth diffusion radiale simple dans un gel d'agarose par réaction vis à vis d'un anti hyper immunisé Image contre la: cercle rage. La de tailleprécipitation dans un du cercle de précipitation qui gel. en rés § Quand l’antigène est ajouté aux puits suivi d’un temps de proportionnelle à la concentration en glycoprotéine. diffusion/incubation, des complexes avec les anticorps se forment § Ces complexes sont visibles sous forme de cercle appelés « cercle de précipitation » § En mesurant le diamètre de ces cercles et en comparant avec un étalon (standard) de titre connu on peut en déduire la concentration en antigène à La taille du cercle de précipitation est directement proportionnelle à la concentration en antigène 2.2 Image Identité (test : correspondance diamètre - titre. qualitatif) TESTS D’EFFICACITE CHAPITRE TROIS Test d’immunogénicité 29 Quantification des anticorps induits. Contexte à Le test d’immunogénicité est une méthode de mesure de l’efficacité chez l’animal § Vérifier directement la présence ou absence d’anticorps suite à la vaccination § Le taux d’anticorps peut être corrélé au niveau de protection § Le test tend à être remplacé par des tests de content in vitro == Test d’antigénicité Principe à § Une dose de vaccin est injectée à un animal § Après quelques jours, un prélèvement sanguin est réalisé sur ce même animal § Le sérum est dosé pour y déterminer la quantité d’anticorps induits TESTS D’EFFICACITE CHAPITRE TROIS Titrage infectieux 30 Dose infectieuse en culture de cellules (DICC50). Contexte à Détermination de la dilution virale pour laquelle 50% des supports de cellules montrent un effet cytopathique (cette dilution est celle dont le volume contient une DICC50). La détermination de la DICC50 ne peut être réalisée que pour des vaccins qui ont gardé leur capacité à infecter des cellules (germes entiers, recombinants). Principe à § Ensemencement cellulaire 10-2 § Préparation des gammes de dilutions virales § Répartition des dilutions dans les puits de la plaque 10-3 § Incubation 10-4 § Lecture / Révélation soit : 10-5 - en observant un effet cytopathique à les puits 10-6 transparents correspondent à ceux où le tapis cellulaire a été 10-7 détruit par du virus et les puits colorés en mauve représentent les puits où le tapis cellulaire est resté intact 10-8 - par immunofluorescence ou immunocolorimétrie à les 10-9 protéines virales exprimées par les cellules infectées sont T- détectées par un Ac spécifique. Cet Ac est lui-même détecté par un deuxième Ac couplé à une enzyme ou un fluorochrome  31 Pause  Au Programme 32 INTRODUCTION TESTS D’IDENTITE TESTS D’EFFICACITE CHAPITRE UN CHAPITRE DEUX CHAPITRE TROIS TESTS D’INNOCUITE CAS CONCRET QUESTIONS ? CHAPITRE QUATRE CHAPITRE CINQ CHAPITRE SIX TESTS D’INNOCUITE CHAPITRE QUATRE Tests d’innocuité 33 Assurer l’innocuité / sécurité du produit. Quelques définitions. 51 § Absence de pathogénicité § Contenu limité en impuretés § Impureté : Substance dérivée du produit ou du § Contenu limité en contaminants process dont la concentration doit être inférieure à un § La SECURITE Paramètres physiologiques du vaccin est synonyme d’innocuité. seuil de toxicité en fin de production Les sources qui rendent nocif un vaccin sont multiples. § Contaminant : Substance introduite accidentellement qui ne fait pas partie du process de production D’après guideline ICH Q6B Sélection de tests. § Contrôle d’inactivation § Test d’endotoxines (LAL) § Test de Mycoplasme § Test de stérilité § Test de détoxification § Dosage ADN résiduel § Mesures pH et osmolalité Caractéristiques d’innocuité Figure 5 Les caractéristiques d'innocuité du vaccin  l’antigène (principe actif du vaccin) et un anticorps spécifique. TESTS D’INNOCUITE CHAPITRE QUATRE Tests d’innocuité Suivant la nature du vaccin d’autres types d’identification sont envisageables. 34 Les différents types de vaccin. Figure 3 Les différents types de vaccins TESTS D’INNOCUITE CHAPITRE QUATRE Tests d’innocuité 35 Les différents types de vaccin – Example COVID-19 TESTS D’INNOCUITE CHAPITRE QUATRE Test d’inactivation 36 Vérifier l’absence de virus infectieux résiduels. Contexte à Vérifier l'absence de virus résiduel non inactivé Principe à Le design de test et la méthode de révélation est adaptée au pathogène concerné § Phase 1 à étape d’amplification - Test long qui doit permettre la réplication du virus si présent - Phase de cultures cellulaire & virale § Phase 2 à étape de détection - Détection de virus infectieux à méthode de détection adaptée à la biologie du virus (immunofluorescence, détection d’ECP…) Inoculation Détection Détection Amplification Amplifica-on Amplifica-on  culture cellulaire. TESTS D’INNOCUITE CHAPITRE QUATRE Test d’inactivation Principe : 37 Une vérifie Vérifier l’absence de virus infectieux résiduels. d’atté L’observation d’ECP ou de signal fluorescent témoignent de la présence de virus non inactivés La c évent § Les protéines virales des virus Hépatite A et virus Rabique qui se seraient répliqués si les suspensions virales n’avaient pas été inactivées sont révélées par des anticorps spécifiques qui sont couplés à des molécules Si un fluorescentes cellul - Test d’immunofluorescence à technique d’immuno-marquage sanofi pasteur Q_0015970 produ § La présence de virus polio non inactivés peut être révélée par simple observation microscopique car ce virus 046 VACCIN RABIQUE (DIPLOIDES) - SUSPENSION VIRALE INACTIVEE - TEST INDIRECT DU CONTROLE D'INACTIVATION : AMPLIFICATION SUR CELLULES DIPLOIDES HUMAINES (MRC5) Figure 8 Absence d'ECP, culture Annexe 2: PHOTOS DESlors deIFl’infection provoque des effets cytopathiques RESULTATS Dans celulaire confluente Microscope à fluorescence Témoin Cellules Témoin Virus l’ECP Dans utilisé objectif x10 l’incub objectif x20 Absence d’ECP – nappe cellulaire Figure ECP –9diminution ECP, diminution de cellules de intègre cellules vivantes vivantes Cellules positives en fluorescence virus rabique  3 PRINCIPE Les endotoxines sont des fragments de la membrane externe des bactéries à Gram n TESTS D’INNOCUITE CHAPITRE QUATRE Test d’Endotoxine constituées entre autre de lipopolysaccharides (LPS), partie biologiquement 38 active. A une température de 37 ± 1°C, ces endotoxines activent une proenzyme contenue LAL. L’enzyme activée provoque indirectement la libération de para-nitroaniline (p d’un substrat chromogène incolore contenu dans ce même réactif. La pNA libérée, d jaune, est mesurée par un spectrophotomètre à 405 nm, pendant toute la durée de l’ corrélation log/log entre les valeurs individuelles des temps de Réaction (Tr) pour c Lysat d’amoebocytes de limule (LAL), un réactif clef. et la concentration en endotoxines (C) est linéaire entre 0,005 et 50 UI/ml. Contexte à Dosage des endotoxines bactériennes (bactériesLaGram négatives) concentration par cinétique en endotoxines colorimétrique dans un échantillon (test à partir d est donc calculée de limulus). de réaction (Tr) par comparaison avec les Temps de réaction des solutions de la standard en endotoxines. Pourquoi à Les normes de la pharmacopée imposent l'absence de substances pyrogènes susceptibles de provoquer une augmentation de la T°C corporelle comme notamment TR les Ech 1 endotoxines des bactéries gram -, Temps de réaction constituées du LPS. TR Ech 2 Principe à Gamme étalon § Les endotoxines sont des fragments de la membrane externe des bactéries à Gram négatif et sont constituées entre autres de lipopolysaccharides (LPS), partie biologiquement active. § A une température de 37°C, ces endotoxines activent une proenzyme contenue dans le réactif LAL. Le réactif LAL correspond à de l’extrait de Lysat d'Amébocytes de Limules, ces cellules sont C1contenues C2 dans Concentration l’hémolymphe (sang) des limules. Schéma simplifié de la cascade de réactions : § L’enzyme activée provoque indirectement la libération de para-nitroaniline (pNA) à partir d’un (1) Pro-coagulase (incolore) ---------------------> coagulase active substrat chromogène incolore contenu dans ce Endotoxines même réactif coagulase active § La pNA libérée, de couleur jaune, est mesurée par un (2) Substrat chromogène + H2O ------------------------> pNA (jaune) + peptide spectrophotomètre à 405 nm, pendant toute la durée de l’incubation TESTS D’INNOCUITE CHAPITRE QUATRE Test d’Endotoxine 39 sanofi pasteur Q_0034911 DOSAGE DES ENDOTOXINES DES BACTERIES GRAM NEGATIF PAR CHROMOGENIE CINETIQUE (LIMULUS TEST) Dosage par cinétique colorimétrique. 3 PRINCIPE Les endotoxines sont des fragments de la membrane externe des bactéries à Gram négatif et sont Automa2sa2on possible de la méthode Principe à constituées entre autre de lipopolysaccharides (LPS), partie biologiquement active. § La concentration provoque indirectement la libérationen endotoxines A une température de 37 ± 1°C, ces endotoxines activent une proenzyme contenue dans le réactif LAL. L’enzyme activée de para-nitroaniline (pNA) à partir dans un échantillon est calculée à partir de son Temps de réaction (Tr) par à 405 nm,comparaison d’un substrat chromogène incolore contenu dans ce même réactif. La pNA libérée, de couleur jaune, est mesurée par un spectrophotomètre avec pendant toute la durée de l’incubation. La les Temps de réaction des solutions de la gamme standard en corrélation log/log entre les valeurs individuelles des temps de Réaction (Tr) pour chaque réplicat endotoxines. et la concentration en endotoxines (C) est linéaire entre 0,005 et 50 UI/ml. La concentration en endotoxines dans un échantillon est donc calculée à partir de son Temps de réaction (Tr) par comparaison avec les Temps de réaction des solutions de la gamme standard en endotoxines. TR Ech 1 Temps de réaction TR Ech 2 Gamme étalon Concentration (UI/mL) C1 C2 Schéma simplifié de la cascade de réactions : § A la différence coagulase (1) Pro-coagulase (incolore) ---------------------> Endotoxines du LAL, active le réactif rFC est un réactif synthétique, qui ne (2) Substrat chromogène + H O repose coagulase active pas sur un lysat ------------------------> pNA (jaune) + peptide 2 produit à partit d’une espèce de limule , menacée d’extinction dans plusieurs régions du monde. Equation globale de la réaction en régression linéaire : log[E ] = log Tr − pente Y int § La méthode rFC représente donc un pas de plus vers la n non contrôlée Légende : réduction de l’utilisation [E] = Concentration en endotoxine pour une solution donnée.d’animaux. Méthode alterna2ve Tr = Temps de réaction moyen pour un duplicat donné. TESTS D’INNOCUITE CHAPITRE QUATRE Test de Mycoplasme 40 Recherche de mycoplasmes par culture microbiologique. Contexte à Mise en évidence de genre de bactérie caractérisé par l'absence de paroi cellulaire via les techniques de cultures microbiologiques Principe à La recherche des mycoplasmes comporte trois étapes : § Une phase d'inoculation directe du produit à analyser sur milieu gélosé § Une phase d'enrichissement : le produit à tester est inoculé dans un milieu liquide pour favoriser la multiplication des mycoplasmes éventuellement présents § Une phase de subculture : à différents pas de temps, le milieu liquide d'enrichissement inoculé à J0 est ensemencé sur milieu solide afin de mettre en évidence la présence de colonies de mycoplasmes Des souches de mycoplasmes calibrées (Mycoplasma pneumoniae, Mycoplasma orale, Acholeplasma laidlawii) sont utilisées comme témoins pour tester, d'une part la qualité́ des milieux et d'autre part l'efficacité des conditions expérimentales. TESTS D’INNOCUITE CHAPITRE QUATRE Test de Stérilité 41 Détection de germes bactériens et fongiques. Contexte à Détecter la présence de microorganismes vivants : bactéries, levures et moisissures MAIS ne permet pas de détecter les virus, les mycoplasmes ou certaines bactéries fastidieuses Principe à Vérifier l’absence complète de microorganismes revivifiables en ensemençant une quantité déterminée du produit à examiner dans les milieux de culture 2 méthodes à § Filtration sur membrane pour les produits filtrables § Ensemencement direct pour les produits non filtrables Ensemencement direct Filtration sur membrane – système Steritest TESTS D’INNOCUITE CHAPITRE QUATRE Test de Stérilité 42 Détection de germes bactériens et fongiques. Principe à Filtration sur membrane Ensemencement § S'il y a présence de micro-organismes direct bactérien et/ou fongique dans Prémouillage de la membrane l'échantillon, ils provoqueront un Filtration du produit sur une membrane afin de retenir trouble du milieu initial et/ou une les microorganismes éventuellement présents et de les croissance en surface et/ou un dépôt au mettre en évidence. Ensemencement de fond du Stéritest. chaque flacon de milieu Rinçage par du Fluid A (en général 3x100 mL) afin d’éliminer les conservateurs et autres inhibiteurs de (trypticase-soja et croissance potentiellement présents dans le produit thioglycolate+résazurine) par le produit. Ajout des milieux de culture dans chaque canister : un avec du milieu trypticase-soja et un autre avec du milieu thioglycolate + résazurine (cas particulier des produits merthiolatés) Incubation 14 jours à 2 températures : + 20 - + 25°C (trypticase-soja) et + 30 - + 35°C (thioglycolate+résazurine) Filtration sur membrane - Steritest Lectures : J3, J4 ou J5 puis J7 ou J8 et J14 TESTS D’INNOCUITE CHAPITRE QUATRE Test de Stérilité 43 Vérifier l’absence de microorganismes.  Essai de toxicité spécifique sur cellules Principe : Test de détoxification Virologie TESTS D’INNOCUITE L’échantillon à analyser 44 est réparti spécifique, est introduite dans une partie L’essai de toxicité spécifique sur cellules est une technique de virologie. CHAPITRE QUATRE L’essai de toxicité spécifique sur cellules permet de vérifier l’innocuité du vaccin liée à so principe actif. Il permet de vérifier la détoxification du vaccin. Principe : Essais de toxicité sur cellules. L’échantillon à analyser est réparti dans des puits. Une dose d’anticorps anti-toxin spécifique, est introduite dans une partie des puits. Si la toxine est encore présente (mauvais Contexte à Vérifier l'absence de toxine, obtenue après inactivation, par une réaction colorimétrique détoxification) elle forme un complexe ave § Exemple : Absence de toxicité de l’anatoxine diphtérique l’anticorps, elle perd ainsi son pouvoir d’infectio des cellules. Il s’agit de l’étape de neutralisation. Une suspension cellulaire est introduite dan Définition à Une anatoxine est une molécule dérivée d'une toxine de micro-organisme chaque puits. Dans les puits non neutralisés, s’il y caractérisée par la perte de ses propriétés toxiques tout en ayant conservée sa structure etprésence de toxine, les cellules sont infectées meurent. des propriétés immunisantes Les cellules viables sont révélées grâce à u colorant. Plus la coloration est forte plus le nomb Principe à de cellules viable est important. § L’échantillon à analyser est réparti dans des puits La coloration est lue par spectrophotométrie. § Une dose d’anticorps anti-toxine spécifique, est introduite dans une partie des puits. Si la Si la DO des puits non neutralisée est inférieure un seuil critique (nombre de cellules viables tro toxine est encore présente (mauvaise détoxification) elle forme un complexe avec faible), alors que la DO des puits neutralisés es elle bien supérieure au seuil critique, l’échantillo l’anticorps, elle perd ainsi son pouvoir d’infection des cellules. Il s’agit de l’étape de présentait une cytotoxicité spécifique. neutralisation. La neutralisation permet de vérifier qu’il s’agit bie d’une cytotoxicité liée au principe actif (anticorp § Une suspension cellulaire est introduite dans chaque puits. Dans les puits non neutralisés, spécifique) et non une contamination. s’il y a présence de toxine, les cellules sont infectées et meurent. § Les cellules viables sont révélées grâce à un colorant. Plus la coloration est forte plus le nombre de cellules viable est important. La coloration est lue par spectrophotométrie. Propriétés du test : § La neutralisation permet de vérifier qu’il s’agit bien d’une cytotoxicité liée au principe actif Durée de mise en œuvre de quel sensibilité et précision (anticorps spécifique) et non une contamination.  qPCR ou B TESTS D’INNOCUITE CHAPITRE QUATRE Dosage ADN résiduel La qPCR est une méthode de PC 45 technique de biologie moléculaire qu qPCR permet donc de quantifier l’AD (ADN résiduel des cellules hôtes, r Dosage par la biologie moléculaire. l’ADN du patient) ou pour quantifier l’ La qPCR est une méthode moderne Contexte à Quantification de l’ADN résiduel par PCR quantitative (qPCR) à pour le moment. § Technique de biologie moléculaire qui amplifie l’ADN afin de mieux le quantifier § Pour recherche de contaminants (ADN résiduel des cellules hôtes,) ou pour quantifier l’ADN total dans le produit (caractérisation produit) Principe : 3’ 5’ Principe à (1) § La qPCR utilise le même principe que la PCR classique pour amplifier la quantité 5’ 3’ d’ADN 3’ 5’ § La quantification se fait par détection d’une fluorescence induite à 5’ 3’ Une sonde sur laquelle sont fixés un fluorochrome (molécule émettant de la 3’ 5’ fluorescence) et un « extincteur » est ajoutée au mélange réactionnel. (2) Lorsque les deux molécules sont liées à la sonde, l’extincteur joue son rôle et aucune 5’ 3’ florescence n’est émise 3’ 5’ § (1) La polymérisation de l’ADN entraîne la dégradation de la sonde et donc la (3) 5’ 3’ libération du fluorochrome § (2)(3) La fluorescence émise est mesurée grâce à un spectromètre de fluorescence La quantité de fluorescence observée est liée à la quantité d’ADN présente dans Quencher Fluorochrome actif l’échantillon. Brin ADN de départ Fluorochrome inactif Nouveau brin d’ADN  Le pH-mètre est composé d’une sonde de pH constituée d’une électrode de v électrode de référence. Le pH-mètre enregistre la différence de potentiel e pH et Osmolalité électrodes et la convertit en pH. TESTS D’INNOCUITE Avant de réaliser des mesures le pH-mètre doit être étalonné. La46 sonde de pH P CHAPITRE QUATRE l’eau distillée (pH neutre) pour éviter toute contamination puis immergée dans solution de pH connue. Le pH-mètre enregistre la valeur de pH correspondante. Programme La sonde est de nouveau rincée à l’eau distillée puis immergée dans une deux Le Master 2 « Contrôle Qualité des Produits de Sa de pH connue. Le pH-mètre enregistre cette deuxième valeur de pH. 550 heures de formation réparties sur 12 mois. UE1 : Contrôles physico-chimiques et de pharma médicaments Se rapprocher des conditions physiologiques. - Méthodes spectrales de contrôle La sonde est de nouveau rincée à l’eau distillée puis immergée dans la solutio - Méthodes d’étalonnage analytique - Méthodes statistiques et de validation Le pH-mètre affiche alors la valeurPrésentation du pH de la solution. Quels métiersSi ? le pH est supérieur UE2 : Microbiologiques appliquée aux contrôles ments et de l’environnement industriel - Contaminants et sources de contamination - Contrôles microbiologiques (matières première est dite acide, inférieure à 7 elle est basique et égale à 7 elle est neutre. Le Master 2 « Contrôle Qualité des Médicaments » est spécifiquement orienté vers les aspects de Vous pourrez postuler à différentes fonctions dans les établissements phar- produit fini, environnement) - Traitement des résultats hors spécifications Contexte à maîtrise de la qualité qui s’appuie sur les réfé- maceutiques dans les services dédiés - Efficacité des désinfectants selon les normes eu aux : rentiels généraux et spécifiques en vigueur. Le - Sécurité virale domaine d’application couvre l’ensemble des Idéalement les solutions de référence doivent encadrer le pH de la solutio Contrôle qualité, sur des postes de médicaments d’origines naturelles, ceux issus chargé du contrôle qualité ou de respon- UE3 : Assurance et management de la qualité de la synthèse chimique et des biotechnologies. sable de laboratoire de contrôle qualité. Les conditions physico-chimiques du produit doivent (exemple respecter les d’un conditions physiologiques - Présentation générale des référentiels de qualité aux médicaments. : pour la mesure pH attendu à 5 on pourra utiliser une solution Affaires réglementaires, sur des - Bonnes Pratiques de Fabrication (BPF), Bonnes Rythme de l’apprentissage postes de responsable affaires régle- mentaires ou technico-réglementaire. Laboratoire (BPL) et Bonnes Pratiques Cliniques Fin Septembre et à Mi-Octobre : 4 semaines - Les outils Qualité humaines en terme de pH et d’osmolalité solution pH 7) de cours Recherche et développement, Novembre à Juillet : 2 semaine de cours / en développement analytique. UE4 : Affaires Réglementaires 3 semaines en entreprise - Présentation de l’autorité réglementaire Août : plein temps en entreprise Pharmacien Responsable - Fonctions d'inspection des fabricants de médic Septembre : 2 jours (soutenances orales l’autorité réglementaire de fin d’études) Tous nos métiers sur www.leem-apprentissage.org - Choix des conditionnements pharmaceutiques - Cas des médicaments génériques Contrôle des connaissances - Le dossier d’enregistrement CTD et ses variatio Selon les matières : examen écrit terminal, UE5 : Anglais § L’osmolalité doit se rapprocher de 290 mosm/kg soutenance orale ou contrôle continu Mémoire avec soutenance devant un jury UE6 : Projet tuteuré : Mise en situation à travers mixte (enseignants et professionnels) mise en place du Module 3 du dossier d’enregist UE7 : Apprentissage en entreprise § Le pH doit être proche de 7,35 Osmose et tonicité dans les liquides corporels Mesure de pH Hypotonique Isotonique Hypertonique Propriétés du test : Rapide et simple d’utilisation Utilisation : Mesure de pH → Tous les vaccins et solutions injectables  47 Pause  Au Programme 48 INTRODUCTION TESTS D’IDENTITE TESTS D’EFFICACITE CHAPITRE UN CHAPITRE DEUX CHAPITRE TROIS TESTS D’INNOCUITE CAS CONCRET QUESTIONS ? CHAPITRE QUATRE CHAPITRE CINQ CHAPITRE SIX CAS CONCRET n°1 CHAPITRE CINQ Profil de contrôle du vaccin POLIO 49 Informations générales. - La poliomyélite, également appelée paralysie spinale infantile ou simplement polio, est une maladie infectieuse aiguë et contagieuse spécifiquement humaine causée par le poliovirus sauvage. - Vaccin fabriqué à partir d’une suspension virale purifiée et inactivée Construction du profil de contrôle d’un vaccin inactivé contre la poliomyélite  Le contrôle des lots de production est réalisé grâce à trois types de contrôles : - Les contrôles libératoires, réalisés à la fin des différentes étapes de fabrication par le contrôle Profil de contrôle du vaccin POLIO qualité, un lot de vaccin ne pourra être libéré que si les contrôles libératoires sont validés CAS CONCRET n°1 - Les contrôles IPC (In Process Control), réalisé par le producteur sur la chaîne de production. Ils permettent de vérifier le bon déroulement de la production. En cas de détection d’un problème 50 CHAPITRE CINQ grâce à un test IPC la production peut être arrêtée (évite de devoir attendre le résultat des tests de contrôle) - Les contrôles de monitoring, réalisés par le producteur sur la chaîne de production. Ils permettent d’ajuster certains paramètres si nécessaire (ex : si une culture cellulaire n’est pas arrivée au bon niveau de pousse, le temps d’incubation est allongé). Les contrôles des lots de production ont pour but d’assurer l’identité du principe actif, l’activité du vaccin Vue globale du process. et l’innocuité du vaccin. Tous les tests ne sont pas réalisés au même moment. Par exemple, on retrouve les tests de sécurité majoritairement au niveau du produit réparti. banque cellulaire et virale culture cellulaire culture virale culture récolte récolte purification produit purifié inactivation produit inactivé formulation produit formulé répartition Figure 1 Les contrôle tout au long de la fabrication du vaccin produit réparti CAS CONCRET n°1 CHAPITRE CINQ Profil de contrôle du vaccin POLIO 51 Vue globale du process. dosage identité contenu test