Intérêt de l'étude de la morphogénèse rénale - Sorbonne Université 2023 - 2024 - PDF

Révisions : Révisions : SORBONNE DE UNIVERSITÉ UNIVERSITÉ PARIS 2023 - 2024 2022 - 2023 UEDS - Biologie Fiche de cours n°7 L'organogenèse rénale : L'analyse cellulaire et moléculaire : Partie 2 AUCUN CHANGEMENT PLAN I. Les maladies congénitales II. La souris : Modèle d’étude III. Les premières étude...

Révisions : Révisions : SORBONNE DE UNIVERSITÉ UNIVERSITÉ PARIS 2023 - 2024 2022 - 2023 UEDS - Biologie Fiche de cours n°7 L'organogenèse rénale : L'analyse cellulaire et moléculaire : Partie 2 AUCUN CHANGEMENT PLAN I. Les maladies congénitales II. La souris : Modèle d’étude III. Les premières études IV. Rappels induction V. Méthodes d’études, outils d’analyses MANUELIE MÉGANE Légendes MONGA TCHOKOUAK Notion nouvelle cette année Notion déjà tombée au concours I. Les maladies congénitales / II. La souris : Modèle d’étude / III. Les premières études / IV. Rappels induction / V. Méthodes d’études, outils d’analyses I. Les maladies congénitales Anomalies congénitales et reins et des voies urinaires (CAKUT) Il existe un grand nombre de maladies congénitales des reins et des voies urinaires appelées les CAKUT Représentent 1 naissance sur 500 naissances vivantes Sont une des principales causes d'insuffisance rénale pédiatrique Mutations d'un grand nombre de gènes intervenant dans un grand spectre de phénotypes Généralités 3 niveaux d’apparition Ces malformations sont liées à différents évènements lors de 3 étapes fondamentales de la formation du rein : o Induction, lors du développement précoce du rein § Agénésies rénales : absence de rein § Uretères multiples o Néphrogénèse, c’est-à-dire la différenciation des néphrons § Reins dysplasiques § Tumeurs comme la tumeur de Wilms o Croissance rénale chez le fœtus § Hypoplasies rénales MANUELIE MÉGANE MONGA TCHOKOUAK SORBONNE UNIVERSITÉ 2023 - 2024 2 /12 I. Les maladies congénitales / II. La souris : Modèle d’étude / III. Les premières études / IV. Rappels induction / V. Méthodes d’études, outils d’analyses Anomalies congénitales et reins et des voies urinaires (CAKUT) : Anomalies de nombre I. Les maladies congénitales Hypoplasie rénale Réduction du nombre et de la taille des néphrons Due à un arrêt de la croissance rénale o Insuffisance de développement de l'ébauche du rein Gènes facteurs de risque : o NRIP1 : Code pour une protéine d'interaction avec des récepteurs nucléaires o ANKS6 : Code pour une protéine cytoplasmique localisée dans les cils o FOXC2, HNF1B, SALL1, SIX1/2, Pax2 : Codent pour des facteurs de o EYA1 : Code pour un co-facteur de transcription o BMP, Wnt4 : Codent pour des morphogènes Définition agénésie = Absence totale ou partielle d'un organe dès la vie embryonnaire Agénésie rénale Peut-être unilatérale ou bilatérale Due à l'absence de l'ébauche embryonnaire au cours de l'induction rénale Gènes facteurs de risque : o Gène codant un récepteur transmembranaire o Gène codant une protéine extracellulaire o Gène codant un facteur de transcription Forme relativement fréquente de CAKUT Souvent asymptomatique à la naissance Prédispose au reflux vésico-urétéral Prédispose à l'hydronéphrose : o Rétrécissement ou obstruction de l'uretère o Touche environ 11 naissances sur 10 000 o Représente environ 50 % des malformations congénitales o Peut toucher un ou deux reins Gènes facteurs de risque : o GDNF, BMP : Gènes codant des morphogènes o Ret : Gène codant une protéine transmembranaire o Gènes codant des facteurs de transcription Peut prendre plusieurs formes o Duplication complète du rein o Duplication incomplète du rein o Duplication du rein et uretère en aveugle o Duplication urétérale inversée MANUELIE MÉGANE Duplications rénales Uretères multiples Lié à une anomalie lors de l'induction rénale MONGA TCHOKOUAK SORBONNE UNIVERSITÉ 2023 - 2024 3 /12 I. Les maladies congénitales / II. La souris : Modèle d’étude / III. Les premières études / IV. Rappels induction / V. Méthodes d’études, outils d’analyses I. Les maladies congénitales Rein en fer à cheval Anomalies congénitales et reins et des voies urinaires (CAKUT) : Anomalies de forme Fusion des 2 reins Gènes facteurs de risque : o Gènes codant des facteurs de transcription Malformation résultant d'une anomalie du développement qui survient au cours de la période embryonnaire, fœtale ou après la naissance Dysplasie rénale Développement incomplet du rein Due à une anomalie au cours de la néphrogenèse o Peut affecter le cortex ou la médulla Présence de kystes rénaux volumineux recouvrant la majorité du rein : o La dysplasie rénale o Le rein dysplasique multikystique (MCDK) o La polykystose rénale autosomique dominante (ADPKD) Gènes facteurs de risque : o BICC1 : Code pour une protéine d'interaction avec l'ARN o FOXC2, GATA3, HNF1B, LHX1, LMX1B, SALL1 : Gènes codant des facteurs de transcription o Gènes codant des protéines membranaires I. Les maladies congénitales Anomalies congénitales et reins et des voies urinaires (CAKUT) : Autres anomalies Plusieurs types de tumeurs : o Sclérose tubéreuse o Tumeur de Wilms : Due à une anomalie au cours de la néphrogenèse Gènes facteurs de risque : o WT1 : Code un facteur de transcription o TSC1 : Code une protéine cytoplasmique MANUELIE MÉGANE Tumeurs Destruction symétrique progressive des reins impliquant à la fois les tubules et les glomérules. Néphronophthisie Gènes facteurs de risque : o Gène codant une protéine cytoplasmique localisée dans les cils o NEK8 : Code une sérine/thréonine-proteine kinase Malformation de l’uretère Blocage de l'uretère entraînant des reflux d'urine dans les reins Gènes facteurs de risque : o Gène codant une protéine d'interaction avec des récepteurs nucléaires o Gène codant un facteur de transcription o Gène codant des morphogènes MONGA TCHOKOUAK SORBONNE UNIVERSITÉ 2023 - 2024 4 /12 I. Les maladies congénitales / II. La souris : Modèle d’étude / III. Les premières études / IV. Rappels induction / V. Méthodes d’études, outils d’analyses II. La souris, modèle d’étude Comparaison du développement du développement chez l’homme et la souris Gestation de 19 jours Excroissance du bourgeon urétéral à 10,5 jours Fin de la néphrogenèse en période post-natale (4- 6ème jour) Chez la souris 1. La première étape du développement du rein est l’excroissance du bourgeon urétéral o Il se réalise 10.5 jours après la fécondation 2. Il y a ensuite l’étape des branchements qui se terminent à la naissance 3. Puis l’étape de néphrogenèse o Elle démarre vers 11-12 jours o Cette étape de néphrogenèse n’est pas terminée à la naissance, elle se termine 4-6 jours après la naissance avec la fin de la différenciation des néphrons La formation/ différenciation finale de néphrons se produit dans la période postnatale Gestation de 38-42 semaines Excroissance du bourgeon urétéral à la 5ème semaine Néphrogenèse commencée à la 9ième semaine et terminée à la 35/37ème semaine o Avant la naissance Chez l'homme 1. 2. La première étape d’excroissance du bourgeon urétéral se déroule à la 5ème semaine Suivit par une étape d’arborisation du bourgeon qui permet la mise en place : o De branchements, du tubule collecteur et des canaux excréteurs 3. Puis, il y a l’étape des branchements puis l’étape de néphrogenèse qui démarre à la 9ème semaine o La néphrogenèse génère des néphrons fonctionnels o La dernière différenciation des néphrons apparaît aux alentours de la 35 – 37ème semaine de développement c’est-à-dire juste avant la naissance Chez l’humain, les néphrons sont formés avant la naissance MANUELIE MÉGANE Organisation du rein embryonnaire Chez la souris : o Rein unipapillé o 14 000 néphrons Chez l'homme : o Rein embryonnaire constitué de 815 lobes o Présence d'un arbre urétéral ramifié o 1 million de néphrons Limites : MONGA TCHOKOUAK o o Malgré un degré élevé de conservation, les souris et les humains présentent des différences significatives au niveau génétique, cellulaire et moléculaire Les résultats obtenus chez les souris sont uniquement indicatifs et ne doivent pas être directement extrapolés aux pathologies humaines SORBONNE UNIVERSITÉ 2023 - 2024 5 /12 I. Les maladies congénitales / II. La souris : Modèle d’étude / III. Les premières études / IV. Rappels induction / V. Méthodes d’études, outils d’analyses III. Les premières études Expériences du culture In Vitro de Clifford Grobstein Protocole : o Expérience 1 : Recherches sur les aspects cellulaires et moléculaires Résultats : o En absence de mésenchyme, le bourgeon urétéral dégénère (perte de l'intégrité des tissus, dissociation des tissus et mort cellulaire en 48h) o En absence de bourgeon urétéral, le mésenchyme dégénère Conclusion : o Expériences transfiltre Les tissus inducteurs o Perte de l'intégrité des tissus, dissociation des tissus et mort cellulaire en 48h lorsqu'un obstacle est placé entre le bourgeon et le mésenchyme o Agrégation des cellules du mésenchyme et formation de vésicules lorsqu'un filtre est placé entre le bourgeon et le mésenchyme Conclusion : o La formation de vésicules rénales à l'origine des néphrons nécessite une interaction entre l'épithélium du bourgeon urétéral et le mésenchyme = Mécanisme d’induction Protocole : Mise en culture simultanée (Et séparés par un filtre poreux) du mésenchyme du toit et soit du tube neural, soit de la chorde Résultats : o Agrégation des cellules du mésenchyme et formation de vésicules dans les 2 conditions MANUELIE MÉGANE Conclusion : o La chorde ou le tube neural sont inducteurs (18h de contact sont nécessaires) o Les cellules du toit du tube neural ou de la chorde vont sécréter des morphogènes Les cellules du mésenchyme ont reçu un signal, une induction et se sont engagées dans une différentiation o Protocole : o Expérience 4 : Expérience de microdissection du bourgeon urétéral, de l’épithélium et du mésenchyme Conclusion générale Mise en culture simultanée du bourgeon urétéral et du mésenchyme avec la présence entre les 2, soit d'un obstacle, soit d'un filtre poreux Résultats : o Expérience 3 : Interaction cellulaire entre l'épithélium du bourgeon et le mésenchyme Protocole : o Expérience 2 : Au stade de bourgeon urétéral, séparation et mise en culture individualisée du canal de Wolff et du mésenchyme l'entourant Résultats : o Mise en culture simultanée du bourgeon urétéral et du mésenchyme du bourgeon des glandes salivaires ou du bourgeon urétéral et d'un mésenchyme quelconque Formation de branchements uniquement pour le bourgeon cultivé avec le mésenchyme du bourgeon des glandes salivaires Conclusion : o o Existence d'une spécification du mésenchyme Existence d'une induction réciproque entre le mésenchyme et le bourgeon MONGA TCHOKOUAK Le mésenchyme et l'épithélium du bourgeon urétéral émettent des signaux qui vont entrainer l'activation ou la répression de certains gènes responsables de la bifurcation, du remodelage et du développement du bourgeon urétéral SORBONNE UNIVERSITÉ 2023 - 2024 6 /12 I. Les maladies congénitales / II. La souris : Modèle d’étude / III. Les premières études / IV. Rappels induction / V. Méthodes d’études, outils d’analyses IV. Rappels du concept d’induction Induction Inducteur, généralement diffusible, qui se fixe sur des récepteurs spécifiques Transduction du signal à l'intérieur de la cellule cible par des protéines cytoplasmiques o Système multifactoriel Messagers secondaires Activation ou répression du génome, ce qui peut entraîner : o Un engagement dans une voie de différenciation o Un changement de forme o L'acquisition d'une motilité L'induction engage la/les cellule(s), voire le tissu dans une voie de différenciation : o Elle provoque la détermination Ce concept d'induction est indissociable de celui de compétence : o La cellule cible doit être compétente pour recevoir la signalisation Mécanisme de l’induction MANUELIE MÉGANE Absence de récepteur = La cellule est incompétente o Pas de signalisation induite à l'intérieur de la cellule bien que la molécule inductrice soit présente Absence de transduction des signaux : o Pas de transduction du signal bien que la molécule inductrice et les récepteurs soient présents o Pas de messagers secondaires, de protéines cytoplasmiques Gestion de la compétence Absence de transcription : o Absence de transcription des gènes du développement bien que la molécule inductrice, les récepteurs et les protéines cytoplasmiques soient présents MONGA TCHOKOUAK SORBONNE UNIVERSITÉ 2023 - 2024 7 /12 I. Les maladies congénitales / II. La souris : Modèle d’étude / III. Les premières études / IV. Rappels induction / V. Méthodes d’études, outils d’analyses IV. Rappels du concept d’induction Induction permissive 2 types d’induction Pas de modification de l'engagement tissulaire Le tissu s'engage dans la voie où il aurait dû s'engager Modification de l'engagement du tissu/cellules compétent Peut se faire par contact intercellulaire = Apposition : o Molécules piégées au sein d'une matrice Induction instructive extracellulaire (lame basale) o Molécules présentes aux régions d'apposition des membranes. Peut se faire par un gradient de concentration de morphogène : o En fonction de ce gradient, il y aura un engagement différent du tissu compétent IV. Rappels du concept d’induction Molécule de signalisation (1) Protéines de signalisation intracellulaires (3) Acteurs de l’induction Extracellulaire Liaison avec son récepteur membranaire (2) de manière : o Spécifique o Réversible o Saturable MANUELIE MÉGANE Protéines cibles de la cascade de signalisation Permettent l'amplification du signal par une cascade de phosphorylations déphosphorylations Protéines cytoplasmiques (4) capables de modifier (6) : o Le métabolisme cellulaire o Le cytosquelette o La forme de la cellule o La prolifération cellulaire (mitoses) Protéines nucléaires (5) = facteurs de transcription assurant (7) : o Modification de l'expression de gènes par activation ou inhibition de la transcription MONGA TCHOKOUAK SORBONNE UNIVERSITÉ 2023 - 2024 8 /12 I. Les maladies congénitales / II. La souris : Modèle d’étude / III. Les premières études / IV. Rappels induction / V. Méthodes d’études, outils d’analyses V. Méthodes d’études, outils d’analyses Cibles et méthodes Cibles Il y a deux cibles o Soit des protéines cytoplasmiques de la cellule induite o Soit des protéines nucléaires Pour les protéines cytoplasmiques, cela va engendrer la modification du métabolisme, du cytosquelette, faire changer la forme de la cellule (Acquérir un phénotype épithélial) ou la prolifération des cellules (Mitoses) La deuxième cible est des protéines de signalisation intracellulaire qui sont adressées au noyau : elles deviennent facteurs de transcription o Elles vont modifier l’expression des gènes : soit activation ou répression des gènes § Exemple du facteur de transcription bêta-caténine au cours du développement Expression de gènes qui vont donner une identité dorsale à l’embryon Un certain nombre de méthodes d’études et d’outils d’analyses vont être utilisables et mis à profit o Les cultures organotypiques : § Cultiver in vitro (Dans des boites de pétri), des ébauches ou des fragments d'ébauches d'organes embryonnaires § Cela permet l’analyse de la différenciation de ces fragments, de ces ébauches d’organe et permet d’analyser des différents rapports existants entre les tissus qui le constituent Exemple : Entre le tissu épithélial du bourgeon urétéral et le mésenchyme sousjacent L’autre méthode est les cultures transfiltres (Vue dans les expériences C. Grobstein (1950)) Un certain nombre de méthodes d’études et d’outils d’analyses vont être utilisables et mis à profit o Les cultures organotypiques : § Cultiver in vitro (Dans des boites de pétri), des ébauches ou des fragments d'ébauches d'organes embryonnaires § Cela permet l’analyse de la différenciation de ces fragments, de ces ébauches d’organe et permet d’analyser des différents rapports existants entre les tissus qui le constituent Exemple : Entre le tissu épithélial du bourgeon urétéral et le mésenchyme sous-jacent o L’autre méthode est les cultures transfiltres (Vue dans les expériences C. Grobstein (1950)) Cultures organotypiques et cultures transfiltres Les organoïdes MANUELIE MÉGANE Les différentes analyses possibles suites à ces différentes cultures Analyse en microscopie électronique Analyse histologique Analyse avec des anticorps pour réaliser une immunolocalisation permettant de savoir où se trouve la protéine Hybridation : Recherche de présence d’ARN messager Analyse de type biochimie Analyse avec des billes pré incubées dans des facteurs de croissance ou dans des facteurs de différenciation pour analyser la différenciation de l’épithélium ou du mésenchyme rénal Analyse suite à des greffes de cellules ou de tissus Analyse des lignages cellulaires o Qui fait quoi, qui donne tel type de cellules au cours du développement rénal ? MONGA TCHOKOUAK SORBONNE UNIVERSITÉ 2023 - 2024 9 /12 I. Les maladies congénitales / II. La souris : Modèle d’étude / III. Les premières études / IV. Rappels induction / V. Méthodes d’études, outils d’analyses V. Méthodes d’études, outils d’analyses Objectifs Invalidation d’un gène Connaître la fonction d'une protéine codée par un gêne o Génération d'animaux transgéniques Étudier les conséquences de la surexpression ou de la suppression d'un gène dans un tissu, un organe o Gain ou perte de fonction Consiste à utilise un transgène pour soit : o Ajouter une information génétique étrangère o Remplacer précisément un gène endogène par un gène étranger Peut se faire de 3 façons : o Transgenèse additionnelle par micro-injection d'ADN : Insertion aléatoire d'un transgène dans le génome de souris afin de produire une souris transgénique o Transgenèse additionnelle par infection virale : Insertion aléatoire d'un transgène dans le génome de souris o Transgenèse ciblée par recombinaison homologue : Invalidation fonctionnelle par délétion d'une séquence génomique afin de générer une souris KO Transgenèse Légende : o A : juste après la fécondation o B : stade 2 cellules o C : stade 4 cellules o D : stade 8 cellules o E : compaction o H : stade cavité blastocyste, sa couche de cellules externes et sa couche de cellules/masse cellulaire internes § Ce blastocyste de souris est comparable à l’humain MANUELIE MÉGANE MONGA TCHOKOUAK SORBONNE UNIVERSITÉ 2023 - 2024 10 /12 I. Les maladies congénitales / II. La souris : Modèle d’étude / III. Les premières études / IV. Rappels induction / V. Méthodes d’études, outils d’analyses V. Méthodes d’études, outils d’analyses Transgenèse par recombinaison homologue Insertion in vitro d'un gène de résistance à un antibiotique dans le gène X que l'on cherche à invalider Culture de cellules ES issues de la masse cellulaire interne o En présence du gène X invalidé par le gène de résistance à l'antibiotique o En présence de l'antibiotique afin de ne laisser se développer que les cellules incorporé le gène de résistance dans leur génome par recombinaison homologue Étapes Microinjection des cellules positives (= S'étant développées) dans soit : o Un blastocyste receveur avant compaction o Un embryon au stade 8 cellules et avant compaction Transfert de l'embryon dans une femelle pseudogestante Sélection des souriceaux fondateurs car possédant un génotype hétérozygote Croisements afin d'obtenir un souriceau homozygote Analyse du phénotype permettant d'aborder la fonction de la protéine d'intérêt MANUELIE MÉGANE Génération d'animaux transgéniques servant Applications de modèle à : o L'étude de la fonction de la protéine codée par le transgène o L'analyse de l'étiologie, de l'apparition et de la progression des maladies humaines o La recherche fondamentale Génération de cellules souches embryonnaires pour la médecine régénérative o Les cellules souches embryonnaires issues de la masse cellulaire interne peuvent se différencier in vitro en différents types cellulaires (Rein, sang, muscle) MONGA TCHOKOUAK SORBONNE UNIVERSITÉ 2023 - 2024 11 /12 I. Les maladies congénitales / II. La souris : Modèle d’étude / III. Les premières études / IV. Rappels induction / V. Méthodes d’études, outils d’analyses V. Méthodes d’études, outils d’analyses Organoïdes Culture en suspension de cellules pluripotentes issues de la masse cellulaire interne o Formation d'agrégats cellulaires correspondant aux corps embryoides Au cours des 3 premiers jours de culture, le développement des corps embryoïdes récapitule le développement de l'embryon avec apparition des trois feuillets embryonnaires : o Endoderme, mésoderme et ectoderme En fonction des conditions de culture, il est possible de générer des organoïdes à partir de corps embryoïdes o Différenciation du corps embryoïde en mésenchyme après 9 jours o Différenciation en vésicules rénales après 14 jours o Différenciation en organoïdes après 23 jours Dérivent des corps embryoïdes Reproduisent in vitro le développement, la différenciation et l'anatomie d'un organe Formées à partir de cellules souches ou de cellules progénitrices qui s'auto-organisent dans un Forment des structures multicellulaires tridimensionnelles environnement 3D adapté (Hydrogel, environnement matriciel poreux) Constituées de cellules différenciées grâce à la présence de facteurs de croissance et de MANUELIE MÉGANE différenciation : o La nature, la quantité et la fenêtre d'exposition à ces facteurs guide la différenciation de l'organoïde Analysées par microscopie électronique, histologie, immunolocalisation, hybridation, biochimie, billes, greffes ou lignages cellulaires L'organoïde est plus petit que l’organe qu’il mime : o Organoïde = 0,006 cm3 o Rein = 134-136 cm3 Les résultats sont peu reproductibles Présentent des limitations La vascularisation du rein est difficile à obtenir o Peu de capillaires glomérulaires et de vaisseaux péri-tubulaires La maturation et la différenciation ne sont pas complètes o Formation de petits podocytes immatures o Polarisation immature o Petite lumière o Épithélium urétéral peu développé MONGA TCHOKOUAK SORBONNE UNIVERSITÉ 2023 - 2024 12 /12