Laborator practic nr. 3 - Procese de fermentație anaerobă. PDF

Laborator practic nr. 3 PROCESE DE FERMENTAŢIE ANAEROBĂ ü În sens biotehnologic, prin fermentaţie se înţelege procesul de creştere controlată a microorganismelor pe medii de cultură adecvate, cu scopul de a obţine diverşi produşi utili, respectiv metaboliţi primari sau secundari ai cel...

Laborator practic nr. 3 PROCESE DE FERMENTAŢIE ANAEROBĂ ü În sens biotehnologic, prin fermentaţie se înţelege procesul de creştere controlată a microorganismelor pe medii de cultură adecvate, cu scopul de a obţine diverşi produşi utili, respectiv metaboliţi primari sau secundari ai celulei microbiene. ü Capacitatea de creştere în condiţii anaerobe este limitată la procariote (bacterii). ü La eucariote creşterea anaerobă este un proces tranzitoriu (microorganisme facultativ anaerobe). ü Microorganismele facultativ anaerobe au capacitatea de a creşte fie în condiţii aerobe, utilizând oxigenul molecular, fie în condiţii anaerobe, caz în care utilizează compuşii organici din mediu ca acceptori finali ai electronilor. ü Rata de degradare a glucidelor în condiţii de aerobioză este mult mai scăzută decât în anaerobioză. ü Fermentaţia anaerobă este un proces catabolic în care energia necesară desfăşurării activităţilor metabolice este obţinută prin folosirea compuşilor organici din mediul de cultură, atât ca donori, cât şi ca acceptori de electroni. ü Microorganismele care produc fermentaţii anaerobe sunt facultativ sau obligatoriu anaerobe. ü Microorganismele obligatoriu anaerobe sunt distruse în contact cu oxigenul din aer. ü Microorganismele facultativ anaerobe sunt heterotrofe, capabile de respiraţie în prezenţa oxigenului molecular şi produc fermentaţii în absenţa acestuia. ü Microorganismele pot produce fermentaţii utilizând o gamă foarte largă de substanţe fermentescibile: glucide: poliglucide (celuloză, amidon), diglucide (zaharoză, lactoză, maltoză), hexoze (glucoză, fructoză, galactoză), pentoze polialcooli (glicerol, manitol) aminoacizi acizi organici purine şi pirimidine ü Produşii obţinuţi în urma fermentaţiilor sunt de asemenea foarte diferiţi: alcooli (etanol, propanol, butanol, 2,3-butandiol, glicerol) acizi (lactic, formic, acetic, propionic, butiric) esteri (etilacetat, etilbutiric, poli β-hidroxibutirat) gaze (H2, CH4, CO2) ü Drojdiile şi lactobacilii homofermentativi produc fermentaţii pure, biosintetizând aproape exclusiv alcool sau acid lactic şi numai urme din alţi produşi. ü Exemple de fermentaţii anaerobe: ü In laborator condiţiile de anaerobioză necesare fermentaţiilor se realizează prin însămânţarea unor flacoane cu medii de cultură lichide, complet umplute, acoperite lax cu un dop şi incubare în condiţii statice. ü În industrie incubarea se face fără agitare, în lipsa aerului, oxigenul de la suprafaţa mediului fiind înlocuit cu dioxidul de carbon produs în timpul fermentaţiei care este mai greu. ü Multe fermentaţii anaerobe prezintă o importanţă deosebită pentru că furnizează produşi cu valoare economică ridicată, ce pot fi obţinuţi pe scară industrială. FERMENTAŢIA ALCOOLICĂ ü Fermentaţia alcoolică are numeroase aplicaţii practice în industrie: § fabricarea spirtului, a băuturilor spirtoase § fabricarea vinului, a berii § fabricarea sucurilor de fructe § în panificaţie ü Etanolul se poate obţine prin metode chimice sau prin fermentaţia completă de către unele drojdii a diferitelor substanţe hidrocarbonate, umată de distilarea şi purificarea alcoolică. ü Drojdiile au un echipament enzimatic foarte bogat, graţie căruia, prin procese anaerobe de fermentaţie işi pot procura energia necesară reacţiior metabolice vitale. C6H12O6 2 CH3 – CH2OH + 2 CO2 ü În realitate, mersul reacţiei este mult mai complicat, formându-se şi numeroşi compuşi secundari de fermentaţie. ü Începutul fermentaţiei corespunde perioadei de multiplicare a drojdiei în care consumul sursei de C este de 2%, iar degajarea de CO2 este slabă = fermentaţie redusă. ü După 20 h, fermentaţia este însoţită de degajare intensă de CO2, concentraţia sursei de C scăzând de la 85%, la 15% = fermentaţia principală. ü Urmează o perioadă liniştită, cu degajare slabă de CO2, concentraţia sursei de C ajungând la 2% = fermentaţia secundară. ü Formarea etanolului se observă după mai multe zile, în funcţie de temperatura de incubare. ü Prin procesul de fermentaţie alcoolică, rezultă o cantitate redusă de energie, fapt confirmat şi de randamentul energetic scăzut, realizat într-o unitate de timp. ü Pentru a obţine aceeaşi cantitate de energie rezultată prin respiraţia unei molecule de glucoză, în fermentaţia alcoolică sunt necesare 12 molecule de glucoză. ü Bilanţul energetico-chimic al procesului de fermentaţie alcoolică este: C6H12O6 2 C2H5OH + 2 CO2 – 18 kcal ü În biotehnologie se realizează o fermentaţie dirijată cu tulpini selecţionate.  Fermentaţia la baloane ü Se prepară 1000 ml de mediu de cultură cu următoarea compoziţie: Glucoza 15% Extract de drojdie 0,4% Peptonă 0,4% Sulfat de amoniu (NH4)2SO4 0,4% Fosfat monopotasic KH2PO4 0,2% pH = 4-5  Materii prime şi materiale necesare flacoane Erlenmayer de 500 ml sterile balanţă tehnică spatule, pahare Berzelius cilindru gradat pH-box bec de gaz autoclav  Mod de lucru ü Se cântăresc şi se dizolvă pe rând substanţele componente ale mediului de cultură, se corectează pH-ul la valoarea 4-5, se repartizează câte 250 ml în fiecare flacon Erlenmayer şi se sterilizează prin autoclavare la 1150C, 15 min. ü Fiecare flacon este însămânţat cu 10% inocul şi se termostatează la 280C, static, timp de 24-48 h. ü Produsul rezultat conţine în principal alcool etilic şi cantităţi mici de produşi secundari, ca acetaldehida, glicerina, acizi organici volatili şi alcooli superiori. DETERMINAREA CONSUMULUI DE GLUCOZA PE DURATA FERMENTATIILOR ü Dezvoltarea microorganismelor este influentata de variatiile concentratiei de substrat. Din acest motiv, pe tot parcursul bioprocesului se determina si se urmareste concentratia sursei de C in mediul de fermentatie. ü In cazul în care sursa de C a mediului de biosinteza este reprezentata de glucide, concentratia lor se determina prin metoda Schoorl, bazata pe reactia Fehling. ü In probele colectate pe parcursul biosintezei, se determina concentratia glucozei, dupa care se traseaza curba de variatie a glucozei pe parcursul fermentatiei, inscriind pe abscisa timpul de fermentatie, iar pe ordonata concentratia in glucoza.  DETERMINAREA GLUCIDELOR REDUCATOARE PRIN METODA SCHOORL Principiul metodei ü In mediul alcalin, la cald, glucidele reducatoare reduc complexul cuprotartric format prin amestecarea solutiilor Fehling I si Fehling II, pana la oxid cupros (Cu2O↓), precipitat rosu caramiziu. ü Gruparea aldehidica se oxideaza la carboxil. ü Solutia de sulfat de cupru si sarea Seignette, in exces de hidroxid de sodiu se numeste solutie Fehling (se prepara in momentul utilizarii, prin amestecarea a doua solutii de baza, in cantitati egale). soluţia Fehling I = solutie cuprica: CuSO4·5H2O soluţia Fehling II = solutie bazica: NaOH + tartrat dublu de Na si K (sare Seignette)  ü Complexul cuprotartric format oxideaza gruparea aldehidica a glucidului reducator (glucoza), el reducandu-se la oxid cupros (Cu2O↓). ü Cantitatea de oxid cupros este proportionala cu cantitatea de glucoza din mediul de reactie. O CH COOK HO CH COOK 2 R CH O + 2 Cu + 2 H 2O R COOH + Cu2O↓+ 2 Aldoza O CH COONa Acid organic HO CH COONa Complex cuprotartric Sare Seignette (albastru inchis) ü Restul de hidroxid de cupru Cu(OH)2 care nu a fost redus, se trateaza mai intai cu acid sulfuric, transformandu-se din nou in sulfat de cupru, apoi cu iodura de potasiu, cu obtinerea iodului, care se titreaza cu tiosulfat de sodiu. Cu(OH)2 + H2SO4 CuSO4 + 2 H2O 2 CuSO4 + 2 KI K2SO4 + Cu2SO4 + I2 amidon I2 + 2 Na2S2O3 NaI + Na2S4O6 ü La titrare, se utilizeaza ca indicator o solutie de amidon care formeaza cu iodul un compus colorat in albastru inchis. ü Dupa titrare,  Mod de lucru ü Se preleveaza 10-20 ml din mediul de fermentatie si se filtreaza pe hartie de filtru. ü Din proba filtrata se iau in lucru dupa cum urmeaza: in primele 48 de ore de fermentatie (glucoza 5-12%) = 0,5 ml intre 48-96 ore de fermentatie (glucoza 5-0%) = 1 ml  PROBA MARTOR 10 ml solutie Fehling I 10 ml solutie Fehling I 10 ml solutie Fehling II 10 ml solutie Fehling II 20 ml apa distilata 20 ml apa distilata 0,5/1 ml proba 0,5/1 ml apa distilata Fierbere 2 minute, apoi racire sub jet de apa 10 ml solutie H2SO4 25% 10 ml solutie H2SO4 25% 10 ml KI 20% 10 ml KI 20% Titrare cu tiosulfat de sodiu 0,1N → solutia devine galbuie + 3 picaturi solutie amidon 1% Titrarea pana cand culoarea solutiei devine alba Corespondenta intre concentratia glucidelor reducatoare si volumul de tiosulfat de sodiu utilizat la titrare ml Na2S2O3 Glucoză [mg] Zahăr invertit [mg] Zaharoză [mg] 1 3,2 3,2 3,1 2 6,3 6,4 6,2 3 9,4 9,7 9,3 4 12,6 13,0 12,4 5 15,9 16,4 15,6 6 19,2 19,8 18,8 7 22,4 23,2 22,0 8 25,6 26,5 25,0 9 28,9 29,9 28,4 10 32,3 33,4 31,7 11 35,7 36,8 35,0 12 39,0 40,3 38,5 13 42,4 43,8 41,6 14 45,8 47,3 44,9 15 49,3 50,8 48,2 16 52,8 54,3 51,6 17 56,3 58,0 55,1 18 58,9 61,8 58,7 19 63,3 65,5 62,3 20 66,9 69,4 65,9  Calculul rezultatelor (N - n) x F = X ml tiosulfat de sodiu unde: N = volumul de tiosulfat de sodiu 0,1N folosit pentru titrarea martorului n = volumul de tiosulfat de sodiu 0,1N folosit la titrarea probei F = factorul solutiei de tiosulfat de sodiu 0,1N (0.9900) Echivalenta in substanta reducătoare din proba luata in lucru se gaseste in tabel Ø Cand se iau in lucru 0,5 ml proba: Concentratie in glucoza (%) = mg glucoza (tabel) x 0,2 Ø Cand se ia in lucru 1 ml proba: Concentratie in glucoza (%) = mg glucoza (tabel) x 0,1