Лабораторна робота №2 (Українська). PDF

Звіт Про виконання лабораторної роботи №2 З навчальної дисципліни Інженерна ензимологія целюлолітичних ферментів Тема: Виділення аеробних целюлолітичних мікроорганізмів на елективних середовищах. Виділення та характе...

Звіт Про виконання лабораторної роботи №2 З навчальної дисципліни Інженерна ензимологія целюлолітичних ферментів Тема: Виділення аеробних целюлолітичних мікроорганізмів на елективних середовищах. Виділення та характеристика молочнокислих бактерій із фекальних гранул, целомічної рідини та шлунково-кишкового тракту Nypaworm (Namalycastis rhodochorde) із Західного Калімантану, Індонезія Мета роботи: Метою роботи є виділення та характеристика молочнокислих бактерій (МКБ) із фекальних пелет, циломічної рідини та шлунково-кишкового тракту черв’яків Nypa, а також дослідження їхньої здатності до целюлозолізу. Обладнання та матеріали: Зразки черв’яків Nypa. Агар MRS (De Man Rogosa and Sharpe). Стерильний фізіологічний розчин. Мікробіологічне обладнання: автоклав, інкубатор, шейкер. Хімічні реактиви: фарби для грам-позитивного фарбування, CMC-конго червоний для виявлення целюлозолітичної активності. Унікальність дослідження Це дослідження є унікальним, оскільки вперше молочнокислі бактерії було виділено із черв’яків Nypa, які проживають у мангрових заростях. Ізоляти характеризуються високою целюлозолітичною активністю, що відкриває перспективи їх використання як пробіотиків у кормах для аквакультури. Хід роботи: 1. Збір зразків Робота починається з підготовки до збору зразків у природному середовищі проживання черв’яків Nypa (Namalycastis rhodochorde). Збір здійснюють у мангрових заростях, зокрема у гирлі річки Какап у Західному Калімантані. Зразки відбирають лише у черв’яків довжиною понад 50 см із цілісним, непошкодженим тілом, червонуватого кольору. Збір проводять за допомогою стерильних пінцетів, поміщаючи черв’яків у стерильні контейнери для транспортування до лабораторії. Після прибуття зразки зберігають у контрольованих умовах до подальшої роботи. 2. Підготовка живильного середовища Для культивування бактерій готують агар MRS (De Man Rogosa and Sharpe), який використовується для росту молочнокислих бактерій. Для цього відміряють 68.2 г порошку MRS-агару, розчиняють його в 1 л дистильованої води, нагрівають до повного розчинення і стерилізують в автоклаві при 121°C протягом 15 хвилин. Додатково готують CMC-конго червоний агар для визначення целюлозолітичної активності. 3. Ізоляція бактерій Ізоляцію молочнокислих бактерій проводять із трьох видів зразків: фекальних пелет, циломічної рідини та шлунково-кишкового тракту черв’яків. Для цього: Використовують стерильний набір інструментів для вилучення зразків. 10 г кожного зразка змішують із 90 мл стерильного фізрозчину. Суспензії інтенсивно перемішують у шейкері зі швидкістю 120 об/хв протягом 30 хвилин. Проводять серійне розведення, розбавляючи початковий зразок у стерильному фізрозчині до розведення 10^-5. На кожному етапі розведення зразки висівають методом наливання в чашки Петрі з агаром MRS. 4. Культивування та очищення ізолятів Висіяні чашки інкубують при температурі 37°C протягом 48 годин. Після завершення інкубації проводять очищення колоній методом квадрантного висіву для отримання чистих культур. Очищені культури зберігають у холодильнику при температурі 4°C для подальшого аналізу. 5. Скринінг на целюлозолітичну активність Для визначення здатності ізолятів до розщеплення целюлози використовують CMC-конго червоний агар. На поверхню агару наносять культуру бактеріальних ізолятів у формі 6 мм кругів. Чашки інкубують при 37°C протягом 48 годин. Оцінюють формування прозорих зон (гало) навколо колоній, що свідчить про секрецію целюлазного ферменту. 6. Морфологічна та біохімічна характеристика ізолятів. Всі ізоляти аналізують за такими параметрами: Морфологія колоній: форма, край, колір, підняття над поверхнею агару. Мікроскопічна структура: форма клітин, забарвлення за Грамом. Біохімічні тести: визначення активності каталази, ферментативного метаболізму, здатності до розщеплення желатину, реакції з метиловим червоним та цитратом.  Визначають оптимальні умови росту: рН (5-7) і температуру (28-37°C). 7. Оцінка активності ензимів Максимальну активність (індекс 2.5) продемонстрував ізолят NrLtG2. 8. Ідентифікація та аналіз отриманих даних Отримані ізоляти ідентифікують до рівня роду за допомогою довідника Bergey’s Manual. Зроблено висновок, що 8 ізолятів належать до роду Lactobacillus, 2 — до Bacillus. 9. Підготовка висновків та рекомендацій Доведено, що молочнокислі бактерії можуть бути використані як пробіотики для підвищення перетравності кормів. Розроблені рекомендації щодо подальшого використання ізолятів у аквакультурі. Характеристика продуцента У ході дослідження як продуценти було визначено два роди молочнокислих бактерій: Lactobacillus (8 ізолятів) та Bacillus (2 ізоляти). 1. Lactobacillus: Морфологія: грампозитивні, паличкоподібні бактерії, які формують ланцюжки клітин. Колонії круглі, підняті, непрозорі, білого кольору. Біохімічні особливості: негативна реакція на каталазу, здатність до ферментативного метаболізму глюкози, слабка або відсутня оксидазна активність, відсутність продукції газу або сірководню. Переваги: Висока адаптивність до анаеробних і мікроаерофільних умов. Ефективне продукування молочної кислоти, що створює несприятливе середовище для патогенних мікроорганізмів. Відносно прості умови культивування та стійкість до низьких рН. Недоліки: Менша здатність до синтезу складних ферментів порівняно з Bacillus. Вразливість до несприятливих температурних умов (оптимум 30°C). 2. Bacillus: Морфологія: грампозитивні, паличкоподібні бактерії, що утворюють ланцюжки. Колонії нерегулярної форми, білого кольору. Біохімічні особливості: позитивна каталазна активність, сильний ферментативний метаболізм. Переваги: Висока ферментативна активність, включаючи здатність синтезувати целюлази.  Стійкість до стресових умов, таких як високі температури (до 37°C). Недоліки: Вищі вимоги до культивування порівняно з Lactobacillus. Потреба у складних поживних середовищах. Особливості культивування мікроорганізмів Для культивування використовували агар MRS, який забезпечує оптимальні умови для росту молочнокислих бактерій. Особливості: Температура інкубації: 30°C для Lactobacillus, до 37°C для Bacillus. Оптимальний рН середовища: від 5 до 7, що відповідає природному середовищу цих мікроорганізмів. Тривалість інкубації: 48 годин для повного формування колоній. Особливі вимоги: Стерильність процесу для запобігання контамінації. Регулярне оновлення живильного середовища для збереження життєздатності культур. Отримані ензими. У результаті дослідження було виявлено здатність частини ізолятів синтезувати целюлази. 1. Характеристика целюлаз: Ензими, що розщеплюють целюлозу (основний компонент рослинної біомаси) до простих цукрів, таких як глюкоза і целобіоза. У бактерій Lactobacillus і Bacillus целюлази виділялися у формі позаклітинних ферментів, які легко взаємодіяли з субстратами (наприклад, CMC- агаром). Максимальний індекс активності становив 2.5 для ізоляту NrLtG2 (зразок із шлунково-кишкового тракту). 2. Особливості целюлаз: Висока стабільність при рН 5-7, що робить їх ефективними у середовищах з кислотністю, близькою до природної. Чутливість до температур вище 40°C, що обмежує використання у високотемпературних процесах. 3. Перспективи використання: У аквакультурі: Поліпшення перетравності рослинних компонентів кормів. Зниження ризику захворювань завдяки пробіотичним властивостям бактерій-продуцентів. У біотехнології: Використання целюлаз для отримання біопалива шляхом ферментації рослинної біомаси. У сільському господарстві: Біодеструкція рослинних відходів для утворення біодобрив.  Блок-схема дослідження Висновок У ході проведеного дослідження було ізольовано та охарактеризовано молочнокислі бактерії з трьох джерел: фекальних пелет, циломічної рідини та шлунково-кишкового тракту черв’яків Nypa (Namalycastis rhodochorde). Серед 20 виділених ізолятів 10 проявили целюлозолітичну активність, що свідчить про їх здатність розщеплювати целюлозу. Найвищий целюлозолітичний індекс (2.5) був продемонстрований ізолятом NrLtG2. Бактерії, які проявляють подібну активність, можуть бути перспективними пробіотиками для кормів, що покращують перетравність органічних компонентів та забезпечують здоров’я травної системи організмів у аквакультурі. Морфологічна і біохімічна характеристика ізолятів показала, що більшість із них належать до роду Lactobacillus (8 ізолятів), тоді як інші два — до роду Bacillus. Lactobacillus відзначаються високою адаптацією до умов низького рН і здатністю до молочнокислої ферментації, тоді як Bacillus демонструють сильну ферментативну активність і більшу стійкість до екстремальних умов. Отримані дані свідчать про тісний зв’язок між целюлозолітичними бактеріями та природними умовами їхнього середовища існування, такими як мангрові зарості, багаті целюлозними субстратами. Продукція целюлаз цими мікроорганізмами є ключовим фактором для їхнього потенційного використання. Виконав: студент групи БТМ-21 Печар А.А. Прийняв: викладач ГАВРИЛЯК В.В. Дата: 30.11.2024 Звіт виконано за дослідженнями: https://smujo.id/biodiv/article/view/4933/3863