Лекція № 2: Основні напрями створення генетично модифікованої сировини PDF

ЛЕКЦІЯ № 2 Тема: Основні напрями створення генетично модифікованої сировини План 1. Трансгенні сорти сільськогосподарських рослин, стійкі до гербіцидів, до комах-вередунів, вірусних захворювань, із поліпшеними якісними характеристиками. 2. Генетич...

ЛЕКЦІЯ № 2 Тема: Основні напрями створення генетично модифікованої сировини План 1. Трансгенні сорти сільськогосподарських рослин, стійкі до гербіцидів, до комах-вередунів, вірусних захворювань, із поліпшеними якісними характеристиками. 2. Генетично модифікована сировина тваринного походження. 3. Генетично модифікована сировина мікробного походження. Рекомендована література: 1. Біляк Ю. В. Тенденція зростання основних загроз використання ГМО на сільськогосподарських підприємствах. Інвестиції: практика та досвід. 2015. № 23. С. 58-63. 2. Біотехнологія. Вступ до фаху : навч. посіб. для студ. вищ. навч. закладів, які навчаються за програмами підготовки «Біологія» / Гаркава К. Т. та ін. К. : НАУ, 2012. 295с. 3. Екотрофологія: основи екологічно безпечного харчування: навч. посіб. / Димань Т. М. та ін. К.: Лібра, 2006. 304 с. 4. Сорочинський Б. В., Данильченко О. О., Кріпка Г. В. Генетично модифіковані рослини. Київ : Фітосоціоцентр, 2005. 204 с. 5. Товарознавство. Харчові продукти з генетично модифікованої сировини. Т 50. навч. посіб. / Дубініна А. А. та ін. Х. : ХДУХТ, 2015. 267с. 1. Трансгенні сорти сільськогосподарських рослин, стійкі до гербіцидів, до комах-вередунів, вірусних захворювань, із поліпшеними якісними характеристиками ГМ-рослини, які є сировиною для одержання продуктів харчування, умовно можна розділити на дві групи:  перша група – культури з поліпшеними агрономічними властивостями. Вони містять гени стійкості до гербіцидів (соя, рапс, пшениця та ін.), а також гени ґрунтової бактерії Bacillus thuringiensis, що забезпечують захист рослин від комах- шкідників (картопля, бавовна, кукурудза, томати та ін.);  друга група – рослини, генетична модифікація яких дозволила поліпшити певні властивості продуктів: поживні – соя, рапс; технологічні – картопля, томати; органолептичні – виноград і низка ін. Рослини, стійкі до комах-шкідників. Донедавна для боротьби з комахами-шкідниками застосовували хімічні інсектициди. Їхнє промислове виробництво почалося ще в 1940-ві роки. Щорічно на їхнє  виробництво в усьому світі витрачається більш 4 млрд доларів США. 1   З обліком на це останні 20 років проводилися інтенсивні пошуки альтернативних способів контролю чисельності комах-шкідників. У порівнянні з хімічними інсектицидами, природні, як правило, високоспецифічні й зазнають швидкої біодеградації. На жаль, вони не дуже ефективні, а їх одержання обходиться дуже дорого, що обмежує можливість їх широкого застосування. Проте якщо витягти гени, що кодують біосинтез природних інсектицидів, і впровадити їх у рослину, вона сама може захистити себе від шкідників. Широкомасштабне застосування хімічних інсектицидів показало, що крім безсумнівного ефективного впливу на комах-шкідників вони мають небажаний вплив на людину, а саме:  токсичний вплив на людину, тварин і екосистему в цілому;  тривалий строк присутності в навколишньому середовищі  (деякі інсектициди зберігаються в природі до 20 років);  постійне нагромадження в середовищі у зростаючих концентраціях;  біоакумуляція в тканинах багатьох організмів і передача по харчових ланцюгах;  неспецифічність дії (поряд зі шкідниками вони знищують і корисних комах, серед яких є їхні природні вороги);  необхідність багаторазової обробки рослин протягом вегетаційного періоду;  високі витрати на виробництво. Найбільш перспективною в цьому напрямку є ґрунтова бактерія Bacillus thuringiensis, яка виробляє токсин білкової природи, що згубно діє на комах. Унікальність цієї бактерії полягає в тому, що різні її штами продукують токсини, специфічні відносно певних комах. У цей час отримано такі стійкі до комах-шкідників трансгенні рослини: томати, тютюн, картопля, рис, кукурудза, яблуня, баклажан, рапс, люцерна, горіх, бавовна. Створені й використовуються в сільськогосподарському виробництві трансгенні рослини картоплі, що несуть синтетичний ген на основі гена інсектицидного токсину В. thuringiensis subsp. tenebrionis, високостійкі до колорадського жука – основного шкідника картоплі. Існують і інші підходи у створенні рослин, стійких до комах- шкідників. Відомо, що деякі рослини синтезують інгібітори протеїназ, які, потрапляючи в кишечник комахи, блокують гідроліз рослинних білків. Якщо виділити рослинний ген інгібітора протеїназ і забезпечити його сильним промотором, то можна створити трансгенні сільськогосподарські культури, здатні синтезувати інгібітор протеїназ у кількості, достатній для захисту від комах-шкідників. Таким способом було створено трансгенні рослини тютюну, стійкі до совки (Heliothis virescens), рослини рису, стійкі до рожевого стеблевого точильника (Sesamia infer ens), основного шкідника цієї культури, рослини гороху, стійкі до зерновки (Callosobrichus maculatus) і довгоносика (C.chinensis). 2  Рослини, стійкі до гербіцидів. Для захисту сільськогосподарських ланів від бур’янів і, таким чином, для збільшення врожаю застосовують спеціальні хімічні препарати – гербіциди. Багато гербіцидів впливають не лише на бур’яни, але й на ті рослини, для захисту яких їх використовують. Крім того, гербіциди накопичуються в навколишньому середовищі та являють певну загрозу для живих організмів, у тому числі й людини. Таким чином, існує проблема захисту цінних культур від несприятливого впливу на них гербіцидів. Для її рішення створено трансгенні рослини, що стійкі до цих хімічних препаратів. Першою створеною рослиною була соя, з якої й почалося промислове впровадження трансгенних рослин у сільськогосподарське виробництво. Були отримані трансгенні рослини тютюну, томатів, картоплі, сої, стійкі до гербіциду гліфосату. Гліфосат є інгібітором 3- фосфатсинтетази (EPSPS) – ферменту, що відіграє важливу роль у синтезі ароматичних амінокислот у бактерій і рослин. Із гліфосатстійкого штаму Е. coli був виділений ген, що кодує EPSPS, і після створення на його основі спеціальної генетичної конструкції, що забезпечує експресію цього гену, введений у рослинні клітини. Трансгенні рослини, що синтезували EPSPS у кількості, достатньому для заміни інгібірованого гербіцидом рослинного ферменту, були стійкі до гліфосату, тобто під час обробки ним не гинули. Інший спосіб отримання стійкості – інактивація гербіциду. У цьому випадку створили трансгенні рослини бавовни й тютюну, стійкі до бромоксинілу – гербіциду, який інгібує фотосинтез. Стійкі рослини створювали шляхом введення в їхній геном бактеріального гена, що кодує нітрилазу, яка інактивує бромоксиніл ще до того, як він починає діяти. Трансгенні рослини синтезували активну нітрилазу й були стійкі до бромоксинілу. У цей час створено трансгенні рослини, стійкі до наступних груп гербіцидів: триазини, імідазоліноли, арилоксифен-ксипропіонати, циклогександіони, гліфосати, бромоксиніл, феноксикарбоксильні кислоти, глюфозинат (фосфинотрицин), ціанамід, далапон. Рослини, стійкі до вірусів. Віруси рослин (фітовіруси) наносять значний збиток рослинам і суттєво знижують врожай. Відомо, що обробка рослин генами, що кодують білки оболонки вірусу або антисмисловими послідовностями вірусної РНК (більшість фітовірусів є РНК-утримуючими), дозволяє одержувати рослини, стійкі до вірусних інфекцій. Створення трансгенних рослин, що несуть у своєму геномі ген білка оболонки вірусу, дозволяє значно обмежити здатність вірусу проникати в рослину й поширюватися в ній. Крім того, виявлено, що ген білка оболонки одного вірусу іноді забезпечує стійкість до широкого кола неспоріднених вірусів. Оскільки сільськогосподарські культури найчастіше піддано декільком вірусним інфекціям (наприклад, картопля інфікується вірусом тютюнової мозаїки, Х-, Y-, S-, М-, В-вірусами картоплі, вірусом скручування листків картоплі й ін.), бажано, щоб трансгенні рослини були стійкі одночасно до декількох вірусів. Для цього в рослинний геном вводять відразу кілька генів, що кодують білки оболонки різних вірусів. При ьому ефективність захисту рослин від вірусної інфекції 3 підвищується. У цей час отримано трансгенні рослини, стійкі до різних вірусів (табл. 1). Таблиця 1.1 Трансгенні рослини, стійкі до різних вірусів Трансгенна Джерела генів білка оболонки рослина Картопля Вірус скручування листків картоплі, Х-, Y-, S- віруси картоплі Люцерна Вірус мозаїки люцерни Огірок Вірус мозаїки огірка Папайя Вірус кільцевої плямистості папайї Рис Вірус смугастості рису Тютюн Вірус бронзовості томатів. Вірус гравірування тютюну Вірус мозаїки огірка. Вірус мозаїки сої Вірус погремкувості тютюну. Вірус тютюнової мозаїки Х-вірус картоплі Вірус мозаїки люцерни. Вірус мозаїки томатів. Вірус тютюнової мозаїки. Томати Гарбуз Вірус мозаїки кавуна. Вірус жовтої мозаїки кабачків. Рослини, що протистоять старінню. Серйозною проблемою при транспортуванні фруктів і овочів є їхнє передчасне дозрівання й розм'якшення. Встановлено, що під час дозрівання плодів у рослинах активуються специфічні гени, що кодують ферменти цеюлази й полігалактуронази. Якщо придушити експресію цих генів, то дозрівання може початися пізніше. Відомо також, що етилен ініціює експресію безлічі генів, відповідальних за дозрівання й старіння плодів. Передчасному старінню плоду можна запобігти, блокуючи синтез етилену. Таким чином, сповільнити дозрівання плодів можна інгібіруванням відповідних генів. Для інактивації генів, що кодують целюлазу й полігалактуроназу, були створені трансгенні рослини томатів, у яких синтезувалися антизначні РНК-версії цих генів. Під час введення таких генів у геном рослин томатів кількість відповідної мРНК і активність ферментів зменшувалися на 90%. Ці томати знайшли широке застосування в сільськогосподарському виробництві США. 4  Для придушення синтезу етилена були отримані трансгенні рослини томатів, що синтезують антизначні мРНК ферментів, необхідні для синтезу етилену. Також у промислових масштабах вирощується генетично модифікована мускатна диня з уповільненим дозріванням. Таким чином, завдяки зниженню синтезу етилену в цих рослин його вміст був набагато нижче, ніж у звичайних рослинах, і вони мали більш тривалий строк зберігання. Зміна харчової цінності рослин. Генетична модифікація рослин може змінювати якість і підвищувати врожайність найрізноманітніших сільськогосподарських культур. Причому генно-інженерні технології дозволяють не тільки прискорити процес одержання рослин з поліпшеними властивостями, але й створювати сорти з новими ознаками, які неможливо було б передати рослинам за допомогою традиційних методів селекції. Вже отримані культури з поліпшеними харчовими якостями (кукурудза, горох), створені сорти олійних культур зі зміненим жирнокислотним складом насіння, а також сорти плодових і фруктових культур з поліпшеним смаком плодів. Як правило, у цих білках відсутні деякі незамінні амінокислоти (звичайно лізин або метіонін), що робить їх біологічно неповноцінними. Змінивши нуклеотидну послідовність генів запасних білків насіння, можна синтезувати білок із потрібним амінокислотним складом. За низького вмісту незамінних амінокислот у білка збільшити їхню кількість можна шляхом регуляції біосинтезу. Таким шляхом були отримані трансгенні рослини сої й рапсу, у насінні яких вміст вільного лізину був у 100 разів, а вміст лізину в складі білків – у 2 рази (у сої) і в 5 разів (у рапсу) більше, ніж у вихідних рослинах. У цей час подібні роботи ведуться з кукурудзою, яка, як відомо, широко використовується не тільки як харчовий продукт, але і як корм для худоби. Збагачення білків кукурудзи лізином дозволило б значно підвищити її біологічну цінність. Зміна жирнокислотного складу ліпідів олійних культур. Основними сільськогосподарськими культурами, що використовуються для виробництва масла, є соя, рапс, пальма й соняшник. До складу олії, що одержана з них, входять, головним чином, пальмітинова, стеаринова, олеїнова, ліноленова й лінолева жирні кислоти. Перші дві з них є насиченими жирними кислотами, інші три – ненасиченими. Як відомо, найбільшу цінність являють ненасичені жирні кислоти. Так, у маслиновій олії міститься переважно олеінова кислота – 82% і лише незначні кількості пальмітинової – 9, стеаринової – 2 і лінолевої – 4%. Олія деяких рослин містить специфічні жирні кислоти. Наприклад, олія рапсу й гірчиці містить від 42 до 55% ненасиченої ерукової кислоти. Із трансгенні сортів рапсу зі зміненим жирнокислотним складом насіння виготовляють: маргарин, шоколадне масло, детергенти, детергенти, мило, предмети особистої гігієни, Харчові продукти, чорнило Косметика, чорнило, 5 фармацевтичні препарати, полімери, детергенти, полімери, косметика, фармацевтичні препарати, пластифікатори, мастильні препарати. За допомогою методів генної інженерії можна змінювати ступінь ненасиченості й довжину ланцюгів цих жирних кислот. Були створені й випробувані безліч трансгенних сортів рапсу, які синтезували олію зі зміненим жирнокислотним складом. Кожний трансгенний сорт містив один додатковий ген. Наприклад, рослини, що синтезують у великій кількості стеаринову кислоту, містили в своєму геномі антизначну копію гена ферменту стеаратдесатурази капусти. У результаті експресія гена рапсу пригнічувалася й накопичувалася стеаринова кислота, яка перетворювалася в олеїнову. Цей підхід дозволяє створювати нові сорти олійних культур із заданим набором жирних кислот. Зараз на ринку є різні сорти сої, рапсу й інших олійних культур з високим вмістом олеїнової кислоти. Зміна смаку. У цей час для поліпшення смаку харчових продуктів додають сіль, цукор, ароматизатори, інші харчові добавки, найчастіше штучного походження. Безсумнівно, було б економічно вигідніше і безпечніше для здоров’я людини, якби вихідна сировина безпосередньо містила речовини, що надають майбутньому продукту необхідного смаку. Інші напрями генетичної модифікації рослин. Крім одержання сировини із заданими властивостями генетична інженерія рослин дозволяє використовувати їх як «біореактори» – організми, у яких здійснюється суперпродукція тих або інших необхідних для людини речовин. Донедавна в якості таких «біореакторів» використовувалися винятково «рекомбіновані» мікроорганізми, які синтезували для людини лікарські препарати, гормони, антибіотики й інші сполуки. Зараз робляться спроби замінити мікроорганізми рослинами, які мають у порівнянні з ними низку переваг. По-перше, рослини мають значну біомасу. По-друге, культивування рослин, як правило, економічно вигідніше і не вимагає створення специфічних виробництв і залучення висококваліфікованих фахівців. Генетична модифікація рослинного генома є досить стабільною, у той час як мікроорганізми в процесі тривалого культивування можуть втрачати плазмідну ДНК, у складі якої й перебувають необхідні гени. Створені експериментальні установки для одержання за допомогою рослин моноклональних антитіл, функціональних фрагментів антитіл, а також полімерів 6 р-гідроксибутирата, з яких можна виготовляти пластик, підданий біодеградації. У майбутньому можливе одержання за допомогою рослин різних лікарських препаратів і матеріалів, необхідних для життєдіяльності людини. 2. Генетично модифікована сировина тваринного походження Роботи з одержання трансгенних тварин перебувають на стадії експериментального відпрацьовування створення схем введення й ефективної експресії чужорідних генів (трансгенів). Трансгенні технології можуть бути використані для виведення поліпшених порід свійських тварин й птахів: корів із більш високою удійністю, овець із якісною вовною, курей із підвищеною яйценосністю й т.п. Експерименти щодо введення чужорідних генів у клітини ссавців і можливість створення генетично ідентичних тварин шляхом переносу ядра з ембріональної клітини у яйцеклітину з вилученим ядром (клонування) дозволили включати у хромосомну ДНК вищих тварин функціональні гени або їх кластери. Використання стратегії полягає в наступному. Інокуліровані запліднені яйцеклітини імплантують у реципієнтну жіночу особину. Успішне завершення розвитку ембріона ссавців у інших умовах неможливо. Відбирають нащадків, які розвинулися з імплантованих яйцеклітин і містять клонований ген у всіх клітинах. Схрещують тварин, які несуть клонований ген у клітинах зародкової лінії й одержують нову генетичну лінію. Трансгенні технології розроблялися на мишах. За 20 років досліджень у різні лінії мишей були введені сотні генів. У результаті були вивчені механізми генної регуляції й розвитку пухлин, природа імунологічної специфічності, молекулярна генетика росту й розвитку, інші фундаментальні біологічні процеси, а також створені трансгенні лінії, що дозволяють моделювати різні генетичні хвороби людини. Трансгенна велика рогата худоба. Метою трансгеноза великої рогатої худоби є зміна вмісту різних речовин – білків, ферментів і інших у молоці. Наприклад, введення трансгена білка донказеїну в клітини молочної залози і його наступна 7 гіперекспресія приведе до підвищення кількості цього білка в молоці. Використання такого молока як сировину під час виробництва сиру дозволить значно збільшити вихід готового продукту. Введення й експресія гена ферменту лактази, каталізуючого гідролітичне розщеплення молочного цукру лактози, дасть можливість одержувати молоко, придатне для людей, в організмі яких порушений синтез цього ферменту. Метою трансгеноза також є створення свійських тварин, стійких до інфекцій і паразитарних інвазій; створення свійських тварин зі спадкоємною стійкістю до бактеріальних і вірусних інфекцій, а також до паразитарних інвазій. Для створення трансгенних корів використовували схему трансгеноза методом мікроін’єкцій ДНК. Слід зазначити, що ефективність одержання трансгенних тварин цим методом дуже низька. Так, в експериментах з 2407 ооцитів були отримані всього два трансгенних теляти. Дослідження в області вдосконалення методів трансгеноза тривають. Трансгенні вівці, кози й свині. Метою трансгеноза овець, кіз і свиней є перетворення молочних залоз цих тварин у «біофабрики» за виробництво білкових продуктів, що використовуються в медицині. За допомогою трансгенних конструкцій, що містять гени людини, були створені трансгенні вівці й кози, у молоко яких секретувалися білки людини. Ці білки мали активність, близьку до активності білків, що синтезуються в організмі людини. Експресія трансгенів у клітинах молочних залоз овець і кіз не виявляла ніяких побічних дій ні на самок у період лактації, ні на потомство, що вигодовує. Проте трансгенні свині, що несуть трансген бичого гормону росту, швидко збільшували вагу. У той же час у цих тварин відзначалися виразка шлунка, ниркова недостатність, кульгавість, зменшення рухливості суглобів і інші патології, причину яких не встановлено. Були створені трансгенні вівці з підвищеною швидкістю росту вовни й трансгенні свині, у клітинах крові яких у великій кількості синтезувався людський гемоглобін. Гемоглобін, що продукується трансгенними свинями, мав такі ж хімічні властивості, що й природний людський. Незважаючи на те, що отриманий, таким способом, людський гемоглобін має певні побічні ефекти при використанні й більш низьку ефективність у переносі кисню, ці результати вказують на 8 принципову можливість заміни цільної крові, використовується при трансфузії людським гемоглобіном, що отримано методом трансгенозу. Нижче наведені трансгенні конструкції, що містять гени людини і реципієнтні організми. Трансгенні риби. Дослідження в області одержання трансгенних риб стосуються встановлення впливу трансгена гормону росту на швидкість росту організму. Із цією метою в яйцеклітину атлантичного лосося було введено трансген, що містить гормон росту лосося й регуляторну послідовність білка американської бельдюги. Як правило, трансгенні лососі були більші й швидше збільшували вагу за контрольні трансформовані особи. В іншому експерименті однорічні трансгенні особи нерки, що отримано в результаті введення до яйцеклітини генетичної конструкції гормону росту, важили приблизно в 11 разів більше, ніж нетрансгенні. Технологія одержання трансгенних риб розроблена для коропа, форелі, лосося й інших видів риб і полягає в наступному. Трансгени вводять у запліднені яйцеклітини мікроін’єкцією ДНК або електропорацією. Подальший ембріогенез протікає у водному середовищі, поза організмом, у резервуарах із регульованими умовами. Виживаність ембріонів риб після ін’єкцій становить від 35 до 80 %. Таким чином, ефективність трансгеноза риб досить велика. Передбачається, що в майбутньому до організму риб будуть введені гени стійкості до хвороб, стресових впливів навколишнього середовища та ін. Трансгенні птахи. Метою створення трансгенних птахів є поліпшення генотипу вже існуючих порід. Серед переданих трансгенозом ознак можуть бути такі, як стійкість до вірусних інфекцій і захворювань, підвищення ефективності засвоювання їжі, зниження рівня жиру й холестеролу в яйцях, підвищення якості м’яса. Крім того, яйце можна використовувати в якості джерела білкових продуктів для фармацевтичної промисловості. Протеодержання трансгенних птахів обмежується відсутністю технології трансгеноза для цієї групи тварин. Метод мікроін’єкції ДНК у заплідненні яйця, широко використовуваний для ссавців і риб, не може бути застосований через особливості відтворення й розвитку птахів. Використання вірусних векторів на основі ретровірусів також проблематично, особливо у зв'язку з погрозою пташиного грипу. 9  Таким чином, у цей час отримані трансгенні корови, вівці, свині, птахи й риби. Трансгени дозволяють поліпшувати генотип порід домашньої худоби й виводити породи тварин з новими ознаками. Крім того, можливо, що трансгенних свійських тварин можна використовувати в якості «біофабрик» для одержання продуктів клонованих генів, що секретуються у молоко. 3. Генетично модифікована сировина мікробного походження Генетично модифіковані мікроорганізми (ГММ), або трансгенні мікроорганізми – це мікроорганізми (бактерії, дріжджі, синьо-зелені водорості, віруси та ін.), у яких генетичний матеріал (дезоксирибонуклеїнова кислота) змінений із використанням методів генної інженерії. Мікроорганізми, що мають генетично модифіковані аналоги (МГМА) – це мікроорганізми, що традиційно використовуються в харчовій промисловості, для яких, згідно з офіційною інформацією й науковими публікаціям, є аналогічні представники роду й виду, піддані генетичним змінам методами генної інженерії й потенційно придатні для використання у виробництві харчових продуктів. Трансгенні мікроорганізми зможуть застосовуватися для наступних цілей: – зупинка утворення пустель і відновлення родючості тих земель, які вже стали пустелями (за допомогою штамів трансгенів, здатних ефективно поглинати й зв’язувати вологу атмосфери); – підвищення врожайності сільськогосподарських рослин – (трансгенні азотфіксатори, продуценти БАВ та ін.); – придушення сільськогосподарських шкідників і фітопатогенів (трансгенні біопестициди); – підвищення біологічної продуктивності планктонів Світового океану; – очищення ґрунтів і водойм від забруднюючих речовин – (трансгенні штами-деструктори); – одержання живих пероральних трансгенних вакцинних штамів, що використовуються для охорони здоров’я й ветеринарії; – поліпшення виробництва їжі й кормів (трансгенні дріжджі, молочнокислі бактерії, целюлолітичні гриби та ін., що потрапляють у навколишнє середовище й/або в організм людини й тварин). Способи отримання генетично модифікованих мікроорганізмів Здатність організмів синтезувати ті чи інші біомолекули, в першу чергу білки, закодована в їх геномі. Тому досить «додати» потрібний ген, взятий із іншого організму, в бактерію, яка здатна рости в простих умовах і надзвичайно швидко розмножуватися. Але спроби провести перенесення в бактерії безпосередньо геномної ДНК призвели до суперечливих результатів. 10  Тільки в 70-ті роки були отримані відтворювані результати із застосуванням так званої векторної трансформації. В основі цього підходу лежить використання векторних молекул–ДНК, здатних переноситиу них гени, де ці молекули реплікуються автономно або після інтеграції з геномом. Вирішальну роль у цих експериментах зіграли також методи отримання індивідуальних генів, напрацювання їх у необхідній кількості шляхом клонування, тобто практично необмеженого розмноження в бактеріальних клітинах. В основі досягнень генетичної інженерії лежить одна з особливостей будови геному бактерій – наявність у них невеликих, відмінних від хромосоми, кільцевих молекул ДНК, які називаються плазмідми. Плазміди широко поширені в природі та зустрічаються у переважної кількості прокаріотів, а також у нижчих еукаріот-дріжджів. Важливою властивістю плазмід є здатність реплікуватися (розмножуватися) разом із ДНК клітини хазяїна, і тому останнім часом їх вважають внутрішньоклітинними паразитами або симбіонтом. Клітини господаря не потребують плазмідах для виживання в звичайних умовах, але часто плазміди надають їм низку особливих властивостей. Плазміди надають бактеріям здатність до статевого розмноження (F-фактор), стійкість до антибіотиків і дезінфікуючих засобів (R-фактор), можливості засвоювання деяких складних органічних речовин, наприклад, вуглеводів. Основна маса досліджень, які призвели до розвитку генної інженерії, проводилася на класичному об’єкті мікробіологів – кишкової палички Escherichiacoli. За допомогою спеціальних ферментів – ендонуклеаз рестрикції, або рестриктаз, плазміда, яка несе маркерний ген, наприклад, ген стійкості до певного антибіотику, розрізається в чітко визначеному місці. За допомогою таких же рестриктаз виходить фрагмент геному організму-донора, що несе потрібний ген, наприклад, ген людського інсуліну. Останнім часом донорно ДНК частіше отримують шляхом «пришивання» «липких кінців» до молекули ДНК, що отримано шляхом зворотної транскрипції з матричною РНК потрібного гена (кДНК). Головну роль тут відіграє фермент зворотна транскриптаза, або ревертаза, вперше відкрита у ретровірусів (таких як ВІЛ і деякі збудники злоякісних новоутворень – онковірусів). Далі за рахунок компліментарної взаємодії неспарених основ «липких кінців» відбувається включення потрібного гена в плазміду, при цьому утворюється нова рекомбінантна (гібридна) ДНК. Завершує процес фермент ДНК-лігаза, яка ковалентно зашиває розриви в ланцюгах ДНК. Наступний етап – перенесення рекомбінантної плазміди в бактерію. Такий процесвключення чужорідної ДНК у бактеріальну клітину носить назву трансформації, а молекула ДНК – вектор. Це явище іноді зустрічається в природі, що говорить про те, що трансформація – це природний біологічний процес. У 11 природних умовах трансформація зустрічається у таких бактерій, як збудник пневмонії. Інший спосіб побудови векторних молекул використовує бактеріофаги– особливу групу вірусів, що заражають виключно бактерії. Найбільш широке застосування отримав бактеріофаг. Середня частина генома цього вірусу не несе в собі важливих функцій і може бути замінена на чужорідний фрагмент ДНК. У даний час існує дуже багато векторів, сконструйованих на основі різних плазмід і бактеріофагів. Значно складніше піддати генетичній модифікації еукаріотичні мікроорганізми, до яких відносяться гриби, найпростіші, рослини і тварини. Як і у бактерій, у них є плазміди, але використання їх в якості векторів часто виявляється не дуже ефективним. Тому для того, щоб виник стабільний трансформант, необхідні дві послідовні події: проникнення рекомбінантної ДНК у клітину і її інтеграція в хромосомну ДНК. Такий метод називається інтегративна трансформація. Надалі генно-інженерне конструювання у дріжджів пішло по шляху створення кільцевих плазмід із центромерами, особливими ділянками ДНК, що забезпечують зв’язок із білками веретена поділу і, отже, рівномірний розподіл таких плазмід між двома клітинами під час мітозу. Розвиток цього підходу призвів до створення цілих штучних міні-хромосом, що містять, крім центромірної ділянки, тіломери на кінцях, загнуті у вигляді шпильки, і реплікатори – ділянки початку реплікації ДНК. Подібні мініхромосоми можуть включати відразу кілька корисних генів, що забезпечує виробництво потрібної біотехнологічної продукції. Загальновідомо, що мікроорганізми синтезують низку цінних речовин. Сьогодні, завдяки спрямованим генетичним маніпуляціям, вдається не тільки збільшити продуктивність біосинтезу, а й отримувати речовини, хімічне виробництво яких раніше було неможливо. Харчові добавки, амінокислоти, вітаміни, ароматизатори, ферменти – це не повний перелік речовин, які отримують за допомогою генетично модифікованих мікроорганізмів. У низці випадків, біотехнологічні методи виробництва цих сполук вже замінили традиційний хімічний синтез. Генетично модифіковані мікроорганізми використовуються в даний час для виробництва фармацевтичних препаратів, вакцин, продуктів тонкого органічного синтезу, харчових добавок та інших супутніх сполук харчової промисловості. Ось тільки деякі приклади продуктів мікробного синтезу: – вітамін B2 (барвник, рибофлавін E101), вітамін C (консервант, аскорбінова кислота E300); – загущувач ксантан (E415), регулятор кислотності лимонна кислота (E 330); – консервант, натаміцин (E235), нізин (E 234), лізоцим – (1105); 12 – амінокислоти: глутамат – підсилювач смаку і запаху (E621), аспартам – підсолоджувач (E951) або цистеїн (E921), використовуються для поліпшення якості харчових продуктів і кормів; – ферменти, необхідні для виробництва сирів, хліба, випічки, алкогольних напоїв, соків, сиропів, глюкози, та інших продуктів також – у багатьох випадках отримують за допомогою генетично модифікованих мікроорганізмів. Генетична інженерія дозволяє розширити можливості мікробіологічного виробництва, підвищити мікробну продуктивність і зробити біосинтез економічно більш вигідним у порівнянні з хімічним виробництвом. Клонування в мікробну клітину генів певних метаболічних шляхів дозволяє не тільки істотно збільшити кількість кінцевого цільового продукту, але і добитися синтезу таких невластивих для мікробного метаболізму речовин як, наприклад, інсулін. У випадку, якщо необхідна речовина синтезується мікроорганізмом, що непристосований для зростання в культурі, досить клонувати гени, що відповідають за синтез цієї сполуки в іншу, добре адаптовану для зростання в біореакторі штама. Примітно, що навіть сприятливе середовище для росту бактерій і грибів у культурі часто виробляють з використанням генетично модифікованих організмів. Так, білки, крохмаль, цукор, вітаміни та інші необхідні мікроорганізмам речовини виробляють із генетично модифікованої сої чи кукурудзи. Міжнародні стандарти якості виробництва (GMP) встановлюють вимоги до чистоти таких сполук як вітаміни і харчові добавки. При цьому не відіграє ніякої ролі, були отримані ці сполуки хімічно, біологічно або за допомогою генетично модифікованих організмів. Кінцевий продукт завжди повинен бути хімічно чистим і не містити жодних домішок. Діяльність підприємств, що використовують генетично модифіковані організми, повинна контролюватися урядовими установами. Так, на всій території ЄС вже існують закони, в яких встановлені вимоги до обладнання для біосинтезу, використовуваних мікроорганізмів, а також критерії безпеки та якості кінцевих продуктів. Так як вітаміни та інші харчові добавки ретельно очищюються, і не містять слідів генетично модифікованих мікроорганізмів, то вони не вимагають додаткового маркування. Слід також врахувати, що амінокислоти і ферменти є скоріше допоміжними речовинами, ніж харчовими продуктами, тому вимоги до їх біобезпеки менш суворі. 13  Деякі ферменти, отримані за допомогою генетично змінених бактерій, використовують під час випічки хліба, при цьому борошно освітлюється, а хліб стає більш пухким. У Німеччині за допомогою ГМ-мікробів одержують трансгенні пектинази для виробництва соків, причому доведено, що в готових соках і винах ці пектинази відсутні. Генетична модифікація використовувалася для додання пивним дріжджам низку нових властивостей – наприклад, здатності розкладати різні вуглеводи й білки, привносити в метаболічні процеси зміни, що позначаються на смаку пива (дріжджі зі зниженим продукуванням діацетила, сірководню, двоокиси сірки, диметил сульфіду), змінювати флоккуляційну здатність дріжджів під час шумування й деяких ін. Так, були створені пивні дріжджі, здатні використовувати широкий спектр вуглеводів. Трансформація дріжджів геном глюкоамілази з Aspergillus niger дозволила їм зброджувати декстрини сусла й робити на 1% більше етанолу. Відомі також спроби сконструювати дріжджові штами, які можуть робити гібридний фермент, що виконує одночасно функції азамілази й глюкоамілази, і, тим самим, здійснювати повну деградацію крохмалю під час зброджування цукру. Донорами генів стали Aspergillus niger і A. awamory. Уведення в дріжджі генів р- глюконази з Bacillus subtilis дозволило значно поліпшити фільтрувальність пива й, тим самим, знизити утворення каламуті й осаду. 14