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UNIVERSIDAD PERUANA UNIÓN FACULTAD DE INGENIERÍA Y ARQUITECTURA E.P. INGENIERÍA AMBIENTAL Curso: Microbiología ambiental ANÁLISIS DE AGUAS: GRUPO COLIFORME POR NÚMERO MÁS PROBABLE Guía de Laboratorio N°7 1. OBJETIVO DE LA PRÁCTICA  Determin...

UNIVERSIDAD PERUANA UNIÓN FACULTAD DE INGENIERÍA Y ARQUITECTURA E.P. INGENIERÍA AMBIENTAL Curso: Microbiología ambiental ANÁLISIS DE AGUAS: GRUPO COLIFORME POR NÚMERO MÁS PROBABLE Guía de Laboratorio N°7 1. OBJETIVO DE LA PRÁCTICA  Determinar el número más probable de organismos presentes en una muestra de agua superficial/de pozo.  Familiarizarse con la técnica de número más probable. 2. MATERIALES Y MÉTODOS 2.1. Muestra  Agua superficial/de pozo 2.2. Materiales  Pipetas de 10 mL  Pipetas de 1 mL  9 Tubos de ensayo con campa Durham con Caldo Lauril Triptosa  9 Tubos de ensayo con campa Durham con Caldo Verde Brillante  9 Tubos de ensayo con campa Durham con Caldo Escherichia coli  Reactivo de Kovac  Incubadora 2.3. Método: Técnica de fermentación de tubo múltiple para miembros del grupo coliforme 2.3.1. Prueba presuntiva (de acuerdo a APHA 9221 B)  Inocular una serie de cinco tubos conteniendo Caldo Lauril Triptosa y una campana Durham, con 10 mL de la muestra. A otros cinco tubos adicionar 1 mL y a otros cinco, 0.1 mL. Deben ser quince tubos por muestra (Figura 1).  Incubar los tubos por 24 h a 35°C. Si no existe producción de gas, volver a incubar por 24 h. 2.3.2. Prueba confirmatoria (de acuerdo a APHA 9221 B)  De los tubos con Caldo Lauril Triptosa positivos (con producción de gas) transferir asépticamente una asada de los cultivos a tubos con 10 mL de caldo Verde Brillante Lactosa Bilis (BGLB) con campanas de Durham (Figura 1).  Incubar por 48 h a 35°C. 2.3.3. Prueba de coliformes fecales/termotolerantes (de acuerdo a APHA 9221 E)  De los tubos con Caldo Lauril Triptosa positivos (con producción de gas) transferir asépticamente una asada de los cultivos a tubos con 10 mL de caldo Escherichia coli (EC) con campanas de Durham (Figura 1).  Incubar por 24 h a 44.5°C. 2.3.4. Ausencia/Presencia de Escherichia coli  Para identificar E. coli, continuar con la identificación bioquímica con el reactivo Kovac, agregando unas gotas de este a los tubos positivos (con producción de gas)  Después de 5 a 10 minutos, los tubos que presenten una reacción positiva (Figura 1) confirmarán la presencia de E. coli en la muestra. Figura 1. Procedimiento para el análisis de grupo coliforme por la técnica del número más probable en muestras de agua superficial (NMP) 3. RESULTADOS Y DISCUSIONES  Anotar la combinación de tubos positivos (con producción de gas) y utilizar la Tabla 1 para estimar el número más probable para 5 tubos de fermentación por dilución. Si se continua con la prueba confirmatoria, estimar el número más probable y reportarlo como recuento confirmado de coliformes (NMP/100 ml)  En el caso de estimar coliformes termotolerantes/fecales usar la Tabla 1 para realizar el reporte. Indicar si existe presencia/ausencia de E.coli tras la reacción con el reactivo de Kovac. Tabla 1. Estimación del número más probable para tres tubos de fermentación por dilución (10 mL, 1 mL y 0.1 mL) Combinación Índice de Combinación Índice de de tubos NMP/100 mL de tubos NMP/100 mL positivos positivos 0-0-0 1600 Nota: Tabla simplificada sin los límites de confianza Fuente: APHA (1998) CUESTIONARIO 1. ¿Qué ventajas y desventajas tiene el NMP frente al método de cuento total estándar? 2. Detallar los medios de cultivo Caldo Lauril Triptosa y caldo Verde Brillante Lactosa Bilis BIBLIOGRAFÍA APHA (1998) Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater. 20th Edition, American Public Health Association, American Water Works Association and Water Environmental Federation, Washington DC.