Hücresel Tedaviler ve Doku Mühendisliği Finali PDF

HÜCRESEL TEDAVİLER VE DOKU MÜHENDİSLİĞİ Dr. Öğr. Üyesi BÜŞRA ÖNCEL DUMAN [email protected] KÖK HÜCRE VE BİYOMÜHENDİSLİK Bilimsel, akademik, Araştırmacı yetiştirilmesi Yeni projeler oluşturulması Toplumsal sorunları çözme Ticarileştirilme Yurt dışına bağımlılığı azaltma Reka...

HÜCRESEL TEDAVİLER VE DOKU MÜHENDİSLİĞİ Dr. Öğr. Üyesi BÜŞRA ÖNCEL DUMAN [email protected] KÖK HÜCRE VE BİYOMÜHENDİSLİK Bilimsel, akademik, Araştırmacı yetiştirilmesi Yeni projeler oluşturulması Toplumsal sorunları çözme Ticarileştirilme Yurt dışına bağımlılığı azaltma Rekabet gücünü arttırma  Kaliteli ve Üretken Akademisyen Araştırmacı Yetiştirme Ürün geliştirme  Aşı, ilaç, tıbbi cihaz, tanı kiti Sağlıkta yapay zeka İnsan hayatını kolaylaştıran sistemler  Tüm hücreler evrim süresince korunmuş ortak, temel özelliklere sahiptirler. Örnek olarak tüm hücreler genetik materyal olarak DNA kullanırlar, plazma zarıyla kuşatılmışlardır ve enerji metabolizmaları için aynı basit mekanizmaları kullanırlar. Diğer yandan günümüz hücreleri çeşitli farklı yaşam biçimleri geliştirmişlerdir. Bakteri, maya ve amip gibi bir çok canlı kendi başına çoğalabilen tek hücrelerden oluşurlar. Daha karmaşık organizmalar; farklı hücrelerin belirli görevleri yerine getirmek üzere özelleştiği, koordine bir şekilde işlev gören hücre topluluklarından oluşmuştur. Örneğin, insan bedeni her biri; hafıza, görme, hareket ve sindirim gibi birbirinden farklı işlevler için özelleşmiş 200 ‘den fazla çeşitte hücreye sahiptir.  Hücrelerin ATP üretimi için kullandıkları mekanizmalar; glikoliz, fotosentez ve oksidatif metabolizmanın evrimsel gelişimi şeklinde 3 aşamada ortaya çıkmıştır. Bu metabolik yolakların gelişimi yerküre atmosferini geliştirmiş ve evrimin yönünü etkilemiştir.  Hücre nedir? Canlının en küçük birimidir, Tüm biyokimyasal ve fizyolojik olaylar bağımsız olarak meydana gelir;  Çoğalabilirler,  Dışarıdan gelen uyarıları alabilirler,  Cevap verebilirler,  Karmaşık kimyasal reaksiyonları gerçekleştirebilirler. Büyütücü merceklerle Mantarın Yapısı Hücrenin varlığı ilk kez 1665 yılında Robert Hooke tarafından ortaya konmuştur.  “Büyütücü merceklerle Mantarın Yapısı” adlı eserinde şişe mantarının yapısını açıklamış ve mantarın içi boş odacıklar halinde olduğunu belirterek bu odacıklara Cellula (hücre) adını vermiştir. Antoni Van Leeuwenhoek ;  1672 spermatozoonları,  1674 protoozonları,  1676 bakterileri,  1682 kaslardaki enine çizgilenmeleri,  1689’ da lökositleri görerek ayırt etmiştir.   1838 de Mathias Jakob SCHLEIDEN ve 1839 da Theodor SCHWANN o zamana kadar bilinenleri toplayarak ilk hücre teorisini kurmuşlardır. Schleiden’in çalışmalarıyla modern sitolojinin temeli olan, hücrenin üç ana yapısını oluşturan zar, hücre içeriği ve çekirdek iyice ortaya konulmuştur. Mikroskobun daha da gelişmesiyle hücre hakkındaki çalışmalar da artmıştır.  Hücrenin Genel Özellikleri  Hücrelerin şekli, rengi ve fonksiyonu bulunduğu yer ve yaptığı işe göre farklılık göstermekle beraber  hücrelerin genel yapısı,  sitoplazma bileşenleri ve  organellerinin işleyişi birbirine benzer özellikler gösterir.  Hücrenin Şekli  Yapısı ve fonksiyonu arasında sıkı bir ilişki bulunduğundan hücrenin şekli, yaptığı işe ve bulunduğu yere göre değişiklik gösterir.  Örneğin: hareketsiz olan yumurta hücresi genellikle küre şeklinde iken, hareketli olan sperm hücresi iğ şeklinde ve kamçılıdır.  Yine bazı hücrelerin şekilleri yaptıkları görev sırasında değişebilir. Örneğin: sıvı ortamda bulunan lökositler küremsi olduğu halde, bunlar dokulara geçerken şekil değiştirirler.  Hücrenin Büyüklüğü  Genel olarak ökaryotik hücreler 10-100 μm kadar büyüklükte olmakla birlikte hücrelerin büyüklüğü yaptığı işe ve bulunduğu yere göre değişiklik gösterir.  Buna karşılık hücre büyüklüğü vücut büyüklüğü ile orantılı değildir. Örneğin: bir fil ile bir farenin karaciğer hücrelerinin büyüklüğü aynı olup, karaciğer büyüklükleri arasındaki fark hücre sayısındaki farklılıktan ileri gelir.  Hücre Sayısı  Canlıların hücre sayısı vücut büyüklüğüne bağlı olarak değişir.  Yetişkin bir insanda kan hücreleri hariç 1013-1014 hücre vardır.  Buna karşılık tüm omurgalı hayvanlarda ve insanda, merkezi sinir sistemi, retina, lens kristali gibi bazı organların hücre sayısı sabit olup sonradan çoğalmaz (kök hücreler?) , sadece hacim olarak artarlar.  Hücrenin Rengi ve Kıvamı  Hücreler çoğunlukla renksizdir, fakat bazı hücreler sitoplazmalarında yer alan pigmentler nedeniyle sarı, kahverengi, siyah, yeşil veya diğer renklerde görülebilirler.  Hücrenin kıvamı, taşıdığı su ve kolloid madde yoğunluğuna göre değişir. Örneğin: beyin hücreleri ile dış tesirlere açık olan derinin üst tabakası farklı viskozitededir.  Kemik hücreleri yumuşak, fakat kemiği oluşturan hücre arası madde, taşıdığı inorganik maddeler nedeniyle, sert olduğu için kemik sert bir yapı kazanır.  HÜCRE ÇEŞİTLİLİĞİ Canlılar aleminde genel olarak 2 tip hücre vardır. Bunlar:  Prokaryotik  Ökaryotik hücrelerdir.  Prokaryotik Hücreler  Prokaryotik hücreye sahip canlılar en ilkel yapılı canlı grubunu oluşturmalarına rağmen bir biyokimya fabrikası gibidirler. Basit kimyasalları kompleks biyokimyasal moleküllere çevirebilirler.  Dünya ekolojisi yönünden oldukça önemli yerleri vardır.  Bunun yanında insanlarda ve diğer canlılarda önemli hastalıklara da neden olurlar.  Prokaryotik canlılar grubu içine bakteri, virüs ve mavi-yeşil algler girmektedir.  Ökaryotik hücreler  Prokaryotların aksine zarla çevrili bir çekirdeğe ve yine zarla çevrili organellere sahiptirler.  Ökaryotlar, tek hücreli protozoonlardan çok hücreli insana kadar bitki ve hayvan tüm canlıları kapsarlar. Hayvan ve bitki hücrelerinin her ikiside bir plazma zarıyla çevrilmiştir ve nukleus, hücre iskeleti ve birçok ortak sitoplazmik organel içerirler. Bitki hücreleri bir hücre duvarıyla kuşatılmışlardır ve kloroplastlarda büyük vakuoller içerirler.  faz-kontrast mikroskobu Laminin ve poly-L Ornithine kaplı lameller üzerinde gerçekleştirilen NKH faz kontrast mikroskobu farklılaşma resimleri (A; 4lük büyütme, B; 10luk büyütme, C; 20lik büyütme, D,E; 40lık büyütme)  3. Hücre Kültürleri  Hücre kültür tekniği, hücre biyolojisi ile ilgili birçok problemin çözümünde kullanılan bir metotdur.  Canlılar kendileriyle ilgili çeşitli besinleri ve büyüme faktörlerini genellikle dış ortamdan temin ederler. İn vitro olarak da hücrelerin büyüyüp gelişmesi için çeşitli dış faktörlere ihtiyaç vardır.  Bu nedenle kültür sistemleri in vivo şartların taklit edilmesiyle ortaya çıkmış olup halen çok yaygın olarak kullanılmaktadır. DAPI cFOS Nestin Olmazsa olmazlar DOKU MÜHENDİSLİĞİ ve UYGULAMALARI  Doku mühendisliğinin ortaya çıkması klinik tıbbın (protezler, rekonstruktif cerrahi, doku ve organ nakli, mikrocerrahi) ve biyolojinin (hücre biyolojisi, biyokimya, moleküler biyoloji, genetik) gelişmesi ile yakından ilintilidir. Neden Yedek Dokulara ihtiyaç var? Doğuştan kaynaklanan anomaliler Birçok doku hasar gördükten sonra kendi kendini onaramıyor: SİNİR, KIKIRDAK, KALP… Kendini onarabilen dokularda büyük bir hasar söz konusu ise onarım ya yetersiz yada eski halindeki gibi değil: örneğin deri Klinik terapi yöntemlerinin ve organ donör sayısının yetersizliği, doku uyuşmazlığı vs. Bir dokuyu başka bir dokunun yerine kullanmak transfer edilen doku ile yeni mikroçevresi arasında uyuşmazlık nedeni ile biyolojik değişimlere neden oluyor. Örneğin idrarın kalın bağırsağa yönlendirilmesi 20-30 yıl sonra kolon kanserine neden olabilir. Deriden özofagus yapmak 30 yıl sonra deri kanserine neden olabilir.  Doku Mühendisliği Doku Mühendisliği Yaklaşımları Büyüme ve Farklılaşma faktörleri Otolog yada donor Scaffold Hücre tabakaları Biyomalzemeler-Doku Mühendisliği-Rejeneratif Tıp Biyomalzemeler Biyoreaktörler Rejeneratif Tıp  Metaller Scaffold Doğal Sentetik Biyobozunur Malzemeler Decellularized tissue Kök Hücre  PRP, SVF Eksozom  Kök hücre nedir? Farklı hücre tiplerine dönüşme potansiyeline ve kendisini yenileyebilme gücüne sahip olan hücrelerdir. Özelleşmemiş ya da farklılaşarak özel işlevler kazanmamış, ana hücrelerdir. 4 4 Kök hücre özellikleri?  Kendini yenileme (self-renewal)  Farklılaşma (Differentiation)  Klon oluşturabilme (Cloning) tek hücreden gelişme (klonalite)  Kök Hücre Tarihçesi  İlk olarak; 1960’lı yıllarda kemik iliğinden ameliyatla alınan kök hücreler lösemi tedavisinde kullanılmıştır.  80'li yılların başında, yeni doğan bebeklerin kordon kanında da kök hücrelerin bol miktarda bulunduğu ve bu hücrelerin tedavide kullanılabileceği fikri ortaya atılmıştır. (Kordon kanı bankacılığı)  1998 yılında ABD’li bilim adamı James Thomson ve ekibi, ilk defa “insan embriyonik kök hücrelerini” laboratuarda embriyondan ayrıştırdılar ve çoğalttılar. KÖK HÜCRE  Kök Hücreler Farklılaşma potansiyeline göre Totipotent kök hücreler Pluripotent kök hücreler (EKH) Multipotent kök hücreler Unipotent (progenitör-öncül) kök hücreler 8 8  Totipotent kök hücreler 2 hücre – morula (4.gün) aşamasındaki hücrelerdir. En yüksek farklılaşma potansiyeli taşırlar. Vücuttaki tüm hücrelere dönüşebilecek potansiyele sahip hücrelerdir Embriyoyu ve embriyoya ait ekstra-embriyonik membran ve dokuları oluşturabilirler,  Pluripotent kök hücreler Erken embriyonik dönemin 5. gününde oluşan blastosistin iç hücre kitlesinden elde edilirler ve embriyoya ait üç germ yaprağından köken alan tüm hücreleri oluşturabilirler Pluripotent Yüksek farklılaşma potansiyeli hücreler, uygun uyarıyla taşırlar. 200 hücre türüne dönüşebilecek güce sahiptirler.  Multipotent kök hücreler Son dönemde sadece bulundukları dokuya ait hücreleri değil farklı dokulara ait hücreleri de meydana getirebildikleri gösterilmiştir (Gritti ve ark, 2002). Bu tip farklılaşma transdifferansiyasyon veya plastisite olarak adlandırılır. Embriyonda ~16. günden itibaren oluşan hücrelerdir. – Nöral krista kaynaklı kh – Mezenkimal kh – Erişkin kh – Hematopoietik kh  Unipotent kök hücreler Sadece tek bir hücre tipine farklandığı bilinen kök hücrelerdir. Progenitör (öncül) hücreler olarak da isimlendirilir. – Osteoprogenitör h. – Kondroprogenitör h. – Hepatosit progenitör h.  Kök Hücreler Yerleşim Yerlerine Göre;  Embriyonik kök hücreler Pluripotent kök hücrelerdir. İç hücre kitlesinden (ICM) elde edilir Self-renewing ile çoğalma becerisi. 200 hücreye dönüşebilir. Bol sitoplazmalı ve büyük çekirdekli yapıya sahiptirler Oct-4, nanog ve Sox2 pluripotensinin devamını sağlar.  Embriyonik olmayan kök hücreler; Fetal kök hücreler Yüksek bölünme ve kendilerini yenileme potansiyeline sahipler. Multipotent özelliktedir. Embriyonun 28. haftasından itibaren organ taslaklarında bulunur. Embriyonik kök hücreye alternatiftirler, çünkü kültür ortamında her türlü hücreye dönüşebilirler.  Embriyonik olmayan kök hücreler Erişkin kök hücreler Erişkin dokularında bulunan kök hücrelerdir. Self renewal-diferansiyasyon Dokularda ölen hücrelerin yerine, yenilerini üretir. Kemik iliği, kas, göz, sinir, karaciğer ve deri gibi tüm dokularda bulunur.  Embriyonik olmayan kök hücreler; Hematopoietik Kök Hücreler Kemik iliği kök hücreleri Periferik kan kök hücreleri Kordon kanı kök hücreleri Embriyonik olmayan kök hücreler; Mezenkimal Kök Hücreler - Kolay elde edilebilir ve - Otolog nakillerde (Kİ-MKH) kullanılabilirler - Göç edebilme yetenekleri, - Bağışık düzenleyici özellikleri, - Tümör oluşturma azlığı, - Yüksek çoğalım kapasitesi vardır - Sitokin-kemokin salgılarlar. GVHD – MKH uygulaması 20 20 Embriyonik olmayan kök hücreler; Organlardaki Kök Hücreler Beyin Dokusu (nöronal) KH Yağ Dokusu (adiposit) KH Epidermal KH Endotelyal KH İskelet kası KH Kalp kası KH Kıl kökü KH Korneal KH Meme bezi KH vb.  Güvenli mi? veriliş yöntemi ve dozun belirlenmesi? Yan etkiler kısa ve uzun dönem? Faz 4 onay sonrası gözlem… Türkiye Sağlık Bakanlığı İlaç Eczacılık Genel Müdürlüğü Avrupa Birliği’nde “European Medicines Evaluation Agency (EMEA)ye ABD’nde “Food and Drug Adminstration (FDA)”a, “New Drug Application (NDA)”a başvurulması gerekmektedir.  Mezenkimal kök hücreler (Mezenkimal stromal hücreler) Erişkin kök hücre tipi olan, mezenkimal stromal hücreler olarak da adlandırılan mezenkimal kök hücreler bağ dokunun ana hücreleridir. Bu hücreler kendi kendini yenileyebilen ve yalnızca mezodermden köken alan kondrosit, osteosit ve adipositlere değil aynı zamanda ektodermik ve endodermik hücrelere de farklılaşma kapasitesine sahip hücreler olarak tanımlanırlar.  Bu hücreler ilk kez 1976 yılında Fridenstein tarafından tanımlamıştır. Fridenstein, fetal buzağı serumu kullanılarak yapılan kemik iliği kültürlerinde – adezyon yeteneği gösteren, – morfolojik olarak fibroblastlara benzeyen hücre kolonilerinin bulunduğunu göstermiş ve – yapılan sonraki çalışmalarda bu hücrelerin hematopoetik  MKH’ler hemen hemen tüm dokularda bulunmaktadır. Kemik iliği, adipoz doku, göbek bağı, kas gibi kaynaklardan kolayca izole edilebilen ve başarılı bir şekilde in vitro’da çoğaltılabilen hücrelerdir. MKH’leri tanımlamada özel belirteçlerin olmayışı nedeniyle, tanımlanmaları – plastik kültür kaplarına yapışma özelliklerine ve – CD29, CD31, CD34, CD45, CD90 ve CD105’i içeren yüzey belirteçleri paneline – aynı zamanda çoklu farklılaşma potansiyellerine göre yapılmaktadır.  MKH’ler hasarlı dokudaki oluşan inflamasyonu immünsüpresif özellikleriyle doku onarıcı olarak fonksiyon gösterebilirler.  Hematopoetik Sistem Hemato…… = Kan ……….poisesis/poietic = üretim Sistemi oluşturan çok sayıda (10’dan fazla) olgun kan hücresinin Özgün fonksiyonu; 1- Dokulara oksijen taşınması 2- İmmün sistemin işlemesi 3- Kanamanın kontrolü gibi temel mekanizmaları kontrol eder.  Hematopoetik Sistem Kan hücrelerinin çoğunun yaşam süresi oldukça kısadır ve sürekli üretim takviye edilmelidir. Ortalama bir insan günde yüzlerce milyar yeni hematopoetik hücreye gereksinim duyar.  Alexander Maximow Hematopoezi, hücresel bir hiyerarşi sonucu ortak öncül (prokürsor) hücreden yani ‘’Hematopoetik Kök Hücre’’den oluştuğunu iddia etti. (1909) Maximow bu hücrelerin kemik iliğinde olgunlaşma süreci ardından dolaşıma katıldığını iddia etmiştir.  Hematopoetik Kök Hücreler Kendi kendini yenileyebilen, Tüm kan dokusunu farklılaşarak oluşturabilen hücrelerdir.  Hemopoetik Kök Hücre Kemik iliğinde “uykuda”dır (quiescent): Hematopoetik kök hücrenin; 1. Bölünerek kendini yeniden üretme özelliği (Mitotik) Self-renewal 2. Farklılaşarak olgun kan hücrelerine dönüşebilme özelliği (Differansiasyon) 3. Farklılaşmaya başlayan hücre, yönlenmiş fonksiyonel hücreye dönüşür (eritrosit-lökosit- trombosit)  Hematopoez Fertilizasyonun 19. gününde embriyonun yolk kesesinde (vitellüs kesesi) başlayan eritropoez fetal hemoglobin üretimini başlatır. Gestasyonun 6. Haftasından itibaren fetal KC esas kan üretimini üstlenir, bu arada lökosit ve trombosit üretimi de başlar. Gestasyonun 6. Ayından itibaren yaşam boyu primer kan üretim merkezi olan kemik iliği esas kan yapım merkezi olarak kontrolü ele alır. Hematopoez (Kan yapımı)  Haemopoetik Büyüme Faktörleri 1- GM-CSF Granulosit -Makrofaj Koloni Uyarıcı faktör 2- M-CSF Makrofaj Koloni Uyarıcı faktör 3- Eritropoietin, Eritropoezi uyarır 4- Trombopoetin, Megakaryopoezi uyarır CD34+  Hematopoez (Kan yapımı) 1. Tüm kan hücreleri ortak pluripotent Kök Hücreden oluşur. 2. Pluripotent Kök Hücreler Kemik İliğinde Myeloid Dizi veya Lenfoid Dizi hücrelerine dönüşmeye yönlendirilir. 3. Multipotent Myeloid kök hücreler tüm myeloid dizi hücrelerini – eritrosit, granülosit (nötrofil, eozinofil, bazofil), monosit ve plateletleri oluşturur. 4. Multipotent Lenfoid kök hücreler lenfoid dizi hücrelerine (B ve T lenfositler) dönüşür  kök hücre kaynakları Mezenkimal kök hücreler – Dental pulpa kaynaklı kök hücreler – Süt dişlerinden izole edilen kök hücreler – Apikal papilla kaynaklı kök hücreler – Oral mukoza kaynaklı kök hücreler – Periost kaynaklı kök hücreler – Tükürük bezi kaynaklı kök hücreler – Yağ dokusu kaynaklı kök hücreler – Pluripotent kök hücreler – İndüklenmiş pluripotent kök hücreler  GMP NEDİR?  GMP (Good Manufacturing Practices) Yani Türkçe anlamı ile İyi Üretim Uygulamaları , ürünün iç ve dış kaynaklardan kirlenme olasılığını önlemek veya azaltmak amacıyla, kuruluşla ilgili iç ve dış şartlara ilişkin koruyucu önlemleri içerir.  Bu uygulama gıda ürünlerinin üretimi ve dağıtımında temel yaklaşımlardan olup ürünlerde kalite sağlamak için hammadde, işleme, ürün geliştirme, üretim, paketleme, depolama, dağıtım aşamalarında kesintisiz uygulanması gereken bir teknikler dizisidir. 2  GENEL Sağlık Bakanlığından; İnsan Doku ve Hücreleri ile Bunlarla İlgili Merkezlerin Kalite ve Güvenliği Hakkında Yönetmelik ( Resmi Gazete Sayı : 27742 / 27 Ekim 2010, madde 10) Türkiye İlaç ve Tıbbi Cihaz Kurumundan; İnsan Doku ve Hücre Ürünlerinin Ruhsatlandırılması ve Bu Ürünlerin Üretim, İthalat, İhracat, Depolama ve Dağıtım Faaliyetlerini Yürüten Merkezler Hakkında Tebliğ (Resmi Gazete Sayı : 28962 / 4 Nisan 2014, madde 11,12,13) 3  GMP TEMEL İLKELERİ 1. Kalite yönetimi 2. Personel ve organizasyon 3. Bina, donanım, ekipman ve materyaller 4. Dokümantasyon 5. Ham ürün girişi, ürün işleme, saklama ve dağıtım 6. Kalite kontrol ve yeterlilik testleri 7. Tüm işlemlerin onaylanması ve yetkilendirilme 8. Şikayetler ve geri çağırma 9. Hataların araştırılması, üretilen ürünlerin kullanım sonrası klinik takibi 10. Örneklerin saklanması, sorunlu, iade edilen ürünlerin imha edilmesi 4 11. İçsel ve dışsal denetim  GMP’ NİN ZORUNLULUKLARI 1. Herhangi bir işe başlamadan önce yazılı ve doğru talimatlara göre çalışıldığından emin olunmalıdır. 2. Bu talimatlara her zaman , kesinlikle hiçbir yerini atlamadan takip edilmelidir. 3. Doğru malzemenin kullanılması sağlanmalıdır. 4. Doğru ekipmanın kullanılmasını ve temiz olmalarının sağlanması gerekmektedir. 5. Kontaminasyonu ve karışmayı önleyecek şekilde çalışılmalıdır. 6. Etiketleme hatalarına karşı her zaman dikkatli olunmalıdır. 7. Çalışanlar dahil olmak üzere her şey temiz ve düzenli tutulmalıdır. 8. Her zaman hatalara, yanlışlara ve kötü olaylara karşı hazırlıklı olunmalı ve bunlar derhal rapor edilmelidir. 9. Tutulan raporların ve yapılan kontrollerin doğruluğundan emin olunmalıdır. 5  İYİ ÜRETİM UYGULAMALARI (GMP)’NIN GENEL PRENSİPLERİ  Hücre tedavi ürünlerinde yüksek kalite önemlidir. Böylelikle kanın toplanması , kan komponentlerinin işlenmesi, depolanması ve dağıtılması yüksek kalite sağlamaya yönelik olarak organize edilmiş olmalıdır. Bu da ancak kalite yönetim sistemi ile gerçekleşecektir.  Hücre tedavi ürünlerinin üretiminde kalitenin sağlanmasında önceleri uluslararası organizasyon standartları (ISO) yeterli görülmüştür. 6  İYİ ÜRETİM UYGULAMALARI (GMP)’NIN GENEL PRENSİPLERİ ISO 4 ana komponente sahiptir: a- ISO9000: Kalite kontrol yönetim sistemi temelleri ve tanımlamaları b- ISO9001: Kalite yönetim sistemi c- ISO9004: Performansın artırılmasında kalite yönetim sistemleri el kitabı d- ISO9011: Kalite ve çevre denetim el kitabı Görüldüğü gibi ISO standartları her tür organizasyonun kalite uygulamalarına yardımcı olmak üzere geliştirilmiş ve daha genel bir kalite yönetimini tanımlamaktadır. GMP ise ISO9002 komponentlerini içeren ve tıbbi ürünlere özgü ilave gereksinimlerin de karşılandığı daha spesifik bir kalite yönetim sistemidir. 7  İYİ ÜRETİM UYGULAMALARI (GMP)’NiN GENEL PRENSİPLERİ GMP 5 temel prensip üzerine kurulmuştur: 1. Üretimini yapacağın işlerin ayrıntılarına karar ver (ürün tipleri, kontrolleri, onayları) 2. Yapacağın her şeyi yaz (Standart uygulama yöntemleri (Standart operating procedures=SOP’lar), ekipmanlar, laboratuarlar vb) 3. Yazdığın her şeyi yap (Eğitim, yeterlilik, proses kontrol) 4. Yaptıklarını Kanıtla(kayıtlar, denetimler) 5. Hataları düzelt ve kaliteyi artır ( işlemleri izle, soruştur ve sonuçlar çıkart) 8  TEMİZ ODA KURULUMU Temiz Odalar kapsam olarak; şartlandırılmış ve kontrol edilebilir havalandırma sistemlerine sahip hijyenik özel odalardır. Tasarımda; Sıcaklık, nem, canlı ve cansız kirleticiler, hava akış yönleri ve basınç gibi parametrelerin kontrolü gerekmektedir. Sıcaklık ve nem kontrolündeki amaç; yapılan çalışmalardan kaynaklanan özel koşullar dışında, temiz odada çalışan insanlar için konforlu bir ortam temin edebilmektir. Temiz odalarda özel giysiler içinde çalışan insanların daha fazla kirletici üretmemesi için konfor koşullarının çok yüksek seviyede tutulması zorunludur.  TEMİZ ODA KURULUMU Temiz Odaların Performansı; Oda içerisindeki partikül konsantrasyonuna bağlı olarak değişir. İstenilen kirlilik sınıfını elde edebilmek için, temiz oda tasarımında kullanılacak malzemelerin ve uygulama ekiplerinin niteliğinin çok yüksek olmasının yanı sıra, uygulama aşamasında ve sonrasın da yapılacak test, ölçüm ve kalibrasyon kalitesi de önemlidir. Temiz oda panelleri; Her iki yüzünde en az 2 mm kalınlıkta yüksek basınçla preslenmiş laminant (HPL- high-pressure laminantes) kullanılır. İç izolasyonu EPS (30 dansite) malzemeden yapılır. Partisyon paneller +/- 100 Pa basınca dayanıklı olarak üretilir.  TEMİZ ODA KURULUMU Temiz odalar, TSE ve GMP (Good Manufacturing Practices) standartlarına uygun, hijyenik ve sızdırmaz özellikte, düz ve kolay temizlenebilir, pürüzsüz yüzeye sahip malzemelerden oluşmaktadır. Airlock; İki kapıdan oluşan, hepa filtreler ile temiz hava üflenen küçük bir odadır. Diğer odaların basınç değerlerinin bozulmaması için bir kapı kapanmadan diğer kapı açılamaz. Temiz oda girişlerinin bu kurala uygun olarak yapılabilmesi için, airlock kullanılması zorunludur. Malzeme girişleri için aynı prensip ile çalışan Pass Box pass box sistemleri kullanılır. Temiz oda içi ile dışı arasında malzeme geçişi Temiz odaların tasarımı, ISO 14644-1 clean room sağlayan elektronik standardına göre sınıflandırılmıştır. kontrollü manyetik kilitli özel kutudur. TEMİZ ODA KURULUMU 12  EKİPMAN VE PARAMETRELER Genel bir kök hücre laboratuvarında izlemeye dahil edilen ekipmanlar ve izlenen parametreler tablosu şu şekildedir; 1 3  1.Personel ve Malzeme Giriş – Çıkış İHTİYAÇ MALZEMELER - El yıkama lavabosu - El dezenfeksiyon cihazı - Steril eldiven - Dış eldiven ; renksiz – beyaz - İç eldiven ; renkli mavi-turuncu - Steril iç kıyafet - Maske, Koyu renk – lacivert - Steril dış kıyafet - İçlikten daha açık renk – mavi , beyaz - Başlık, Tulum, Patik, Gözlük 1 - Steril alan telefonu 4  1.Personel ve Malzeme Giriş – Çıkış UYGULAMADA ÖNEMLİ NOKTALAR - Steril eldivenin aseptik teknik ile giyilmesi - Eldiven dışına derinin temas etmemesi esastır  1.Personel ve Malzeme Giriş – Çıkış UYGULAMADA ÖNEMLİ NOKTALAR -Steril kıyafetin aseptik teknik ile giyilmesi Vücut açığa çıkacak şekilde soyunmamak Uzun kollu fanila olmalı, Normal alan pantolonu kalmalı. Tekrar kullanılan kıyafetin sterilizasyon öncesi yıkanması, kurutulması, özel katlama tekniği ile içinin dışa katlanması Eller kıyafetin dışına değmeden giyilmesi Paketi delinmiş kıyafet ve eldiven giyilmemesi Giyinme sırası ; - ağız maskesi - başlık – tulum – patik - gözlük -Özel steril kıyafet kumaşı ve özel dikim tekniği ile min. parçalı dikilmiş olmalı veya tek kullanımlık kıyafet 1 6 1.Personel ve Malzeme Giriş – Çıkış UYGULAMADA ÖNEMLİ NOKTALAR - Steril alan giriş çift kademeli hava kilitli oda - İlk oda ; maske , 1.eldiven , iç kıyafet giyilmesi -İkinci oda ; dış kıyafetlerin, 2.eldivenin, gözlüğün giyilmesi -Hava kilidi (air locked) odalarda karşılıklı kapılarda kilit (inter locked)  1.Personel ve Malzeme Giriş – Çıkış UYGULAMADA ÖNEMLİ NOKTALAR - Steril alan giriş çıkış tek yön GİRİŞ ÇIKIŞ  1.Personel ve Malzeme Giriş – Çıkış UYGULAMADA ÖNEMLİ NOKTALAR - Atlama seti ve ayakkabı değişimi  2.Malzeme Sterilizasyonu STERİLİZASYON Herhangi bir cismin veya maddenin, birlikte bulunduğu tüm mikroorganizmaların sporlar dahil tamamen yok edilmesi işlemidir. * Sterilite Güvenlik Seviyesi (sterility assurance limit) Sterilizasyondan sonra ortamda canlı mikroorganizmaların bulunma ihtimalidir. Günümüzde kabul edilen seviye 1/1.000.000 ( log 10-6 ) 20  2.Malzeme Sterilizasyonu STERİLİZASYON METODLARI a. H2O2 / Buhar sterilizasyonu (Steam Sterilization) - Saturated Pure Steam (Otoklav) - Vapor-Phase Hydrogen Peroxide (İzolatör, Temiz Oda) b. Kuru Hava Sterilizasyonu (Dry-Heat Sterilization) - Sterilization/Depyrogenization Tunnel (Tünel) - Sterilization/Depyrogenization Oven (Fırın) c. Gaz sterilizasyonu (Gas Sterilizasyonu) - Ethylene Oxide (Otoklav) - Formaldehit (Otoklav) - Gas-Phase Hydrogen Peroxide (İzolatör) 21  2.Malzeme Sterilizasyonu d. İyonlaştırıcı radyosyon (Ionizing Radiation) - GAMA (Cobalt 60, radyo izotop bozunması) - X-ray Radyasyonu - Electron Radyasyonu e. Filtrasyon - Sterilation Grade Filter (0,22 µm filtre- likit , gaz/hava) 22  2.Malzeme Sterilizasyonu 3 Majör grup vardır. 1. Katı veya içi sıvı dolu sızdırmaz yükler 2. Gözenekli yükler 3. İçi boş , boru-hortum şeklindeki yükler 23  2.Malzeme Sterilizasyonu UYGULAMADA ÖNEMLİ NOKTALAR *Sterilizasyon paketlerinin polimer tarafı her zaman üste, tyvek kağıt tarafı alta gelmelidir. * Otoklava yerleşimde aynen bu biçimde olmalıdır. 24  2.Malzeme Sterilizasyonu UYGULAMADA ÖNEMLİ NOKTALAR Yükler arası uygun boşluk bırakılmalı. Uygun hava tahliyesi ve buhar penetrasyonu bu şekilde sağlanmalıdır.  2.Malzeme Sterilizasyonu UYGULAMADA ÖNEMLİ NOKTALAR *Sterilizasyon paketi içerisine içi boş ağzı kapalı kap, şişe yerleştirilmemelidir. *Boş kaplar ve şişeler ağzı açık en az yan ve mümkün olduğu kadar dik olarak ağzı aşağıya gelecek şekilde yerleştirilmelidir.  2.Malzeme Sterilizasyonu UYGULAMADA ÖNEMLİ NOKTALAR * Hassas parçaların zarar görmemesi için uygun paslanmaz tel sepetlere aralıklı olarak parçalar birbirine temas etmeyecek şekilde yerleştirilmelidir. İğneler, İnce borular 27  3.Alan ve Ekipman Dezenfeksiyonu DEZENFEKSİYON Mikrobiyal kontaminasyonun kabul edilebilir limitlere çekildiği, bakteriyel sporların büyük bir kısmının etkilenmediği, gerçek anlamda bunlar dışındaki mikroorganizmaların ortamdan yok edilmesi ve indirgenmesi işlemidir. 28  3.Alan ve Ekipman Dezenfeksiyonu DEZENFEKSİYON YÖNTEMLERİ UV ışını ile (254 nm) Dezenfektan ile ; -Bakterisid -Fungusid -Sporisid 29 3.Alan ve Ekipman Dezenfeksiyonu UYGULAMADA ÖNEMLİ NOKTALAR Çalışma Öncesi ve Sonrası Çalışma Sırasında  3.Alan ve Ekipman Dezenfeksiyonu UYGULAMADA ÖNEMLİ NOKTALAR Dezenfektan(Bakterisid, Fungusid vb.) değişim periyodu max 15 günde bir; GENEL UYGULAMA VE İDEAL YAKLAŞIM 1 Hafta Tek Sefer 1 Hafta Bakterisid, Fungusid Sporisid Bakterisid, Fungusid Kullanımı Kullanımı Kullanımı 31  3.Alan ve Ekipman Dezenfeksiyonu UYGULAMADA ÖNEMLİ NOKTALAR Dezenfektan Hazırlama; ( yada hazır steril dezenfektan kullanımı) Her zaman aynı konsantrasyon Eğitimli belirli personel Belirli değişmeyen malzemeler Etkinlik analizi Etiketleme; - Hazırlık Tarihi - Steril Filtrasyon Tarihi - Son Kullanım Tarihi - Hazırlayan 32 3.Alan ve Ekipman Dezenfeksiyonu UYGULAMADA ÖNEMLİ NOKTALAR Dezenfeksiyon aseptik tekniklere göre yapılır 2 1 3 33  3.Alan ve Ekipman Dezenfeksiyonu UYGULAMADA ÖNEMLİ NOKTALAR Bir öncekinin %20 üzerine binerek tek yön ve nemli kalacak şekilde sınırlı hareket le olur. 34  4.Çevre izleme UYGULAMADA ÖNEMLİ NOKTALAR Sürekli izlemenin sistematik bir program ile yapılması Canlı Partikül - Pasif hava numuneleme - Aktik hava numuneleme - Rodac veya Swap ile numunelem e - Alan diyagramı numune noktaları - Trend değerlendirme 35  4.Çevre İzleme UYGULAMADA ÖNEMLİ NOKTALAR Cansız Partikül - LAF altı işlem sırasında - Odadan işlem sırasında - LAF altı hava hızı ölçülmelidir. 36  5.Havalandırma Sistemi ve Re-Kalifikasyon TEMEL GEREKLİLİKLER - İlgili alanın gerekliliğine göre şartlandırma yapmak. - Otomasyon kontrollü ve trend alınabilir olmak. 37  5.Havalandırma Sistemi ve Re-Kalifikasyon Uygun oda üfleme ve laminer kabin üfleme noktaları Uygun oda emiş ve laminer kabin emiş noktaları 38  5.Havalandırma Sistemi ve Re-Kalifikasyon RE-VALİDASYON UYGULAMADA ÖNEMLİ NOKTALAR A-B Sınıf Alan : 6 ayda bir HEPA filtre sızıntı, hava hızı-debi, C Sınıf Alan : 6-12 ayda bir HEPA filtre sızıntı , hava hızı-debi, D Sınıf Alan: 18-24 ayda bir oda kalifikasyonu, hava debi Test Otomasyonunda Duman (Smoke) Testleri başlangıç ve periyodik 24-36 ayda bir yapılır. 39  6.Temiz Oda Dizaynı (Cleanroom) 1. Ekipmanların zeminden yüksekte ölü nokta olmadan dezenfekte edilebilir olmalıdır. 2. B ve C sınıfı odalarda duvar-zemin birleşimi kavisli olmalıdır. (2,5 - 4 inch çap) 3. Antistatik , minimum partikül yayınımı yapan paneller kullanılmalıdır. 4. Zemin girintisiz, düz, epoksi tarzı özel kaplamalı olmalıdır. 5. B alanda drenaj olmamalıdır, C ve D alanda min. sayıda olabilir (eğer gerekli ise) 6. Steril alan kolay izlenebilir olmalıdır. 7. Tavan yüksekliği 2,8m olmalıdır. 8. Kapı dilleri ve contası girintisiz, temizlenebilir olmalıdır. 9. B sınıfı odalarda; aydınlatma teknik alandan müdahale 40 edilebilir olmalıdır. 6.Temiz Oda Dizaynı (Cleanroom) 41  6.Temiz Oda Dizaynı (Cleanroom) Alanlar arası kademeli geçiş ve farklı basınç oluşturulmalıdır. C D Sınıf Sınıf Sınıfsız Alan Alan Alan 42 6.Temiz Oda Dizaynı (Cleanroom) 43 6.Temiz Oda Dizaynı (Cleanroom) Görseller 44 6.Temiz Oda Dizaynı (Cleanroom) Görseller 45 6.Temiz Oda Dizaynı (Cleanroom) Görseller 46 6.Temiz Oda Dizaynı (Cleanroom) Görseller 47 6.Temiz Oda Dizaynı (Cleanroom) Görseller 48 6.Temiz Oda Dizaynı (Cleanroom) Görseller 49  6.Temiz Oda Dizaynı (Cleanroom) Steril alan , hijyenik olmayan bir alandan izlenebilir olmalıdır. 50  ÖZET Steril Alan İşletiminde Önemli Başlıklar; Personel ve malzeme akışı Sterilizasyon Dezenfeksiyon Çevre İzleme Havalandırma ve Re-Kalifikasyon Dizayn 51 NEDEN GMP? İnsan sağlığını doğrudan etkileyen ürünlerin üretiminde hijyenik koşulların sağlanması gerekir. Hijyenik koşulların sağlanması ve üretimin bu koşullarda yapılması GMP (Good Manufacturing Practices; İyi Üretim Teknikleri) uygulanması ile gerçekleşir. GMP bir ürünün hammadde ve ambalaj malzemelerinden başlayarak tüketiciye ulaşana kadar etkin ve güvenli olması için uyulması gereken kurallar bütünüdür. GMP’de amaç sıfır hata, hedef ise sürekli kalitenin sağlanmasıdır. 5 2  İnsan sağlığı için üretimi yapılan her ürünün, üretimin tüm aşamalarında ve hasta uygulamalarında yüksek kalite seviyesine sahip olması gereklidir. Bu bağlamda, son yıllarda önce tavsiye kararı olarak başlayan, sonra ABD ve Avrupa topluluğu (AT) üyeleri tarafından uygulanması, zorunlu kılınan kararlara göre her türlü kan ve kan ürünü, doku, kök hücre bankacılığı, hücre ve gen tedavi ürünlerinin GMP koşulları altında üretimlerinin yapılması gerektiği bildirilmiştir. Sonuç olarak, önümüzdeki yıllar ülkemizin bu sistemle tanıştığı ve GMP uygulamalarına adım adım her alanda geçişinin başladığı bir dönem olacaktır. Kriyoprezervasyon  Kriyoprezervasyon Hücrelerin veya dokuların sıfır derecenin altındaki sıcaklıklarda biyolojik aktivitelerinin durdurularak, gelecekte kullanılması amacıyla saklanmasıdır.  Kriyoprotektanlar Dondurma besiyerine eklenen makromoleküllerdir. Hücreleri dondurma ve çözme esnasında intraselüler buz kristali oluşumundan ve solüsyon etkilerinden korur.  Hücre dondurmada kriyoprotektanların rolü Hücre zarını stabilize etmek, Hücrelerde oluşabilecek ozmotik stresi en aza indirmek Hücre içi ve hücre dışı buz kristali oluşumuna karşı hücreleri korumak  1948, Polge ve ark. -70 ° Cde gliserolle tavuk spermatozasını 1950, Smith ve ark. gliserolde insan kırmızı kan hücrelerini 1959, Lovelock and Bishop DMSOnun koruyucu etkisi. 1964- cryobiology terimi literatürde “cryo”=cold, “bios”=life, “logos”= science ideal bir krioprotektanın özellikleri; toksik ve immunojenik olmamalı hücre canlılığı ve karakterini max korumalı düşük moleküler ağırlıklı ve düşük derecelerde bile suda yüksek çözünürlüğü olmalı minimum buz kristallerine sebep olmalı En sık kullanılan Dimetil Sülfoksit (DMSO) + Serum karışımı  1- Geçirgen Kriyoprotektanlar Solüsyonun donma noktasını düşürüp, viskoziteyi arttırırlar. Hücre içi suyu yerini değiştirerek, hücre içinde geniş buz kristalleri oluşumunu engellerler. Buz olarak donacak suyun miktarını azaltırlar. Hücrelerin artmış tuz ve solüt konsantrasyonuna maruziyetini azaltırlar. (dimethyl sulfoxide (DMSO), gliserol, Propilen Glikol(PG) ve Etilen glikol(EG))  NASIL YAPAR? (DMSO) DMSO intraselüler bir ajandır, ekstraselüler elektrolit dengesini sağlar ve intraselüler ve ekstraselüler ozmolarite farkını azaltarak dehidratasyon hasarını önler. Oda ısısında hücrelere toksiktir bu nedenle +4 de sabit hızla eklenmeli ve hemen dondurmaya alınmalıdır. DİMETİL SÜLFOKSİT (DMSO) Kokusuz ve renksiz Serumdaki yarılanma ömrü 20 saat Renal yolla atılır Hücre içine hızlı difüzyon 2- Geçirgen olmayan Kriyoprotektanlar Düşük Moleküler ağırlıklı olanlar; Dondurma öncesi hücreleri büzerek hücrelerin su dengesini değiştiriler. (sükroz, maltoz, trehaloz, sorbitol ve Asetamid) Yüksek Moleküler ağırlıklı olanlar; Hücre membranı hasarlarını kapatırlar. Çözme sonrası hasar görmüş hücre membranını tamir ederler. (polivinil pirorolidon (PVP), dekstran, HES, fetal sığır serumu (FBS), BSA)  HİDROKSİETİL NİŞASTA (HES) Ekstraselüler kriyoprotektandır. Dondurma sırasında hücre dışında bir zırh oluşturarak dehidratasyonu engeller. Penetran bir koruyucu ile %5 DMSO, %6 HES ve %4 HSA DMSO+HES ??  Kriyopreservasyon Süreçleri Kültür kabından ayırma (tripsin, accutase, triple vs..) Dondurma Depolama Çözme Tekrar ekme  Hücreler? Dondurma? Çözme? Hücre içi ve dışı buz kristali oluşumu Kriyoprektanların sitotoksisitesi Osmotik hasar Nekroz Apoptoz Hücresel yaşlanma  Yavaş Dondurma Precooling (4°C’de 15 dk) 1°C/dk. -80°C ye kadar sıvı nitrojen XiaXu et al.Effects of osmotic and cold shock on adherent human mesenchymal stem cells during cryopreservation. J Biotechnol. 2012 Nalgene ® Mr. Frosty ®Cryo 1C Freezing Containers Çapraz bağlı polietilen non-absorbant köpük Mr. Frosty 14 örnek kapasiteli. Alt kısmına %100 izopropil alkol eklenerek kullanılır. Her 4-5 kullanımdan sonra değiştirilmelidir. -70 C/ -80 C’ de an az 4 saat bekletilmelidir. Donmuş olan vialler uzun süreli saklama için - 130C ‘ nin altına transfer edilmelidir CoolCell® Cell Freezing Containers Daha fazla örnek kapasitesi (30 örnek) Alkol kullanımına ihtiyaç yoktur. CoolCell Mr. Frosty Alkol kullanımı yok Her 5 kullanımda alkol Yılda 12 lt IPA tasarrufu değişimi gerekli Tüm vialler eşit derecede Alkol degredasyonu ısı Radyal simetrik dizaynı ile dağılımını etkilemekte viallerdeki ısı dağılımı Çift sıralı vial bölmeleri, iki garantisi farklı dondurma oranı oluşturur Daha ekonomik Her hafta alkol değişimi yaklaşık 350$/yıl Atık alkol Sıvı sızdırma tehlikesi yok Donduktan sonra kapak Donduktan sonra kolay açılımı zor. kapak açılımı Sıvı sızdırma tehlikesi var 5 dakika içinde yeniden Tekrar kullanım için yaklaşık kullanım şansı 1 saat bekleme süresi Programlanabilir Kontrollü/ Kademeli Soğutucu (Planer) Kullanıcı tanımlı ayarlanabilir. Validasyon için data elde edilebilir. Hassas (40  C ile -160  C arasında) Farklı örnek kapasiteleri için farklı modeller mevcut.  Metot Avantajlar Dezavantajlar Elektrikli Dondurucular Daha düşük maliyetli Saklama ısısı nitrojene göre (-135°C/ -150° C) Sabit sıcaklık daha yüksek Teknik bakımı kolay Sıvı Faz Nitrojen Sabit düşük sıcaklık (-196°C) Düzenli sıvı nitrojen Manuel mekanizma sağlanması gerekmekte Yüksek maliyet Sıvı nitrojen nedeniyle çapraz kontaminasyon riski Buhar Faz Nitrojen Sıvı nitrojen nedeniyle Yüksek maliyet çapraz kontaminasyon riski Düzenli sıvı nitrojen yok sağlanması İstenilen düşük ısı Isının -135°C ve -190 °C Kullanım kolaylığı arasında değişmesi 20  Vitrifikasyon Hücre yüklü KPA süspansiyonu- sıvı azot- sulu fazdan- camsı yapı - yüksek dondurma hızı – equilibrium vitrification – non-equilibrium vitrification taşıyıcı tabanlı sistemler(Cryoloops (700,000 °C/min), quartz microcapillaries (250,000 °C/min) and plastic straws (2500 °C/min)) taşıyıcı bağımsız sistemler (micro- droplets of cell-laden CPA followed by ejection into liquid nitrogen)  Vitrifikasyon  Hızlı dondurma (2500 °C/min)  Ultra-hızlı dondurma (20000 °C/min) Embryo, sperm.. kompleks dokular için – Amniyon kaynaklı kök hücreler Moon JH (2008) – umbilical cord Wharton’s jelly Marquez-Curtis LA (2015) – insan embryonik kök hücre kaynaklı adacık öncül hücreleri (hESC-IPs). Lahmy R (2015) – Embryonik kök hücreler (nöroküre olarak) Coopman K (2011) – Kanser kök hücreleri (nöroküre olarak) Chong YK (2009)  YAVAŞ DONDURMA VİTRİFİKASYON Kriyoprotektan kullanımı Düşük Yüksek Dondurma hasarı riski Yüksek Düşük Çözme sonrası canlılık Yüksek Daha yüksek Kriyoprotektanların Düşük Yüksek toksisite riski Potansiyel patojenik Düşük Yüksek bulaşma Operasyonel beceri Kolay El becerisi gerekli Yong KW, et al (2015) Cryopreservation of human mesenchymal stem cells for clinical applications: current methods and challenges. Biopreserv Biobank 13(4):231–239  Embryo, ovum dondurma Vitrifikasyon kristalleşmeyi en aza indirmek için yüksek başlangıç konsantrasyonlarında kriyoprotektanlar ve ultra-hızlı soğutma kullanılır.  Hematopoetik Kök Hücreler DMSO en sık kullanılan kriyoprotektan (% 5–10) Hydroxyethyl Starch (HES), yüksek moleküler ağırlıklı bir kriyoprotektan, eritrosit kriyoprezervasyonunda Polyvinyl alcohol (PVA) eritrosit kriyoprezervasyonunda yeni bir kriyoprotektan. Beyaz kan hücrelerinde precooling çok önemli görülmesede yavaş hızda dondurma daha etkin 2°Cden -150’ye- 1 saatten 2 saate kadar yavaş hızda dondurma Abbruzzese L, et al (2010) A new freezing and storage procedure improves safety and viability of haematopoietic stem cells and neutrophil engraftment: a single institution experience. Vox Sang 98:172–180 Dijkstra-Tiekstra M, et al (2014) Optimization of the freezing process for hematopoietic progenitor cells: effect of precooling, initial dimethyl sulfoxide concentration, freezing program, and storage in vapor-phase or liquid nitrogen on in vitro white blood cell quality. Transfusion 12:3155–3163  %3 HES + %5 %10 DMSO DMSO Hücre canlılığı GM-CFU aktivitesi  iYD-MKHlerin fenotip, çoğalma, ve osteojenik farklılaşma potansiyellerinde 5–10% dimethyl sulfoxide (DMSO)nun uzun dönemde olumsuz depolama etkisi bulunmamış.(Yong KW ve ark., 2015) Erişkin insan beyin sub-ventricular zone öncül hücreleri, (Ayuso-Sacido A ve ark.,2008) Fetal KC kök/öncül hücrelerinde de benzer sonuçlar.. (Norstrom A. ve ark. 2006)  Diş pulpası kök hücrelerinin dondurulması %5 DMSO- yavaş dondurma daha etkin Huynh NC et alSimplified conditions for storing and cryopreservation of dental pulp stem cells.. Arch Oral Biol. 2017 - Serum-Free Cell FreezinTgicari solüsyonlar - mFreSR™ ✦ MeKd ulila ıma hazır unm ✦ Kullanıma hazır ✦ Serum, hayvansal bileşen ve protein içermeyen ✦ Serum içermeyen ✦ Hücre hatları için uygun (3T3, HEK-2 93, CHO, HELA) ✦ DMSO içerikli ✦ EKH ve iPKH için uygun ✦ TeSR Medium ile kullanıldığında daha verimli - CryoStem™ Freezing Medium - CryoStor® CS2/CS5/10 ✦ Kullanıma hazır ✦ Kullanıma hazır ✦ Serum, hayvansal bileşen ve protein içermeyen ✦ Serum, hayvansal bileşen ve protein içermeyen ✦ EKH ve iPKH için uygun ✦ %2, %5 ve %10 DMSO içeriği seçenekleri ✦ Metilselüloz ve DMSO içerir ✦ cGMP - MesenCult™-ACF Freezing Medi - MSC Freezing Solution ✦ Kullanıma hazır ✦ Kullanıma hazır ✦ Serum ve hayvansal bileşen içermeyen ✦ Serum, hayvansal bileşen ve prote in içermeyen ✦ DMSO içerikli ✦ Farklı kaynaklardan insan MKH içi n uygun ✦ cGMP ✦ Metilselüloz ve DMSO içerir ✦ MesenCult™ ile kullanıldığında daha verimli  EKH Hatları - Stem Cell BANKER GMP grade ✦ Kullanıma hazır ✦ Serum, hayvansal bileşen ve protein içermeyen ✦ FDA tarafından onaylı ✦ DMSO (10%) ve İnorganik Tuzlar (≦10% ) ✦ Tüm kök hücreler ve iPKH için uygun MKH Hatları (Kordon Kanı Kaynaklı MKH) STEM-CELL BANKER kullanılarak 72 saat sonunda çözülmüş dondurulmuş(2x105) (-196C’ de) Önerilen Yöntemler Dondurma: *Adherent hücreler için uygun solüsyonla hücreler kaldırılır. *200-300 x g ‘ de 3 ile 5 dk arası santrijüj edilir. *Peleti soğuk dondurma solüsyonu ile mililitresinde 3-5x10⁶ hücre olacak şekilde süspanse edilir. *Hücreleri kademeli(dakikada 1-2⁰C) bir şekilde dondurduktan sonra sıvı nitrojen içerisinde saklanır. Çözme: *Çözme işlemi 37⁰C’ de gerçekleşmeli. *Hücreler serumsuz mediumda oranı en az 1:10 olacak şekilde süspanse edilir. *Santrifüj ve yeniden süspanse edildikten sonra istenilen oranda ekilir. Önerilen Yöntemler  %60 bazal besiyeri %35 FBS %5 DMSO Soğuk 600 μl bazal besiyeri + 350 μl FBS karışımında 3x10⁶ hücre Kriyoviallere dağıtılır ve hızlıca 50 μl DMSO -150 ⁰C sıvı azot  SONUÇ Kriyoprezervasyon prosedürleri için genel formül 'serum + kültür besiyeri + kriyoprotektan ajan‘dır. Kriyoprezervasyon işlemlerinde hücre türlerine ve hassasiyetlerine dikkat edilmelidir. Gelişmiş kriyoprezervasyon prosedürleri geliştirirken, kriyoprotektanlar, soğutma hızı ve uygulanılacak basamaklar, saklama ve çözme sıcaklığı üzerinde durulmalıdır. Çözülme sonrası hücrelerin yıkama işlemleri, hücrelerin hassasiyetleri doğrultusunda yapılmalıdır. Temel Hücre Kültürü ve Aseptik Teknikleri  Bölüm 1: GİRİŞ Tissue Culture: Doku Kültürü Cell Culture: Hücre Kültürü Harrison, 1907: Yöntemi hayvan hücrelerinin davranışını, normal homeostasis veya deney stresinden kaynaklanabilecek vücut içi (in vivo) sistemik değişimlerden bağımsız olarak çalışmak için geliştirmiştir. Doku kültürü: Terim olarak başlangıçta dağıtılmamış doku parçalarının kültürünü ifade ederken, günümüzde dokudan izole edilmiş hücre kültürü için de kulanılmaktadır. Hücre ve Doku Kültürü Gelişimindeki Kilometre Taşları Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) mouse sarcoma cells  Terimlerin Tanımı Doku Kültürü (tissue culture): organ kültürü ve hücre kültürünü içine alan genel bir terim Organ Kültürü (organ culture): parçalanmamış ve vücut içi histolojik özelliklerinin bir kısmını veya tümünü muhafaza eden üç boyutlu doku kültürü Hücre Kültürü (cell culture): enzimatik, mekanik veya kimyasal olarak hücre kaynağından ayrıştırılmış hücrelerden oluşan kültürdür. Hücre kaynağı: doğal doku, primer kültür, hücre dizisi ( cell line) vs. Histotipik Kültür (histotypic culture ): Hücrelerin doku benzeri hücre yoğunluğuna sahip üç boyutlu yapı haline getirildiği kültürdür. Örnek: sıvı ortamda ve agar üstünde oluşturulmuş hücre agregatları, kollajen jel içinde büyütülmüş üç boyutlu hücre kültürü Organotipik Kültür (organotypic culture): farklı hücre türlerinin birlikte kullanıldığı kültürleri tanımlar. Örnek: deri özdeşinin elde edilmesi için epidermal keratinositlerin dermal fibroblastlarla birlikte kullanılması Doku Kültürü Uygulamaları Doku Kültürü Uygulamaları Doku Kültürü Uygulamaları Doku Kültürü Uygulamaları Doku Kültürü Uygulamaları Doku Kültürü Uygulamaları Doku Kültürü Uygulamaları Doku Kültürü Uygulamaları Doku Kültürü Uygulamaları  Doku Kültürünün Tıpta Kullanımı IVF, endometrium ko- kültürü Hücresel Tedavi: Kök Hücreler, genetiği değiştirilmiş /düzeltilmiş hücreler Doku Kültürünün Avantajları Doku Kültürünü kısıtlayan konular  In vitro-in vivo farklılığı Üç boyutlu dokudan hücre izolasyonu ile iki boyutlu kültüre geçilmesi: heterotipik hücre etkileşiminin kaybı Homeostatik regülasyon (sinir ağı, endokrin sistem) kaybı Enerji metabolizması: in vitro’da temelde glikoliz Doku Kültürü Çeşitleri  Hücre kültürü için temel gereksinimler Cam malzemenin temizlenmesi ve yeniden kullanıma uygun hale getirilmesindeki zorluklar yüzünden pek çok laboratuvar, tek kullanımlık (disposable) hücre kültür plastik malzemeleri kullanmaktadır.  Hücre kültürü için temel gereksinimler Malzeme Sayı Otoklav, büyük, yada küçük lab için masaüstü 1 Terazi, güç adaptörü olan elektronik 1 Kabin, klass II biogüvenlik 1 Santrifüj, düşük hızda, soğutmalı 1 Sayım kamarası 2 Pipet, steril, 1 ml 1000 Pipet, steril, 10 ml 1000 Pipet, steril, 25 ml 500 Mikropipet 1 Flask, steril, 25 cm2 100 Hücre kültür tüpleri, 16 x 125 mm 10 000 Kryovialler, 2 ml ve 4 ml 1000 Dondurucu, -20 C°, evtipi, non-frost 1  Hücre kültürü için temel gereksinimler Malzeme Sayı Inkübatör, standart 1 Likit nitrojen tankları, 25–20 litre nitrojen depolamak için 1 Likit nitrojen depolama sistemi 1 Medyum filtrasyon sistemi, otoklavlanabilir 2 pH-Metre 1 Mikroskop, inverted 1 Mikroskop, standart 1 Mikser, vorteks 1 Fırın, sıcak hava sterilizatörü (etüv) 1 Buzdolabı, evtipi 4 C° 1 Manyetik Karıştırıcı, ısıtıcılı 1 Dondurucular için depolama sistemi 1 Test tüp sporu 16 mm’lik tüpler için 6 Distile su cihazı, bi- yada tri-distile, cam 1 Hücre kültürüne özel immunhistokimya uygulamaları için geliştirilmiş çeşitli tipte kültür kapları  Laboratuvar niteliği ve işleyişi Hücre kültürü alanlarına gerekli ve görevli personel dışında kimse girmemelidir. Hücre kültürü alanı ya da laboratuvarı, yalnızca hücre kültürü amaçlı ayrılmalı ve laboratuvarın diğer işlerinin yapıldığı bölümlerinden izole edilmelidir. Her bir hücre kültürü çalışma istasyonunda, tüm çalışma malzemeleri işlem için hazır halde bulundurulmalıdır. Mümkün olduğunca hücreler ile işlem sırasında kabin dışına çıkmak engellenmelidir.  Laboratuvar niteliği ve işleyişi Laboratuvar yerleşimi, personelin buzdolabı, dondurucu, santrifüj ve inkübatör vb arasında gidip gelmeyi ve tüm hareketlerini kolaylaştıracak şekilde olmalıdır. Lavabolar, mikrobial kontaminasyon kaynağı olabileceği için hücre kültürü alanında kullanımından kaçınılmalıdır.  Laboratuvar niteliği ve işleyişi Güvenlik açısından likit nitrojen depo odası iyi bir havalandırma sistemine sahip olmalıdır. Aşağıdaki işlemler için standart çalışma prosedürleri kullanılmalıdır: – atık dezenfeksiyonu ve imhası; – santrifüj ve biogüvenli kabinler (Biosafety Cabinets, BSCs) gibi ekipmanların dezenfeksiyon prosedürleri; – su banyosunun temizliği/dezenfeksiyonu; – çalışma alanlarının ve zeminlerin temizliği/dezenfeksiyonu; – kontaminasyon ve toz (örn: yüksek düz yüzeyler, kabinlerin arka ve dış kısımları, ekipmanların alt ve arka yüzeyleri, buzdolabı ve dondurucuların içi) oluşumunu önlemek için yapılan periyodik temizlik.  Laboratuvar niteliği ve işleyişi Tüm ekipmanların kayıtları; firma tarafından yapılan doğrulama, kurulum ve çalışma aşamalarındaki tüm basamakları içerecek şekilde tutulmalıdır. Laboratuvar denetleyicisi, her bir laboratuvar için bir çalışanını, ekipmanın çalışma ve güvenlik kayıtlarından sorumlu olarak görevlendirmelidir.  Laboratuvarın Yerleşimi Kalifiye ve yeterli sayıda personel, İş akışının tek bir yönde olması, Aletlerin iş akışına uygun şekilde yerleştirilmesi, Alanın çok dar yada geniş olmaması, Hava filtrasyonu, – “Class II” (Partikül sayısı 1.000.000 ile 10.000.000 arası) standardında olmalıdır. – 0.3 mikron HEPA (High Efficiency Particle Air) filtre – pozitif basınç ile verilmelidir. Elektrikli aletlerin (inkübatör, buzdolabı, mikromanipulatör, mikroskop vs.) kesintisiz güç kaynaklarına bağlı olması,  Laboratuvarda Uyulması gereken Kurallar Laboratuvara çalışan personel dışındaki kişilerin girmesi kesinlikle yasaktır. Personelin laboratuvara giriş çıkışı sadece personel girişi/çıkışı için belirlenmiş bölümden yapılır. Laboratuvar genelinde tüm birimlerde laboratuvar forması, bone ve maske giyilmesi zorunludur.Dışarı çıkarken formanın üzerine mutlaka beyaz önlük giyilmelidir. Personele ve geçici olarak laboratuvarda bulunan kişilere ait tüm özel eşyalar, yiyecek içecek maddeleri ve kişisel bakım ve makyaj malzemeleri, personel girişi için ayrılmış bölümde bulundurulacaktır. Laboratuvar içerisine başka herhangi bir özel eşya, yiyecek/içecek sokulması kesinlikle yasaktır. Laboratuvara her girişte eller mutlaka sabun ile yıkanmalıdır.  Laboratuvarda Uyulması gereken Kurallar İşlemler sırasında mutlaka pudrasız steril eldiven giyilmeli ve aseptik tutuş teknikleri uygulanmalıdır. Laboratuvarda hücre kültürü için uygunluğu onaylanmış ve steril tek kullanımlık malzemeler kullanılmalıdır. İlk kez kullanılacak bir malzeme mutlaka test edilmelidir. Ortam değişikliklerini en az seviyede tutmak için inkübatörler açılıp kapatılırken çok dikkat edilmelidir. Kapaklar kısa süreli ve sadece bir elin girebileceği kadar açılmalıdır. İşlemlerin tümü, laminar air flow altında yapılmalıdır. Hücrelerin (embriyonik kök hücre yada gamet ve embriyo hariç) bulunduğu ortam, önce deterjan sonra alkol kullanılmalıdır. Kullanılan tüm malzeme ve kaplar uygun biçimde etiketlenmeli ve etiketler işlemlerin her aşamasında kontrol edilmelidir.  Laboratuvarda Uyulması gereken Kurallar Her bir hücre dizisi, tek başına işleme sokulmalı, tüm örnekler aynı anda çalışmaya alınmamalıdır. Her günün sonunda çöpler laboratuvardan uzaklaştırılmalı ve yüzeyler deterjan ve %70'lik etil alkol ile silinmelidir. Belli aralıklar ile tüm aletlerin bakımı ve dezenfeksiyonu yapılmalı ve tarihleri cihazların üzerine yazılmalıdır. Laboratuvar formları, düzgün el yazısı ile eksiksiz olarak doldurulmalıdır. Laboratuvarda bir sorumluluk zinciri oluşturulmalıdır. Hücre kültürü laboratuvarında günlük gerçekleştirilen işlemlerin (pasaj, dondurma-çözme vb.) kimler tarafından ne zaman yapıldığı açıkça yazılmalıdır.  Ekipmanın kullanımı 1) Biyolojik güvenlik kabinleri (Biological safety cabinets, BSCs) ve Laminar Air Flow Sistemleri, LAF Class II Biological safety Çalışma alanının temizliğinin ve çevre ve çalışanın korunmasını sağlamaktadır. Kapılardan ve yoğun trafikten uzak yerleştirilmelidir.  Ekipmanın kullanımı 1) Biyolojik güvenlik kabinleri (Biological safety cabinets, BSCs) ve Laminar Air Flow Sistemleri, LAF Çalışılan yüzeyleri, işlem öncesinde ve sonrasında ve günün sonunda deterjan (7x, farmacidal vb) ve %70’lik alkol ile temizlenir. 6 ayda bir Biyomedikal departmanı tarafından partikül ölçümü yapılır. Aynı periyotta LAF içi HEPA filtreler değiştirilir. Ön filtrelerin (profiltre) değişim periyodu ise üç ayda birdir.  Ekipmanın kullanımı 1) Biyolojik güvenlik kabinleri (Biological safety cabinets, BSCs) ve Laminar Air Flow Sistemleri, LAF Çalışmaya başlamadan 10–20 dakika önce kabin çalıştırılmalıdır. Hava akımını bozacak derecede hızlı hareketler yapılmamalıdır. Sıvılar ile işlem yaparken yavaş hareketler yapılarak aerosol oluşumu önlenmelidir.  Ekipmanın kullanımı 1) Biyolojik güvenlik kabinleri (Biological safety cabinets, BSCs) ve Laminar Air Flow Sistemleri, LAF Kabin kalabalık olmamalıdır, hava akımı deliklerinin önü kapalı olmamalıdır. Çalışma alanı, henüz steril olan kullanılmamış solusyonların ve kültürlerin birbiri ile temas etmesini önleyecek şekilde düzenlenmelidir (örn. Sıvı atık çöpü solda, steril medyumlar sağda, kültür ise ortada olmak üzere yerleştirilebilir). Kayıt tutulan not kağıtları, labotuvar defteri vb dökümanlar, BSC’nin içine yada zeminine sokulmamalıdır. Çünkü hava akımını kesebilir, enfekte mikroorganizmalar ile kontamine olabilir ve bu malzemeler, dezenfeksiyona uygun değildir.  Ekipmanın kullanımı İnkübatörler: Mezenkimal hücre kültüründe (somatik hücre kültürü) hücreler, inkübatör koşullarına daha az hassas iken; Embriyonik kök hücre kültür sisteminde (embriyonik kök hücre eldesi öncesi -gamet ve embriyo kültürü- ve sonrası -embriyo yapısına çok benzeyen embriyonik kök hücre dizilerinin kültürü- için), hücreler inkübatör içi değişimlere oldukça hassas olduğu için günlük ölçümler oldukça önemlidir. Laboratuvar içerisinde kullanılan her bir inkübatör için günlük olarak sıcaklık, karbondioksit ve nem değerleri kontrol edilir ve kaydedilir. Gece boyunca inkübatör kapakları açılmadığı için kontroller sabah, işlemler başlamadan önce ve inkübatörün stabil olduğu zaman yapılmalıdır.  Ekipmanın kullanımı İnkübatörler: Su seviyeleri düzenli olarak kontrol edilir. En az ayda bir kez olmak üzere inkübatörlerin genel temizliği ve kalibrasyonu yapılır. Temizlik için – inkübatör kapatılarak suyu boşaltılır. – Raflar Farmacidal ve %70 etil alkol ile temizlendikten sonra sterilizasyona gönderilir. – İnkübatörlerin içi önce farmacidal ve %70 alkol, daha sonra steril su ile yıkanarak steril bezlerle iyice kurutulur. – Tekrar kullanmadan önce raflar yerleştirilerek steril su konur ve kalibrasyon işlemi başlatılır.  Ekipmanın kullanımı İnkübatörler: Yeni model inkübatörlerde inkübatör içi sterilizasyon sistemleri mevcut olduğundan adı geçen sterilizasyon işlemi temizlik sonrası otomatik olarak başlatılmaktadır. Kalibrasyon bitince manuel olarak ısı, CO2 ve nem ölçümü yapılır. İnkübatörlerin bakımı periyodik olarak 6 ayda bir yetkili servis tarafından gerçekleştirilir ve iç filtreler değiştirilir.  Santrifüj Periyodik olarak, hücre süspansiyonları, alt kültürleme, hücrelerin konsantrasyonunu artırmak veya yıkamak için santrifüjleme gerektirir. Orantılı olarak kontrol edilen frenleme ile tercihen küçük bir tezgah üstü santrifüj, çoğu amaç için yeterlidir. Hücreler, 80-100 g'da tatmin edici bir şekilde çökelir; Yüksek yerçekimi hasara neden olabilir ve pelet kümeleşmesine neden olur. Sitosantrifüj Ultrasantrifüj Soğutmalı santrifüj  Besiyeri ve ayıraçların Hazırlanması Isıya-dayanıklı ayraçların sterilizasyonunda (121C°’de en az 15 dakika ve 15 psi (100 kPa) basınçta), otoklav kullanılır. Isıya-dayanıklı olmayan ayraçlar, kabin içinde filtre edilerek (0.22 μm por-büyüklüğü) depolanacağı kabın içine aktarılarak steril edilir. Bazı ayraçlar ise, örn. glukoz solusyonları, ancak belli bir ısıya kadar dayanabilir ve otoklavlanabilir (115C°’de, 10 psi’da (70 kPa) ve 15 dakika için). Hazırlanan tüm besiyerleri için düzenli kayıt tutulmalıdır. Üzerine ise ham maddelerin oranı, alikot oranı ve tarih mutlaka yazılmalıdır. Gün ışığından uzak ve uygun ısıda saklanmalıdır.  Sterilite testi Filtrasyon tamamlandığında, membranın intakt/sağlamlığı “hava kabarcığı/bubble point” testi ile kontrol edilir. Eğer membran intaktsa hava, 0.22 μm’lik por- büyüklüğüne sahip membrandan çok büyük bir güç sarfedilmedikçe (75 psi/500 kPa basıncın altında) geçmemelidir. Filtrenin membranı, hava kabarcığı testini geçtikten sonra medyum – alikotlanıyorsa başlangıç, orta ve son kısımlarından 2’şer ml; – alikotlanmadıysa tek örnek alınarak 37C°’de 72 saat için inkübe edilerek kontaminasyon testi yapılır.  Sterilite testi Herhangi bir alikotta bulutlanma var ise atılır ve tüm parti resterilize edilir. Eğer medyumlar, depolandıkları yerde bulutlandı ise tüm parti atılmalıdır. Tüm medyumlar, kullanmadan önce göz ile doğru pH (renk) ve kontaminasyon işaretleri kontrol edilmelidir. Medyum uzun zaman boyunca depolandığında medyum şişesinin dibinde çökelti görülüyor ise düşük-grade kontaminasyon olabilir. Şişe nazikçe döndürüldüğünde spiral bir yükselti görülüyorsa kontaminedir ve atılmalıdır.  Hücre kültürü laboratuvarı işleyişi Saflık (Purity): Bakteri ve mantar gibi mikroorganizmalarla kontaminasyon normalde hücreleri ve risk altındaki laboratuvarda bulunan diğer kültürleri öldürecektir. Orjinallik (Authenticity): Hücre dizilerini kazara farklılaştırmak yada kültürler arasında kros- kontaminasyon, yanlış yada kayıp bilgiye neden olur. Stabilite (Stability): hücre kültürleri, uygun şekilde pasajlanmazsa, genetik ve fenotipik özelliklerinde bazı değişiklik işaretleri gösterir.  Hücre kültürü Canlı bir doku veya organdan alınan küçük bir parçanın in vitro ortamda büyütülmesi ve çoğaltılması işlemine verilen isimdir. – Primer doku eksplantları veya hücre süspansiyonlarından üretilebilir. kültür kaplarına 37 C0’de 6-7 gün transfer Primer hücre kültürü  HÜCRE KÜLTÜRÜ YÖNTEMLERİ Hücreler çoğalma özelliklerinden dolayı birkaç gruba ayrılabilir: – —Uzun dönem kültürü yapılabilen hücreler Somatik hücrelerden – fetal ve erişkin kaynaklı kök hücreler: Kİ-MKH, AD-MKH vb – Fetal organlardan köken alan hücreler – diferansiye/matür hücreler: fibroblastlar, epitelyal hücreler vb daima çoğalan hücreler, – —İn vitro ortamda uyarıldığı zaman kültür edilebilen hücreler: Karaciğer, periferal lenfosit ve makrofajlar gibi in vitro ortamda uyarıldığı zaman çoğalan hücreler, – —Kısa dönem kültürü yapılabilen hücreler: Sinir sistemi, gamet hücreleri ve gözün bazı hücreleri gibi yasam boyu bir kez çoğalan (hücre kültürü ile yapılan pek çok çalışmada, bazılarının çoğalabildiği gözlenmiştir) hücrelerdir. – —Sınırsız süre kültürü yapılabilen hücreler: Normal olmayan bir gruptur; doğal olarak apoptozise uğramayan, ölümsüz olduğu kabul edilen ve sürekli çoğalan tümör hücreleridir. Bu gruba ayrıca embriyonik kök hücreler de farklılaşmadan kültür edildiklerinde sınırsız bölünme özelliğine sahip olduğu için dahil edilebilir.  Hücre kültürü Genel olarak süspansiyon kültür ve monolayer kültür K562-KML-süspansiyon kültürü olmak üzere ikiye ayrılırlar: – Süspansiyon kültürler genellikle kan, kemik iliği ve bazı tümör hücrelerinden yapılan, kültür kabına yapışmayan kültürlerdir. Gametler (sperm ve oosit) ve embriyo kültürü de bu tip Sünnet derisi-fibroblast kültürün en önemli elemanlarıdır. – Monolayer kültürler yapışma ihtiyacı hisseden amniyon hücreleri ve fibroblastlar gibi hücrelerden hazırlanırlar. K562-KML- Süspansiyon Kültür: Yapışma ihtiyacı yok. süspansiyon kültürü 7.gün Diş Pulpası-MKH- Monolayer Monolayer Kültür: Bir yüzeyde çoğalan hücrelerin tek katlı bir tabaka oluşturması. hücrelerin bir yüzeyde tek tabaka olarak üremesi, Örnek: insan deri keratinositleri, Morfolojik yapısı (A) (B) Şekil: Morfolojik yapı.(A) normal insan deri keratinositleri, ve (B) farklılaşmış insan deri keratinositleri Örnek: insan deri fibroblastları, Morfolojik yapısı (A) (B) Şekil: Morfolojik yapı.(A) normal insan deri fibroblastları, ve (B) yaşlı insan deri fibroblastları  Hücre kültürünün basamakları 1) İnsan yada hayvanın doku yada organından alınan parçaya (1mm3-1cm3) biopsi yada eksplant denir. 2) a) Vücut sıvılarından (doğal tek hücre süspansiyonlarından) doğrudan ekilmesi yada b) Eksplantın doku veya organdan alındıktan sonra kültür kabına – doğrudan yada – tek tek hücre solusyonu oluşturarak ekilmesi ve kültür edilmesi primer kültür aşamasını oluşturur. 3) Primer kültürdeki hücrelerin, – populasyonun artması ve kültür kabının yüzey alanının yetmemesi nedeniyle – kültür kabından alınıp başka kültür kaplarına aktarılarak çoğaltılmasıyla elde edilen kültürlere de sekonder kültür denirken yapılan bu işleme sub- kültür yada pasajlama adı verilmektedir.  Hücre dizisi (Cell line) Hücre dizisi: – Uzun dönem kültürü yapılabilen sınırlı yada sınırsız bölünme/mitoz kapasitesinde olan, – sağlıklı mitozlardan sonra stabil kalabilmiş, – homojen bir hücre popülasyonu olarak tanımlanmaktadır. Genellikle de ilk akla gelen örnekler, kanser hücreleridir. – Aslında sürekli hücre dizileri (Continuous cell line) olarak adlandırılır: – Bunlar ya hastadan doğrudan olarak izole edilir, ya laboratuvar ortamında yapay olarak onkogen kullanılarak (SV40 T) Yada p53 gibi hücre siklusunu düzenleyen genlerde mutasyon oluşturularak elde edilmiş kanser hücreleridir. Kök hücreler – Uzun dönem kültürü yapılabilen erişkin/fetal kaynaklı MKH’ler – Sınırsız süre kültür edilebilen embriyonik KH’ler He-La-İnsan serviks karsinomu PC3-Prostat karsinoma  Hücre kültürünün kaynakları 1- Doku-organ parçacıkları (Eksplantlar), A. Doğrudan eksplant kültürü B. Parçalanmış (disagrege/disasosiye) eksplanttan elde edilen tek hücre süspansiyonlarının (single cell suspension) kültürü Graviteye bırakma yada Ardışık santrifüjleme: – sıvıdan uzaklaştırma dışında hiçbir seleksiyon özelliği yoktur. Gradiyent: – Yarı-seleksiyon: bir yada birkaç hücre tipi ayrıştırılabilir, Seleksiyon (negatif-pozitif) – Gelişmiş bir seleksiyon yöntemidi 2- Vücut sıvıları/Tek hücre süspansiyonları (kan, beyin omurilik sıvısı BOS, amniyon sıvısı, bronchoalveoler lavage (BAL) sıvısı, plevral, peritoneal, perikardial, sinovial ve Kİ vb) A. Doğrudan eksplant kültürü kültür kaplarına transfer 0 37 C’de 8-10 gün  Sünnet derisi explant kültürü Eksplant – dokunun organizasyonu nispeten bozulmamış küçük parçası, Sünnet derisi- fibroblast Plasenta- Decidua Plasenta- Villus  B. Parçalanmış (disagrege/disasosiye) eksplanttan elde edilen tek hücre süspansiyonlarının (single cell suspension) kültürü 1-Eksplantın Antibiyotikli solusyonla Yıkanması ve arındırılması 2-Mekanik Parçalama 3-Enzimatik Minced Parçalama Kıyma 1x1x1 mm 4-Enzimin 5-Hücre 6-Kültür Uzaklaştırılması Konsantrasyonunun ve yıkama belirlenmesi kaplarına 7-İnkübasyon (kültür Medyumu) ekim Primer Kültürlerin Hazırlanmasında Kullanılan Enzim ve Kimyasallar Dispaz Pronaz Elastaz Tripsin Kollagenaz Hiyalüronidaz  Mekanik Parçalama 1 2 Doku Petri kabına alınır Adipoz doku Antibiyotikli burada antibiyotikli besiyeri içine alınır besiyeri ile yıkanır 3 4 En son petride doku mins edilir Makas ile parçalara ayrılır  Enzimatik Parçalama 5 6 Mins edilen dokular tüplere alınır 5ml coll eklenri 37C deki Ç.Su banyosuna konur 60dk. Dokular parçalanıncaya kadar. Dokular parçalanınca istenirse 7 8 Süpernatant kısmı atılır 70µl hücre süzgeçinden geçirilir. 5ml PBS eklenir 1800 rpm-10dk. Eğer doku kanlı ise lysıng yapılır Süpernatantı atılır ve yıkama işlemi için 5 ml PBS eklenir. 1300 rpm -5 dk. 5 6 370C İnk. Ekim 7 8 2. Vücut sıvıları/Tek hücre süspansiyonları (kan, beyin omurilik sıvısı BOS, amniyon sıvısı, bronchoalveoler lavage (BAL) sıvısı, plevral, peritoneal, perikardial, sinovial ve Kİ vb) 1 2 1300-5 dk. Amniyotik sıvı 3 4  C. Seleksiyon (negatif-pozitif) Flow-Sitometri (FACS-Aria), Rosette Sep  9 10 1300-5dk. Ekim 11 37C İnk.  Hücre teorisi Bütün organizmalar bir yada daha fazla hücreden oluşur. Hücre yaşayan bütün canlıların yapı ve organizsayonlarının temel birimidir. Bütün hücreler var olan hücrelerden oluşur. (genetik materyalin aktarımı)  Bazı çok küçük canlı organizmaların incelenmesinde gözümüz yetersiz kalır.  Gözün algılama kabiliyetini yükseltmek için görüş açısını büyütmek gerekir. Işık yoluna konan bir mercek veya mercekler sistemi görüş mesafesi içinde bulunan objelerin görüş açısını oldukça büyütebilir.  Görüş açısının büyütülmesinde kullanılan en basit mercek “lup” adı verilen büyüteçtir. Daha fazla büyütmeler için mikroskoba gereksinim vardır. Mercek büyüdükçe, görüş alanı daralır, detay artar !  Mikroskobun yapısı objeyi büyütmeye yarayan optik kısım bu kısımların üzerine monte edildiği taşıyıcı kısım  Taşıyıcı kısım Mikroskop ayağı : Mikroskobun ağırlığını taşıması amacıyla dengeyi sağlayacak biçimde U şeklinde veya yuvarlak yapılmıştır. Mikroskop gövdesi : Mikroskobun bütün parçalarının tespit edildiği kısım. Mikroskop tablası : Bazen sabit,kimi mikroskoplarda hareket edebilen ve ortasında ışığın geçmesine yarayan bir delik bulunan tabladır.Üzerine incelenecek objeyi koymaya yarar, üzerinde preparatı sabit tutacak maşalar olabilir. Mikroskop tüpü : İç içe geçmiş iki veya tek madeni borudan ibaret olan tüp, oküler ve objektif tablasını taşır. Mikroskop ayar vidaları : Tüpün aşağı ve yukarı hareketi sağlayan dolayısıyla görüntüyü netleştiren büyük (makro) ve küçük (mikro) vidalardır.  Optik kısım Oküler : Göze gelen tarafta bulunan yakınsak bir mercektir. İçinde obje üzerinde belirli bir noktayı göstermeye yarayan ok bulunabilir. Objektifler :Mikroskop tüpünün alt ucunda dönebilen bir tabla üzerine yerleştirilmiş hakiki görüntüyü sağlayan yakınsak mercekler bulunur. Kondansatör : Işık kaynağından gelen ışığı toplayıp objeye yansıtarak incelenecek preparata az veya çok ışık düşmesini sağlar.Küçük bir ayar vidası kondansatörü aşağı veya yukarı hareket ettirir. Diyafram : Işık kaynağı ile obje arasında bulunan küçük metal levhacıklardan yapılmış bir kısımdır.Bu kol vasıtasıyla açılıp kapanabilir.  Mikroskopta görüntü elde etme Mikroskopta bir objeyi görmemiz, objektif ile elde edilen hakiki görüntünün oküler aracılığı ile daha büyütülmüş hakiki olmayan bir görüntüye çevrilmesiyle gerçekleşir. Mikroskobik büyütme oküler ve objektif büyütmelerin çarpımı sonucu elde edilir. Örneğin, oküler büyütmesi 10,objektif büyütmesi 40 ise total büyütme 10x40=400 olur  Mikroskobun kullanımı 1.Mikroskop lambası yakılır veya ayna vasıtası ile bir ışık kaynağından ışık alınmak suretiyle önce net bir görüntü sahası sağlanır. 2.En az büyüten objektif (en kısa olan) tüpün altına gelmek üzere objektifleri taşıyan kısım çevrilir. Tabla ve objektif arasındaki mesafe 3cm den az olmamalıdır. 3.Diyafram kolu hareket ettirilerek incelenecek objeye göre ışık miktarı ayarlanır.  Mikroskobun kullanımı 4.İncelenecek obje deliğin tam ortasına gelecek şekilde lam,lamel yukarı gelmek üzere tabla üzerine yerleştirilir. 5.Büyük vida çevrilerek objektif indirilir. Objektif ile obje arasındaki mesafe 0.5cm olmalıdır. Yan taraftan bakılarak kontrol edilir. 6.Okülerden bakarken büyük vidayı hareket ettirmek suretiyle objeyi net görünceye kadar tüp yukarı kaldırılır. 7.Objeyi daha net görmek için küçük vida ileri geri hareket ettirilir. Işık miktarını tekrar ayarlamak için diyafram kolu hareket ettirilir.  Mikroskobun kullanımı 8.İncelemek istenen sahayı taramak için bir elle (veya tarama vidalarıyla) lam hareket ettirilip diğer elle ince ayar vidasıyla devamlı netlik sağlanmalıdır. 9.Küçük objektifle netleştirilen sahayı daha fazla büyütmek için objektif tablası döndürülerek daha fazla büyüten objektiflerle inceleme yapılabilir.Daima en küçükten başlayıp büyüğe doğru gidilmelidir.100x objektifleri immersiyon yağı olmadan net görüntü veremeyeceğinden gereksiz yere kullanılmamalıdır.Objeyi net görebilmek için küçük vida hareket ettirilir.  Mikroskoplar 3 gruba ayrılır. 1. Işık Mikroskopları 2.Elektron Mikroskopları 3. Atomik force mikroskopları  Işık Mikroskopları 1- Basit ışık mikroskobu 2. Floresan Mikroskop 3. Konfakal mikroskop 4. Faz- kontrast mikroskop 5. Stereo mikroskop Elektron mikroskopları 1.Scanning Elektron Mikroskobu(SEM)= taramalı EM 2. Transmission Elektron Mikroskobu (TEM)= geçirimli EM Işık mikroskobu  Floresan mikroskobu Cisimlerin kendilerine gelen ışınları ve bu ışınlardaki dalga boylarını yansıtmaları olayına floresan denir. Görüntü elde edebilmek için bu ışınlarla karşılaştığında floresan veren boyalar kullanılır.  Floresans mikroskopisi  Floresan mikroskop ile 0.1μm kadar olan cisimler incelenebilmektedir.  Bu mikroskop normal ışık mikroskobu ile aynı yapıda olup ondan ışık kaynağı ve bazı optik parçaları yönünden farklılık gösterir.  Işık kaynağı olarak ultraviyole dalga boyunda ışık veren, civa buharlı ampuller kullanılmaktadır. (ör: Farklılaşmaya alınan nöral kök hücrelerde GFAP proteini ifadesi) DAPI cFOS Nestin  Faz kontrast mikroskobu Faz kontrast mikroskobuyla sıvı ortamdaki mikroorganizmaları boyamadan morfolojisi, kapsülü ve DNA morfolojisi hakkında bilgi edinilir.  faz-kontrast mikroskobu Laminin ve poly-L Ornithine kaplı lameller üzerinde gerçekleştirilen NKH faz kontrast mikroskobu farklılaşma resimleri (A; 4lük büyütme, B; 10luk büyütme, C; 20lik büyütme, D,E; 40lık büyütme)  Konfokal mikroskobu Floresan mikroskobunun bir gelişmiş modelidir. Bu teknoloji araştırmacılara ulaşılabilecek en yüksek ışık mikroskobu çözünürlüğü ile hücre altı yapılar, fonksiyonları ve hücre/organizma yapısının temiz bir şekilde görüntülenmesini sağlar. Tüp bebek laboratuvarı Patoloji laboratuvarı  Elektron mikroskobu Organizmaların 3 boyutlu ve daha detaylı bir şekilde incelenmesine olanak veren yüksek enerjili elektronlar ile yüzeyin taranması prensibi ile çalışır. Biyomalzeme 110/9  Lam çeşitleri Thoma lamı (Hücre Histolojik preperat için sayımı için: prokaryot ve lam çeşitleri: ökaryot hücreler 1- Adheziv lamlar:poly- Sperm hücresi, bakteri. L-lysin Lökosit, kondrosit vs 2- Pozitif şarjlı lam Etiketli lam:Rodajlı lam Thoma lamında Canlı ölü hücre tespiti için kullanılan boyanın adı trypan blue dur. Teşekkürler.