Méthodes séparatives chromatographiques PDF 2023/2024

29/01/2024 13h30-15h30 L2 Pharma Pr Catherine DEFOORT 2023/2024 UE02-Méthodes instrumentales, Principes physiques et applications Méthodes séparatives chromatographiques Rédacteurs : Yassamine ZEMMIRI/ Inès JAMAJ Ronéo n°2...

29/01/2024 13h30-15h30 L2 Pharma Pr Catherine DEFOORT 2023/2024 UE02-Méthodes instrumentales, Principes physiques et applications Méthodes séparatives chromatographiques Rédacteurs : Yassamine ZEMMIRI/ Inès JAMAJ Ronéo n°23 Nombre de pages : 21 PLAN 1. INTRODUCTION 2. TECHNIQUES CHROMATOGRAPHIQUES 1. Historique 2. Aspects Généraux : 1. Définition 2. Classification des méthodes 3. Principes généraux 4. Etude théorique 1. Etude de la répartition d’une substance au cours de la migration 2. Efficacité d’une colonne 3. Analyse qualitative 4. Analyse quantitative 1  I. INTRODUCTION La chimie analytique permet d’analyser les constituants d’un échantillon d’origine biologique, environnemental. Elle se retrouve beaucoup dans l’industrie agroalimentaire… Les méthodes séparatives permettent de distinguer les différents constituants de l’échantillon. Après cette séparation, il faut effectuer l’analyse : il y a une partie identification (l’analyse qualitative) et une partie quantification. Une étape n’exclut pas l’autre. Elles peuvent s’appliquer sur un mélange homogène ou hétérogène. Méthodes classiques de séparation : - Extraction - Précipitation (on peut ensuite réaliser une quantification par gravimétrie) - Distillation L’analyse quantitative dans les méthodes classiques peut être faite par gravimétrie ou titration ou méthode volumétrique. Ces méthodes ont besoin de peu au niveau instrumental contrairement aux méthodes instrumentales. Méthodes instrumentales : - Séparation : chromatographie en phase gaz (CPG), liquide (HPLC) avec une colonne, électrophorèse, spectrométrie (elle allie la chromatographie, on la verra en physique) - Spectroscopiques : UV Visible, IR, RX, Fluorescence, Phosphorescence - Electroanalytiques : ampéromètrie, potentiométrie, conductimétrie, coulométrie, voltamétrie , electrogravimétrie. Comment choisir la méthode que l’on va utiliser ? Cela dépend du mélange, de la routine, de ce que l’on veut étudier et surtout à la gamme de concentration à laquelle on s’adresse. Plus on descend en gamme de concentration, plus la méthode devra être sensible telles que ka chromatographie et la spectrométrie atomique. La gravimétrie à l’inverse, s’adresse à des concentrations élevée (mesure du précipitât). 2  II. TECHNIQUES CHROMATOGRAPHIQUES Ces méthodes séparatives utilisent les outils chromatographique (concentrations qui peuvent aller jusqu’à 10-10g/L). 1. Historique Un colorant a été déposé sur une colonne qui contenait du carbonate de calcium. Pour faire migrer ce colorant, il a utilisé de l’éther de pétrole. Les termes phases mobiles et stationnaires ne s’appelaient pas comme ça à l’époque. Le tube de carbonate de calcium correspond à la phase stationnaire actuelle et c’est la phase mobile qui va aider à faire descendre ce qui est déposé en haut de la colonne. Un botaniste a voulu séparer un extrait végétal qu’il a déposé sur une colonne ou il avait mis du carbonate de calcium, et il a essayé de séparer certains composés en faisant couler de l’éther de pétrole. Il s’est rendu compte qu’il y avait au MOINS deux parties qu’il pouvait séparer 1980 : chromatographie en fluide supercritique : de plus en en plus développé, va être développé plus tard. Le botaniste a remarqué qu’en faisant descendre l’extrait végétal à travers la colonne il avait réussi à séparer les différents constituants. Même colonne à des temps différents. Séparation est de plus en plus prononcée. L’éluant permet de récolter un constituant puis l’autre. 2. Aspects généraux 2.1 Définition Carbonate de calcium : phase stationnaire qui est immobile, qui ne va pas bouger. On fait passer à travers cette phase stationnaire une phase mobile. C’est ce qui va caractériser la chromatographie aussi bien liquide que gazeuse. La séparation va se faire par la différence de progression dans la phase stationnaire. La chromatographie st caractérisée par l’utilisation d’une phase stationnaire et d’une phase mobile. 3  2.2 Classification Nature des phases : - Phase mobile, par définition est un fluide: fluide gaz, liquide, fluide supercritique. - Phase stationnaire : solide ou liquide Une chromatographie émerge avec l’utilisation du fluide supercritique. Natures des phénomènes : - Chromatographie d’adsorption - Chromatographie de partage - Chromatographie change d’ions - Chromatographie d’exclusion-diffusion : à partir du moment où les poids moléculaires sont suffisamment éloignés Nature des procédés : - Sur colonne (HPLC ou CPG) - Planaire (CCM) ( simple à mettre en œuvre, limitante mais a été automatisé et peut permettre une quantification. ) Les chromatographies sont automatisées et très utilisées en laboratoire. 2.3 Principes généraux Sur une colonne, il y a différents plateaux, et à chacun de ces plateaux un équilibre se crée entre la phase stationnaire et la phase mobile. Le paramètre K est le coefficient de partition ou d’équilibre entre la phase stationnaire (Cs) et la phase mobile (Cm). Concentration du soluté entre la phase stationnaire et la phase mobile Partition jusqu’à l’équilibre entre les deux phases stationnaires et mobile Coefficient de partition ou coefficient d’équilibre. Cs : concentration phase stationnaire soluté Cm : concentration phase mobile soluté S’il n’est pas du tout attaché à la phase stationnaire, tout passe avec la phase mobile et Cs va être tout petit et Cm sera grand. 4  Plus K est grand, plus le composé sera fortement adsorbé sur la phase stationnaire, il ne sera pas beaucoup entrainé par la phase mobile. K majuscule pas minuscule Il permet de visualiser l’accroche à la phase stationnaire. On l’utilise peu en pratique. A l’examen on nous demande une vision globale, donc on peut nous demander des éléments vus en TP. 2.4 Études théoriques A. Etude de la répartition d’une substance au cours de la migration Quand on observe la répartition d’une substance au cours de la migration, on observe que Cs en fonction de Cm correspond la plupart du temps à un phénomène linéaire représenté par : Avec : K correspond à la pente de la droite. La relation linéaire est idéale, si on a bien toutes les conditions correspondant aux concentrations. On va à présent étudier des isothermes de distribution : Avec K=1, la droite est parfaitement linéaire. On a une relation directe avec K=1, ce qui correspond en pratique à un pic parfaitement symétrique, idéale. Ces diagrammes représentent le comportement d’un ou plusieurs composés selon des condition opératoires. 5 K est inférieur à 1 et le pic est moins joli. En effet, on n’observe pas de symétrie mais ce qu’on appelle une trainée qui a lieu après le pic. On n’accepte pas ce genre de diagrammes, en générales c’est que les conditions opératoires sont mauvaises. La séparation ne se fait pas linéaire, le facteur K n’est pas égal à 1, on n’a pas un rapport concentration phase stationnaire phase mobile correct, ça vient donc des conditions de chromatographie, ou d’un problème au niveau de l’appareil. Si la trainée devient trop importante, cela peut perturber la séparation des différents pics, la quantification. Il faudra modifier les conditions chromatographiques. Pour résoudre ça on peut modifier les conditions (à faire avant de modifier l’appareil). Il s’agit d’un isotherme convexe. Quand K augmente, notre composé est plus retenu sur la phase stationnaire. Le pic est beaucoup symétrique. La symétrie a lieu en sortie de colonne. Le pic a du mal à sortir de la colonne et la trainée a lieu avant le pic, trop retenu par la phase stationnaire. Suivant la trainée on peut déterminer si les conditions sont satisfaisantes, si cela ne compromet pas la quantification et la séparation. 6 Exemple de chromatogramme dit idéal, on ne fait pas la distinction de phase liquide ou gazeuse. Au tout début, c’est le 0 : c’est le moment ou on injecte notre préparation. TR : temps de rétention entre le lancement de la chromatographie jusqu’au temps auquel sort le pic, on prend le sommet du pic comme référence. Il va de 0 au temps correspondant au sommet du pic ( soit le milieu ). ( il se définit par la hauteur du pic ) TM : temps mort est le temps qu’il faut à un contenu non reconnu par la phase stationnaire pour traverser la colonne. Si la colonne fait 10 cm, ce composé peut mettre 3/4s, si la colonne est plus grande, le temps mort va augmenter. Temps parcouru par le solvant sans être reconnu. T’ : pas toujours utilisés : tm : pic du solvant qui contient le composé : on s’arrange pour qu’ils ne perturbent pas l’analyse. (si sa détection est très importante et que le pic du solvant déborde sur la détection des autres pics c’est problématique.) On ne voit pas toujours le pic du temps mort. Ce pic peut également être un constituant de la phase mobile (pas du tout retenu par la phase stationnaire) un composé qui n’est pas retenu ne nous intéresse pas. Si on a dans notre échantillon, un composé très peu retenu et un très retenu, on modifie les conditions opératoires. On peut aussi utiliser la hauteur du pic. Pour que cette hauteur de pic soit utilisable de manière quantitative, on ne prend pas que la pointe du pic mais on redéfini une hauteur du pic par les deux tangentes au bord du pic. La hauteur du pic est ainsi l’intersection de ces deux tangentes. 7 Le pic vert est plus homogène, il est moins large que le bleu, il sort plus joliment. La largeur du pic est donc importante. On utilise notamment la largeur du pic à la base ou à mi-hauteur. On considère h’2 que l’on divise mathématiquement par 2. Ensuite on mesure la largeur du pic à mi- hauteur. Toutes ces mesures servent au calcul de certains paramètres. La largeur du pic à la base est mesurée à l’aide du pic formé par les tangentes et on mesure I 2. Pourquoi retracer la hauteur : quand les pics ne sont pas totalement symétriques, à surface identique, il vaut mieux avoir un pic plus fin qu’un pic plus large car l’algorithme va l’identifier à un triangle. On peut essayer de modifier les conditions opératoires mais la recherche d’un triangle par l’algorithme va fausser les résultats. On utilise le TR brut qui démarre du 0 au sommet du pic. Il existe le temps de rétention corrigé qui enlève le temps de rétention du temps mort. On utilise aussi le volume de rétention du pic (Vr). ( on parle de volume de rétention brut comme de temps brut ). Les temps sont en secondes voire en minutes, le volume est en millilitres. Facteur de rétention k’ : spécifique à un composé donné, c’est ce qui est retenu par la phase stationnaire. Il est exprimé en fonction du volume mais on peut l’exprimer en fonction des temps de rétention. Concrètement si on diminue fortement le k’ à l’aide des conditions opératoires, le composé va traverser rapidement la phase stationnaire et n’est pas retenu suffisamment. Si le k’ est trop important le composant est trop accroché à la phase stationnaire, si la composition de la phase mobile ne permet pas de la détacher de la phase stationnaire suffisamment rapidement, k’ devient trop important. Les valeurs idéales de k’ sont entre 1 et 5. Quel est l’inconvénient d’un composé trop retenu : - Facteur temps est trop important en effet, on a des centaines d’échantillons à analyser. - On utilise trop de solvants organiques parce que c’est trop long donc c’est trop cher. - Facteur environnement est de plus en plus important Il faut ajuster le k’ en variant les conditions opératoires, la nature de phases. 8 Facteur de capacité k’ : Plus k’ est bas, moins le composé sera retenu par la phase stationnaire. ( compris entre 1et 5 ) D’autres facteurs impactent la capacité : - Séparation optimale pour k’ compris entre 1 et 5 - Ajustement de k’ en jouant sur la nature des phases, la température ou la colonne - Attention k’ ≠ capacité de la colonne (quantité maximale de substance que peut fixer la colonne) Ce qui est dans les cadres bleus est à connaitre. Facteur de sélectivité a nous donne une idée de la séparation des deux pics. Il ne faut pas qu’un pic sorte au bout d’une minute et l’autre au bout de 10 minutes. K’2 : tr plus éloigné K’1 : tr du composé qui sort le plus rapidement. Si alpha est égal à 1, les coefficients de partage sont égaux, résolution impossible car les 2 solutés vont sortir en même temps quelque soit l’efficacité de la colonne. En général, alpha entre 1,1 et 2 4) La résolution : c’est l’aptitude du système à séparer des mélanges. Elle dépend des constituants à séparer. Elle permet de juger de l’efficacité d’une colonne (question en exam l’an dernier : résolution en faisant parti) Le rouge diffuse, il correspond à un pic qui s’étale. La résolution dépend non seulement de la distance qui sépare chaque pic mais aussi de la largeur de chacun des pics. Sur le schéma du bas, les couleurs diffusent, la résolution n’est pas correcte. 9  1 : Les deux pics sont proches, ils sortent à des temps proches mais sont suffisamment séparés pour faire par la suite une quantification. La largeur du pic représentée par oméga est suffisamment petite pour que la résolution soit acceptable et que la quantification soit correcte. 2 : Les sommets des pics peuvent s’aligner que ce soit le pic a ou b, ils s’alignent. La largeur des pics à la base est beaucoup plus grande et il se chevauchent. Ainsi, la séparation et la quantification ne seront pas correctes. Ce sont les largeurs des pics et le temps de rétention qui interviennent sur la résolution. 3 : La distance entre les temps de rétention est plus petite, la largeur du pic est plus petite et la valeur absolue du temps de rétention de chacun des pics sont trop proches pour que la séparation se fasse correctement. Omega A et B : largeur du pic à la base : ce qui peut faire varier la largeur des pics : la concentration Delta A et B : largeur du pic à mi-hauteur. Le facteur de résolution se calcule entre deux pics, dépend de la largeur du pic à la base de chacun des pics et de la distance entre les pics. La résolution se calcule entre 2 pics. Une seule résolution est égale à 2 pics. Les logiciels d’optimisation de conditions opératoires font une moyenne des résolutions pour voir si les conditions sont acceptables ou non. Si on considère la largeur du pic à mi-hauteur, on utilise le facteur de multiplication 1,18 au lieu de 2 si on le prenait à base. Plus R est élevé, meilleure est la résolution, pour que la résolution soit acceptable R doit être > 1,5. En utilisant la méthode des tangentes, on peut mieux définir omega. Pour le delta, on divise en 2 la valeur de la hauteur du pic ( H/ 2 ). Peut tomber en exercice. 10  Le chromatogramme bleu indique une bonne séparation et une bonne quantification. S’il n’y a pas de retour à la ligne de base (vert et rouge), il n’y aura pas de bonne quantification Plus R est élevé meilleure sera la résolution, elle doit être > 1,5* La résolution entre 2 pics est un paramètre de l’efficacité de la colonne. Pour l’examen , il faut écrire la relation concernant le Rs , pas besoin de perdre du temps à écrire toutes les relations, écrire seulement celle qui sert. Aussi écrire le calcul comme ça les profs voient ou était l’erreur et peuvent réajuster la notation. Et ne pas oublier la conclusion. 5 ) Nombre de plateaux théoriques : N et HEPT (hauteur équivalente à un plateau théorique) N dépend du type de la colonne et de la constitution de la phase stationnaire. ( N se calcule pour un pic donné ) S’il n’y avait pas de plateaux, le composé passe à travers les plateaux et être plus ou moins retenu suivant les matériaux de la phase stationnaire et les composants de la phase mobile. Il y a un nombre de plateaux théoriques N qui dépend du matériau de la phase stationnaire et la HEPT est fonction de N et de la longueur de la colonne. 11 Plus le nombre de plateaux est petit, plus le HEPT sera grand. Si on a une colonne toute petite, on a des HEPT qui sont grandes. Cela veut dire que le nombre de plateaux théoriques est petit. On souhaite une HEPT petite (donc beaucoup de plateaux) pour qu’il y ait beaucoup de N et que la séparation se fasse mieux mais pas trop sinon le passage à travers le plateau théorique va être très long. On joue sur le N et HEPT si la colonne est toujours de la même longueur. On utilise un N moyen selon le temps de rétention et la largeur à la base. (plus N est élevé meilleure sera la rétention). Le HEPT se calcule en utilisant ce N et la longueur de la colonne. Il faut connaitre les formules N et HEPT, 16 pour oméga, 5,54 pour delta. La longueur de la colonne doit toujours être en millimètres. La chromatographie pour laquelle les colonnes sont les plus longues est la chromatographie en phase gaz. Ce sont des colonnes dites capillaires un peu comme une bobine de fils (le fil doré est embobiné). On peut avoir des colonnes, de 25m et plus. En général, on ne montre pas la colonne sur l’appareil car les colonnes sont dans un four afin d’être maintenues à température constante. Sur ce type de colonne avec une longueur très importante (25m = 25 000cm) et un nombre de plateaux théoriques de 1000 000, on a un HEPT de 0,25mm. Une chromatographie phase liquide (CPL) est une chromatographie où on ne met pas de pression contrairement à l’HPLC. Elle peut faire 50 cm voir 1m couramment. La phase mobile traverse la colonne simplement par gravimétrie. On arrive à un nombre de plateaux assez bas mais une HEPT assez importante (5mm). Donc ce n’est pas une séparation idéale. On fait surtout de la séparation avec ce type de chromatographie. On peut poser des quantités plus grosses, on fera plus de la purification. Une petite colonne de chromatographie liquide haute pression, elle peut faire de 5 à 30 couramment. Ici, le N est plutôt de 5 000 et 12  l’HEPT est assez petite (0,02mm) donc on arrive à une bonne séparation. On se sert encore de celle du milieu pour purifier un produit c’est-à-dire séparer les impuretés du constituant ou l’inverse c’est-à-dire que les impuretés passent et ensuite on récupère le constituant. Il arrive très souvent dans le milieu industriel d’associer les deux types de chromatographie. Et puis, sur ces colonnes-là, on peut déposer des quantités importantes. On a un composé qu’on a synthétisé en grande quantité, on sait qu’il y a une impureté qui va pouvoir être éliminée de cette manière-là. Donc on va déposer de l'ordre du gramme ou dizaines de grammes en haut de cette colonne, on fait partir l’impureté et on récupère ensuite le composé qui nous intéresse. Comme on est en phase liquide, il se peut qu’on fasse une lyophilisation pour obtenir le composé sous forme de poudre et on va pouvoir en dissoudre une partie et l’analyser en HPLC pour voir s’il y a qu’un pic qui sort ou s’il y a encore des impuretés (si oui, quel pourcentage...). En biologie, s’est surtout la chromatographie liquide (HLPC) qui est utilisé et CPG éventuellement selon le type de substrat que l’on analyse. A retenir : le facteur de résolution, k’ et HEPT -> ce que cela signifie, comment on le calcule et quelles sont les valeurs idéales de chacun de ces paramètres. B. Efficacité d’une colonne THÉORIE DES COLONNES : On peut juger, pour des conditions opératoires déterminées, de l’efficacité d’une colonne, c’est-à-dire de l’efficacité pour le mélange que l’on veut utiliser. Cette théorie est utilisée pour expliquer la forme des pics. Pour cela, on utilise l’HEPT et le Rs. Donc En fait cet état d’équilibre, dans la théorie des plateaux , ne peut jamais être atteint en présence d’une phase mobile en mouvement continu. Et le Rs équivaut à THÉORIE CINÉTIQUE : (Plus pour ceux qui vont faire l’internat) : cette notion de plateaux théorique a été remis en question pour arriver plutôt à une notion de théorie cinétique. Il y a eu changement de théorie car cet état d'équilibre, dans la théorie des plateaux, ne peut jamais être atteint en présence d'une phase mobile en mouvement continu et qu'au niveau de chacun des plateaux il peut y avoir soit une diffusion des constituants soit un retard à l’équilibre ou les deux. 13 Elle prend en compte : Phénomènes dynamiques : passage continu de la phase mobile dans la phase fixe Diffusion c’est-à-dire déplacement des régions les plus concentrées vers les moins concentrées Retards à l’établissement des équilibres Nécessité de prendre en compte : - La Vitesse d’écoulement de la phase mobile - Température, pression, nature colonne - Les Phénomènes de diffusion Il faut prendre en compte la vitesse d’écoulement de la phase mobile, la température à laquelle se trouve la colonne (changement de vitesse selon la température), la pression et les phénomènes de diffusion. A connaitre pour l’internat cette équation de Van Deemter : (chromatographie phase gaz +++) Une courbe découle de cette équation, c’est une hyperbole. C’est une façon de définir autrement la hauteur des plateaux théoriques, ce n’est pas seulement la hauteur de la colonne et le nombre de plateaux, il y a un certain nombre de paramètres qui vont être influencés par des paramètres opératoires (ex : température). A : Diffusion turbulente B : Diffusion longitudinale C : résistance au transfert de masse u : vitesse d’écoulement de la phase mobile en cm/s A est la diffusion turbulente : Notre colonne, même si l’on a l’impression que ce n’est qu’un fil, à l’intérieur il y a un revêtement. Et suivant la manière dont le revêtement a été posé, la diffusion de notre composé va se faire plus ou moins régulièrement. Maintenant on a des fournisseurs de qualité pour faire de la chromatographie. Si la qualité est mauvaise la phase stationnaire sera moins bien déposé dans la colonne et le résultat sera que ce facteur A pourra varier. Donc irrégularité de remplissage de la phase stationnaire. ( écoulement irrégulier de la phase mobile, irrégularités de remplissage et irrégularités phase S ), soluté dans la phase mobile donc la progression est irrégulière. 14  Le point bleu du haut passe de façon linéaire sans relativement faire trop de détour dans la phase stationnaire alors que celui du bas fait plus de détour et donc aura une diffusion turbulente importante dû au mauvais remplissage. Pour le facteur B qui est la diffusion longitudinale : On dépose un échantillon et s'il diffuse peu à travers la phase stationnaire, il va sortir un beau pic fin et symétrique alors que s’il diffuse de manière plus importante (B important) alors le pic sera moins beau. Puis nous avons C qui représente les inégalités de passage des molécules d’une phase stationnaire à une phase mobile et u qui est la vitesse d’écoulement de la phase mobile. Le retard à l’établissement des équilibres est d’autant plus grand que u est grande. De cette équation, on trace la courbe de Van Deemter : c’est la variation de la hauteur du plateau théorique en fonction du débit de la phase mobile. Le point optimal est celui qui a une hauteur théorique petite et un débit de phase mobile le plus petit aussi. Donc l’efficacité de la colonne va varier avec : - Vitesse d’écoulement de la phase mobile : u - Coefficients de diffusion dans la phase M et S - Diamètre des particules du support (phase stationnaire) - Épaisseur de la couche liquide sur phase support - Facteur de capacité : k' L’hyperbole va varier en fonction du gaz utilisé On peut toujours trouver un moyen d’optimiser la colonne pour une bonne séparation du mélange que l’on veut analyser : -réduire le diamètre des particules, -réduire l’épaisseur de la phase stationnaire, -assurer un remplissage le plus homogène possible Équation de Purnell (important pour l’internat) 15  Ça prend en compte le facteur de sélectivité et les k’ avec le nombre de plateaux théoriques. C’est une autre manière d’exprimer la résolution mais qui prend en compte la sélectivité alpha entre deux pics, l’efficacité avec la largeur du pic à mi-hauteur et les temps de rétention. Voici les paramètres que nous devons retenir avec le facteur de capacité, k’ le facteur de résolution et HEPT (plus pour savoir si l’on a une colonne efficace pour les composés que l’on veut étudier) Le logiciel définit ce que l’on appelle la Suitability qui est le facteur d’optimisation de nos conditions opératoires et donc ce paramètre est calculé avec k’, le facteur de résolution et avec les temps de rétention. On peut améliorer cette optimisation mais pour cela il faudra un Rs > 1,5 et un 1 La hauteur du pic est proportionnelle à la quantité de substance. Donc pour une même substance, si j'ai un pic beaucoup moins haut, la quantité de substance est moins importante. Si le pic n’a pas vraiment un aspect de triangle, alors la quantité de substance est moins liée à la hauteur du triangle. -> La surface du pic est proportionnelle à la quantité de substance La concentration du composant dans la solution est reliée à la surface du pic. 4 méthodes de dosage existent pour quantifier en chromatographie : 16 Surfaces de pics normalisées (on n'en parle pas) 1. Standard externe 2. Standard interne Ajouts dosés (internat) STANDARD EXTERNE (TP vit B12 ou quinine) : C’est une méthode de quantification qui s’utilise en spectrophotométrie (signal d’absorbance), fluorescence (signal de fluorescence) et chromatographie (surface de notre pic). Le signal entre ces 3 méthodes est différent. La conception du dosage est cependant toujours la même. On va préparer avec un étalon pur (substance pur) différentes concentrations = gamme étalon, puis de la même manière on prépare l’échantillon et on utilise le même outil. Plus il y a de composé, plus la surface du pic chromatographique va être importante, plus le signal est important. Notre échantillon, il faut qu’il ait un signal pas plus bas que le point le plus faible et pas plus haut que le point le plus concentré. L’échantillon nous ne connaissons pas sa concentration (c'est ce que l’on chercher à savoir) mais les points de gammes par définition on connait leur concentration. Dans ce cas-là, on trace la surface du pic en fonction de la concentration. Avec les mises au point, si la méthode est correcte, on a quelque chose de linéaire ce qui va nous permettre de relier directement l’aire du pic de notre échantillon (N°5 sur la photo) à la concentration. Préparation d’une gamme étalon avec un standard Encadrement obligatoire de la valeur de l’échantillon. D’un côté on a la valeur pure et de l’autre l’échantillon. Par exemple ici, notre échantillon est dans le tube 5, en lisant le signal on peut lire la concentration. ÉTALON INTERNE Notre étalon est dans notre échantillon. On utilise un étalon qui n'est pas naturellement dans l’échantillon, on doit pouvoir avoir en chromatographie un pic différencié de ceux de l’échantillon, des qualités physicochimiques proches des composés analytiques (pour que les conditions opératoires qu’on utilise pour notre échantillon puissent aussi identifier l'étalon interne), ne pas interagir avec les composés du mélange à analyser et on l’introduit dans la même gamme de concentration. Mais surtout il faut que l’étalon interne soit introduit dans l’échantillon à concentration constante. Propriétés de l’étalon interne - ne pas être présent « naturellement » dans l’échantillon, - être distinguable des produits à doser → rétention différente, pics différents 17 - avoir des qualités physicochimiques proches des composés à analyser - ne pas interagir avec les composés du mélange à analyser, - être introduit dans la même gamme de concentration que les composés à doser. Ici, on a différents types de substances (1, 2 et 3) et dans notre échantillon à doser, il y a peut-être 2 ou 3 de ces substances. Donc on va déposer un étalon interne qui n’a rien à voir avec ce que l’on veut analyser mais qui peut donner lieu à un pic chromatographique avec nos conditions opératoires et on le dépose à concentration constante dans chacun. Si une substance est toujours à la même concentration, notre pic aura toujours la même allure et surtout il aura toujours la même surface. Ce qui va varier est la concentration de chacun des composés 1, 2 et 3 et la concentration de ses composés dans notre échantillon. ( la prof n’a pas insisté dessus ) On a notre étalon interne qui sort bien dans les conditions opératoires qu’on s'est posé (temps de rétention à 4,2 et la résolution doit être bonnes puisque les pics sont bien séparés). On veut ici étudier la concentration de thiopental dans différentes solutions et donc on va y mettre notre étalon interne qui aura une surface de pic identique (données dans la diapo). On a aussi pour un standard qui a une surface de pic à 200, on va utiliser le rapport de surface de notre standard de concentration connue / l’étalon interne. Plus le rapport est élevé plus notre standard a une concentration importante. Et si on utilise ce rapport de surface sur notre échantillon, cela va nous permettre de déterminer la concentration de notre échantillon. On n'utilise pas que la surface des pics car elles peuvent varier selon plusieurs paramètre (température, vieillissement de la colonne, manière dont on a fait l’injection...) ( ces deux parties peuvent servir pour les Tp ) Les applications de la chromatographie 18 Très utilisé en industrie : la diapo ci-dessus représente tous les domaines ou est utilisée la chromatographie. Analyse nutritionnelle : vitamines liposolubles (HPLC +++ ou GC) Les méthodes sont soit de la GC soit de la HPLC Récap des formules à connaître. 19 Dédicaces à tous les marseillais de la promo ! Bon courage 😊 20