Guía Práctica Extracción y Cuantificación de ADN

SESIÓN 4. EXTRACCION Y CUANTIFICACION DE ADN DE MUESTRAS SANGUINEAS 1. INTRODUCCIÓN. El ácido desoxirribonucleico (ADN), es una molécula de gran tamaño que guarda y transmite de generación en generación toda la información necesaria para el desarrollo de todas las funciones biológicas de un organism...

SESIÓN 4. EXTRACCION Y CUANTIFICACION DE ADN DE MUESTRAS SANGUINEAS 1. INTRODUCCIÓN. El ácido desoxirribonucleico (ADN), es una molécula de gran tamaño que guarda y transmite de generación en generación toda la información necesaria para el desarrollo de todas las funciones biológicas de un organismo. El ADN se forma de la unión paralela de dos cadenas, cada una está conformada por cuatro diferentes nucleótidos. La posición y la cantidad de estos a lo largo de las cadenas se le conocen como código genético o genoma. Todas las células contienen ADN en sus núcleos y también lo podemos encontrar dentro de otros compartimentos celulares diferentes al núcleo, como las mitocondrias y los cloroplastos. Para los estudios genéticos en los seres humanos, el tejido generalmente seleccionado para extraer ADN es la sangre (leucocitos). Existen diversas técnicas para la obtención de ADN que se diferencian en básicamente dos alternativas metodológicas, las cuales difieren en la etapa de la purificación de las proteínas del extracto. Uno de los métodos es el de salting-out (precipitación salina), donde se aprovecha el cambio de solubilidad que experimentan las proteínas cuando son sometidas a modificaciones en la concentración salina del medio. Tambien es importante conocer la concentración y pureza del ADN extraído. Un método de cuantificación es por espectrofotometría a 260 nm siendo la máxima absorbancia de los anillos de las bases nitrogenadas. Una absorbancia de 1.0 corresponde a 50 ug/ml de ADN de doble cadena. La relación entre las medidas a 260 y 280 nm proporciona un estimado de la pureza de la muestra. Un buen ADN (calidad y pureza) es aquel cuyo A260/A280 es entre 1.7 y 2.0. 2. OBJETIVO. Realizar la extracción de ADN de la sangre mediante el método del salting-out, Cuantificar y determinar la pureza del ADN extraído mediante un método espectrofotométrico. 3. FUNDAMENTO DEL MÉTODO. En esta técnica el primer paso es lisar los eritrocitos con una solución que contiene buffer tris y EDTA. Luego se lisan los leucocitos con el detergente N-lauroyl sarcosine para liberar el ADN, se rompe la porción proteica de la membrana con la proteinasa K, se eliminan las proteínas del extracto mediante precipitación salina (salting-out) con acetato de potasio, luego se concentran las proteínas con una solución saturada de cloruro de sodio. Se separa el ADN de la mezcla mediante precipitación con etanol para finalmente lavarlo y resuspenderlo en solución amortiguadora, quedando listo para su cuantificación y determinación de pureza. 4. EQUIPOS, MATERIALES, REACTIVOS Y MUESTRA. 4.1. EQUIPOS. Espectrofotómetro Hitachi UH 5300 Estufa Cronometro Centrífuga 4.2. MATERIALES. Micropipetas 100-1000 ul Micropipetas 10-100 ul Puntas descartables azules Puntas descartables amarillas Cubetas de cuarzo Gradillas Plumón indeleble Recipiente de bioseguridad Tubos Falcón de 15 ml Tubos Eppendoff de 1.5 ml Beaker 4.3. REACTIVOS. Buffer 1. TE 20:5 (20 mM Tris 1M pH 7,4: 5 mM EDTA 0.5M) Buffer 2. TE 10: 1 (20 mM Tris 1M pH 7,4: 1 mM EDTA 0.5M) Acetato de amonio 10 M N-lauroyl sarcosine 10% Proteinasa K 1.0 mg/ml Etanol absoluto NaCl 5.0 M Lejía 1.0 % 4.4. MUESTRA. Se debe obtener 3.0 ml de sangre en un tubo con anticoagulante EDTA de la manera usual. 5. PROCEDIMIENTOS. Los alumnos realizaran el procedimiento a partir del item 5.9 5.1. Trasvasar 3.0 ml de sangre a un tubo Falcon y completar hasta 13 ml con el Buffer 1. Mezclar y agitar suavemente para homogenizar. 5.2. Centrifugar a 3000 rpm por 15 minutos. 5.3. Decantar vertiendo suave pero continuamente (en un solo movimiento) hasta la ultima gota de sobrenadante en un frasco con una solución de lejía 1.0%, tener cuidado de no mover el sedimento amarillento. 5.4. Agregar 1.0 ml de Buffer 1 y resuspender el sedimento, una vez homogéneo, completar a 13 ml de Buffer 1. 5.5. Repetir los pasos 5.2 a 5.4 una vez más, hasta que el sobrenadante sea transparente y claro. 5.6. Adicionar 500 ul de Buffer 1 y resuspender vigorosamente hasta lograr una suspensión homogénea. 5.7. Agregar 170 ul de la solución de N-lauroyl sarcosine 1% y mezclar por inversión suavemente, evitando la formación de espuma, hasta obtener una solución viscosa. 5.8. Adicionar 7.0 ul de proteinasa K, mezclar e incubar por 3 horas a 50°C. 5.9. Agregar 400 ul de acetato de amonio 10.0 M y mezclar bien, sin formar burbujas. 5.10. Adicionar 7.0 ml de etanol absoluto frio (-20° C), mezclar muy suavemente invirtiendo 5 a 10 veces hasta obtener una pelusa flotante (ADN precipitado). 5.11. Descartar en un beaker el etanol cuidando de conservar la pelusa en las paredes del tubo. 5.12. Agregar 500 ul de Buffer 1 y resuspender la pelusa de ADN, luego añadir 20 ul de NaCl 5.0 M y mezclar suavemente. 5.13. Adicionar 3.0 ml de etanol absoluto frio (-20° C) y mezclar por inversión hasta obtener nuevamente la pelusa. 5.14. Descartar el etanol en un beaker cuidando de conservar la pelusa en las paredes del tubo y pasarla a un tubo eppendorf de 1.5 ml. 5.15. Resuspender en 1.0 ml de Buffer 2. 5.17. Realizar la lectura de absorbancia en cubetas de cuarzo a las longitudes de onda de 260 nm (A260) y 280 nm (A 280), utilizando como blanco agua destilada. 6. RESULTADOS. 6.1. Calcular la relacion A 260 / A 280. 6.2. Calcular la concentracion de ADN mediante la siguiente formula: ADN (µg/ml) = 50 X A 260 7. RESULTADOS. Se considera un ADN de pureza óptima cuando la relación A 260 / A 280 tiene un valor entre 1.7 y 2.0. Valores por debajo de este rango son un indicativo de contaminación con proteínas u otra sustancia. 8. BIBLIOGRAFÍA. Instituto Nacional de Salud del Niño. Guía De procedimiento de extracción de ADN a partir de sangre periférica y medula ósea. 2021. https://www.google.com/search?sca_esv=8154e9ae6af1589a&sca_upv=1&hl=es& q=https://www.insnsb.gob.pe/docstrans/resoluciones/archivopdf.php?pdf%3D2020/RD%2520N%25C2%25B0%2520 000202-2020-DGINSNSB%2520+Gu%25C3%25ADa%2520Extracci%25C3%25B3n%2520de%252 0ADN%2520en%2520Sangre%2520Perif%25C3%25A9rica%2520y%2520M%25C 3%25A9dula%2520OseaV1f19F.pdf&spell=1&sa=X&ved=2ahUKEwiW2JqA8PGEAxVbIrkGHTNxDaIQBSgAeg QICRAC Universidad Veracruzana. Manual de Prácticas para Biología Molecular Aplicada https://www.uv.mx/qfb/files/2020/09/Guia-de-Biologia-Molecular-Aplicada.pdf