Mikrobiologi & Parasitologi PDF

Mikrobiologi & Parasitologi apt. Muhammad Anugerah Alam Waris, M.Si. Uji Most Probable Number Pendahuluan Air merupakan senyawa kimia yang sangat penting bagi kehidupan umat manusia maupun makhluk lainnya. Fungsinya bagi kehidupan tersebut tidak akan dapat digantikan oleh senyawa lain...

Mikrobiologi & Parasitologi apt. Muhammad Anugerah Alam Waris, M.Si. Uji Most Probable Number Pendahuluan Air merupakan senyawa kimia yang sangat penting bagi kehidupan umat manusia maupun makhluk lainnya. Fungsinya bagi kehidupan tersebut tidak akan dapat digantikan oleh senyawa lainnya. Tubuh manusia terdiri dari 60 – 70% air dan hampir semua kegiatan yang dilakukan manusia membutuhkan air, mulai dari membersihkan diri (mandi), membersihkan ruang tempat tinggalnya, menyiapkan makanan dan minuman sampai dengan aktivitas- aktivitas lainnya. Air menyediakan habitat bagi berbagai jenis mikroorganisme. Sejumlah bakteri dianggap bakteri pengganggu dalam air karena menimbulkan masalah bau, warna dan rasa. Sumber kontaminasi air yang bertanggung jawab terhadap penyebaran penyakit infeksi yang paling sering adalah tinja manusia. Sehingga bakteri fekal koli bisa terdapat dalam air. Bakteri Escherichia coli adalah bakteri oportunis yang banyak ditemukan di dalam usus besar manusia sebagai flora normal. Bakteri ini dapat menyebabkan diare pada bayi dan anak-anak khususnya di negara berkembang. Penyakit – penyakit lain yang disebabkan oleh E. coli diantaranya adalah infeksi saluran kemih (ISK), pneumonia, meningitis, serta infeksi luka terutama luka di dalam abdomen. Escherichia coli memiliki dua macam enterotoksin MPN (Most Probable Number) MPN merupakan perhitungan kelompok bakteri koli mempergunakan JPT (Jumlah Perkiraan Terdekat) / MPN (Most Probable Number), dengan seri 3 – 3 – 3 atau 5 – 5 – 5 tanpa memperhatikan jenis di dalam kelompok tersebut adalah koli fekal atau non- fekal koli. Perbedaan kedua kelompok tersebut dilakukan berdasarkan temperatur inkubasi, yaitu 37oC untuk fekal koli dan 44.5oC untuk non- fekal koli. Untuk mengetahui jenis dari golongan yang didapat, harus dilakukan tes lanjutan, uji lanjutan dengan IMVIC (Indol-Merah metil–Voges-Proskauer dan sitrat) Tahap pemeriksaan MPN: 1. Pemeriksaan pendahuluan / Presumtive test : 1. Penanaman pada media LBDS (Lactose Broth Double Strength) 2. Penanaman pada media LBSS (Lactose Broth Single Strength) 2. Pemeriksaan penegasan/ Confirmative test dengan menggunakan media BGLBB (Briliant Green Lactose Bile Broth) 2% dengan dua suhu inkubasi yang berbeda yaitu 37oC untuk non- 3. fekal koli dan 42oC untuk fekal koli Pemeriksaan lengkap/ Completed test dengan media Endo Agar (EA)/ Eosin Methylen Blue Agar (EMBA) dan IMVIC Sampling Pengambilan spesimen air harus dilakukan secara steril guna memastikan tidak terdapatnya organisme yang mengkontaminasi. Setelah sampel air diambil, diberi label (tanggal, jam, tempat pengambilan) Pengumpulan sampel dengan cara: mengambil sampel. Selanjutnya dilakukan uji penduga, uji penguat serta uji pelengkap. Kemudian nilai MPN dihitung berdasarkan jumlah tabung positif pada uji penguat dengan pertolongan tabel MPN. Cara penanganan dan pengiriman sampel: Pengiriman sampel dilaksanakan secepatnya dalam waktu kurang dari 24 jam. Sebelum dikirim, sampel air disimpan dalam refrigerator. Bila perjalanan diperkirakan akan memakan waktu lebih dari 3 jam, sampel harus dikirim dalam suasana dingin, pada suhu 4 – 10oC.  Prosedur Pemeriksaan (Seri 5 tabung) f. Inkubasi pada suhu 37oC selama 24-48 jam a. Siapkan : g. Amati masing-masing tabung untuk melihat ada atau 5 tabung yang masing-masing berisi 10ml LBDS tidaknya gas. Adanya gas menunjukkan presumtif tes (tabung 1a s/d 5a) positif 5 tabung yang masing-masing berisi 10ml LBSS h. Dari tiap-tiap tabung presumtif yang positif, dipindahkan (tabung 1b s/d 5b) 1-2 ose ke dalam 2 tabung BGLB i. Satu seri tabung BGLB diinkubasikan pada suhu 35-37oC 5 tabung yang masing-masing berisi 10ml LBSS(tabung 1c s/d 5c) selama 24-48 jam j. Satu seri lainnya diinkubasikan pada suhu 44oC selama b. Ke dalam tabung 1a s/d 5a diinokulasikan 24-48 jam masing-masing 10 ml sampel air k. Pembacaan dilakukan setelah 24-48 jam dengan melihat c. Ke dalam tabung 1b s/d 5b diinokulasikan jumlah tabung BGLB yang menunjukkan positif gas masing-masing 1 ml sampel air l. Dari tiap-tiap tabung konfirmatif yang positif, d. Ke dalam tabung 1a s/d 5a diinokulasikan diinokulasikan menggunakan ose secara tipis dan merata masing-masing 0,1 ml sampel air pada permukaan Endo Agar, kemudian inkubasi pada Kocok tabung perlahan agar sampel air suhu yang sesuai dengan suhu dari BGLB selama 24-48 e. menyebar rata ke seluruh bagian media m. jam. Hasil positif (ditandai dengan tumbuhnya koloni berwarna kilat logam) dilanjutkan dengan rangkaian tes biokimia Indol-Merah metil – Voges-Proskauer dan sitrat o Intepretasi (Pembacaan Hasil) Jumlah MPN bakteri golongan Coliform Jumlah MPN bakteri E. coli non fekal : non fekal : Dari hasil tahapan Completed test pada suhu 37oC Pada hasil tahapan tes hitung jumlah tabung yang menunjukkan hasil uji konfirmatif suhu 37oC hitung jumlah biokimia E.coli, kemudian lihat kombinasi hasil pada tabung yang positif dari masing- tabel MPN. masing pengenceran, kemudian lihat Jumlah MPN bakteri E. coli fekal : kombinasinya pada tabel MPN. Jumlah MPN bakteri golongan Coliform Dari hasil tahapan Completed test pada suhu 37oC hitung jumlah tabung yang menunjukkan hasil uji fekal : biokimia E.coli, kemudian lihat kombinasi hasil pada Pada hasil tahapan tes tabel MPN. konfirmatif suhu 40-45oC hitung jumlah tabung yang positif dari *jika hasil tidak tertera pada tabel MPN Hopskin, dilakukan masing-masing pengenceran, perhitungan dengan menggunakan rumus Thomas : kemudian lihat kombinasinya pada tabel MPN.  Skema Kerja Uji MPN Sampel diinkubasi pada media LB selama 24 jam dengan suhu 3 7°C Terbentuk Tidak terbentuk kekeruhan dan gas kekeruhan dan gas Escherichia coli colony Inkubasi dilanjutkan selama 24 jam dengan suhu 37°C Terbentuk Tidak terbentuk kekeruhan 3 kekeruhan clan gas dan gas 1 Tidak terdapat bakteri Coliform 2 Sampel diinkubasi pada media BGLBB selama 24 jam Suhu 44°C (E.coli) 1 Terbentuk kekeruhau Tidak terbentuk kekeruhan dan gas dan gas Inkubasi media EMBA selam a 24 jam dengan suhu 37°C 3 Inkubasi dilanjutkan suhu 44°C selama 24 jam Terbentuk hijau Tidak terbentuk /hitam metalik hijau/hitam metalik Terbentuk Tidak terbentuk kekeruhau kekeru han clan gas clan gas setelah 48 jam setelah 48 jam Terdapat E.coli Tidak terdapat pada sampel E.coli pada Digores pada media l l Tidak terdapar bakteri E.coli yang diuji sampel yang diuji EMBA Lihat tabung gas positif (asam dan gas; harus ada keduanya), lalu hitung tabung positif untuk tiap seri. Tulis kombinasi tabung positif tiap seri (misal : 3 2 1). Kombinasi angka tersebut lalu dicocokkan dengan tabel MPN untuk seri 3 sehingga diperoleh jumlah mikroba sebenarnya. Misalkan. Diperoleh kombinasi jumlah tabung positif : 321 maka jumlah bakteri coliform adalah 150 sel/100 ml. Angka Lempeng Total & Angka Kapang Khamir  Pertumbuhan mikroba (bakteri, kapang, khamir) pada sediaan farmasi dan pangan dapat mengurangi kualitasnya, karena kemampuannya dalam menghasilkan toksin dan menyebabkan infeksi. Tujuan dari uji ini adalah untuk memastikan bahwa cemaran mikroba pada sediaan farmasi dan pangan tidak melebihi batas cemaran yang ditentukan perturan pemerintah (BPOM/ SNI)  ALT Angka Lempeng Total (ALT) = Total Plate Count (TPC) = Aerobic Microbial Count (AMC) = Aerobic Plate Count (APC) Uji ALT adalah uji yang digunakan untuk menghitung jumlah bakteri (ALT), setelah sampel (cuplikan) diinokulasikan pada media pertumbuhan Media uji P C A (Plate Count Agar) Uji ALT dapat dilakukan dengan dua teknik, yaitu teknik cawan tuang (pour plate) dan teknik sebaran (spread plate). Inkubasi selama 24-48 jam pada suhu 37 0 C. Cawan dibalik ALT menunjukkan jumlah bakteri mesofil dalam tiap-tiap 1 ml atau 1 gram sampel yang diperiksa. Satuan: C FU (colony form unit) AKK Uji A K K adalah uji yang digunakan untuk menghitung jumlah kapang khamir (AKK), setelah sampel (cuplikan) diinokulasikan pada media pertumbuhan. Media pertumbuhan P DA (Potato Dextrose Agar)/SDA (Sabouraud Dextrose Agar) Uji A K K dapat dilakukan dengan dua teknik, yaitu teknik cawan tuang (pour plate) dan teknik sebaran (spread plate). Inkubasi selama 5 hari pada suhu 20-25 0 C (AKK). Cawan tidak dibalik A K K menunjukkan jumlah kapang khamir dalam tiap-tiap 1 ml atau 1 gram sampel yang diperiksa. Satuan: CFU (colony form unit) Prosedur Analisis ALT / A K K Sterilisasi Alat dan Bahan, Ruangan Pembuatan Media Pertumbuhan Pengambilan Sampel Persiapan Sampel Homogenisasi Pengenceran Uji ALT/ A K K dan perhitungannya Pengenceran dan Perhitungan  Pour Plate dan Spread Plate Pertumbuhan Mikroba pada media P C A dan PDA ALT 30-300 AKK 10-150  Persyaratan Perhitungan ALT Adanya jumlah ALT yang ditemukan pada suatu sampel dapat dijadikan acuan bahwa sampel tersebut masih layak untuk dikonsumsi atau tidak. Adapun untuk batas persyaratan perhitungan dari ALT adalah : 1. Mikroba yang dapat dihitung 30-300 koloni 2. 300 koloni, spreader atau tak terhingga sehingga tak dapat dihitung 4. Jumlah bakteri adalah jumlah koloni x faktor pengenceran. 5. Perbandingan jumlah bakteri dari pengenceran berturut-turut antara pengenceran yang akhir dengan pengenceran yang sebelumnya. 6. Jika sama atau kurang dari 2 maka hasilnya dirata-rata. Jika lebih dari 2 digunakan pengenceran sebelumnya 7. ALT = J U M L A H KO LO N I X 1/FAKTOR P E N G E NC ERA N  Persyaratan Perhitungan A K K Adanya jumlah A K K yang ditemukan pada suatu sampel dapat dijadikan acuan bahwa sampel tersebut masih layak untuk dikonsumsi atau tidak. Adapun untuk batas persyaratan perhitungan dari A K K adalah : 1. Kapang khamir yang dapat dihitung 15-150 koloni 2. 150 koloni, spreader atau tak terhingga sehingga tak dapat dihitung 4. Jumlah kapang khamir adalah jumlah koloni x faktor pengenceran. 5. Perbandingan jumlah kapang khamir dari pengenceran berturut-turut antara pengenceran yang akhir dengan pengenceran yang sebelumnya. 6. Jika sama atau kurang dari 2 maka hasilnya dirata-rata. Jika lebih dari 2 digunakan pengenceran sebelumnya. 7. A K K = J U M L A H KO LO N I X 1/FAKTOR P E N G E NC ERA N  Pelaporan dan Penghitungan Terdiri dari 2 angka Bila jumlah koloni, semua >300 Contoh: Dipilih pengenceran tertinggi Nilai ALT = 6,38 X 103 cfu/ml, Contoh: maka Nilai ALT = 6,4 x 103 cfu/ml 10-1 = 601 10-2 = 528 Rentang: 30-300 10-3 = 453 Contoh 1: 10-1 = 47 ALT = 4,5 x 105* cfu/mL 10-2 = 18 * (diluar jumlah koloni 30-300) 10-3 = 7 ALT = 4,7 x 102 Bila koloni memenuhi syarat (30-300) Pengenceran tertinggi : Pengenceran terendah = x Contoh 1: Jika x < 2, maka koloni dihitung rata-rata 10-1 = 62 Jika x > 2, maka koloni dihitung dari pengenceran terendah 10-2 = 30 10-3 = 16 Contoh 1: Contoh 2: ALT = 1,8 x 103 10-1 = 284 = 2,8 x 103 10-2 = 38 = 3,8 x 103 10-1 = 124 = 1,2 x 103 Bila jumlah koloni, semua