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ESCUELA PROFESIONAL DE INGENIERIA AMBIENTAL MICROBIOLOGIA AMBIENTAL PRACTICA N°11 : BIODEGRADACION DE PETROLEO EN SUELOS PRACTICA 11 BIODEGRADACIÓN DE PETROLEO OBJETIVOS - Realizar la lectura de las muestras inoculadas. - Identificar los...

ESCUELA PROFESIONAL DE INGENIERIA AMBIENTAL MICROBIOLOGIA AMBIENTAL PRACTICA N°11 : BIODEGRADACION DE PETROLEO EN SUELOS PRACTICA 11 BIODEGRADACIÓN DE PETROLEO OBJETIVOS - Realizar la lectura de las muestras inoculadas. - Identificar los microorganismos aislados en los medios para su desarrollo. - Inocular éstos microorganismo en los medios que se encuentren mezclados con petróleo en porcentaje de 2%, 4% y 6%. Identificar que organismos serán los que se pueda utilizar para biorremediación INTRODUCCION El crudo de petróleo se caracteriza por ser un líquido negro, viscoso y con una composición química sumamente compleja, pudiendo contener miles de compuestos, básicamente de la familia de los hidrocarburos. Los hidrocarburos componen la familia predominante de compuestos (un 50-98% de la composición), por lo que constituyen uno de los grupos de contaminantes ambientales más importantes, tanto por su abundancia, como por su persistencia en distintos compartimentos ambientales. BIORREMEDIACIÓN La biorremediación es la adición de materiales a ambientes contaminados para producir una aceleración del proceso natural de biodegradación. La elevada complejidad de la composición del crudo de petróleo y derivados, implica la existencia de una amplia capacidad enzimática si se quiere conseguir una degradación significativa del crudo. La mayor parte de los estudios realizados se han llevado a cabo con cepas bacterianas individuales o con la combinación de diferentes cepas aisladas.  BACTERIAS DEGRADADORAS DE PETROLEO Acinetobacter Lactobacillus Actinomyces Leumthrix Alcaligenes Moraxella Arthrobacter Nocardia Bacillus Peptococcus Beneckea Pseudomonas Achrornobacter Sarcina Brevebacterium Spherotilus Coryneformes Spirillum Erwinia Streptomyces Flavobacterium Vibrio Klebsiella Xanthomyces  HONGOS DEGRADADORES DE PETROLEO Hongos degradadores de PD Oidiodendrum Allescheria Paecylomyses Aspergillus Phialophora Aureobasidium Penicillium Botrytis Rhodosporidium Candida Rhodotorula Cephalosporium Saccharomyces Cladosporium Saccharomycopisis Cunninghamella Scopulariopsis Debaromyces Sporobolomyces Fusarium Torulopsis Gonytrichum Trichoderma Hansenula Trichosporon MATERIALES Placas Petri de Agar BHI con diferentes concentraciones de petróleo. (2%, 4%, 6% de petróleo). Asa y porta-asa microbiológica Mechero Pruebas bioquímicas Coloración de Gram Microscopio Prueba bioquímicas: o TSI o Urea o MEVP o LIA o SIM o OF o Gelatina o Nitritos MATERIALES MEDIOS MEDIOS MEDIOS Pruebas de Identificación Agar BHI IMVIC PROCEDIMIENTO PRÁCTICO 1. PREPARACIÓN DE LA MUESTRA 2. INOCULACIÓN 3. IDENTIFICACIÓN Y CONSERVACIÓN CEPAS DE INTERÉS PARA BIODEGRADACIÓN - Brevibacterium - Micrococcus - Spirillum - Pseudomona aeruginosa - Xanthomonas - Serratia rubidae - Alcaligenes - Bacillus sp - Arthrobacter - Pseudomonas mendocina - Nocardia - Pseudomonas aureofasciens - Flavobacterium - Vibrio - Achromobacter - Acinetobacter LECTURA EN LA TABLA DE LOS RESULTADOS OBTENIDOS EN LAS PRUEBAS BIOQUIMICAS E IDENTIFICACION DE LA BACTERIA AISLADA  UNIVERSIDAD CATOLICA SANTA MARIA PROGRAMA DE INGENIERIA AMBIENTAL CURSO: MICROBIOLOGIA AMBIENTAL PRACTICA N°12 MICROBIOLOGIA DEL SUELO BIORREMEDIACION : II PARTE BIODEGRADACION DE PETROLEO EN TIERRA OBJETIVO: - Con las bacterias identificadas en la primera parte inocular en medios de cultivo con petroleo - Identificar las bacterias que sean capaces de biodegradar el petróleo. INTRODUCCION El petróleo ( "aceite de roca") es una mezcla homogénea de compuestos orgánicos, principalmente hidrocarburos insolubles en agua. También es conocido como petróleo crudo o simplemente crudo. Se produce en el interior de la Tierra, por transformación de la materia orgánica acumulada en sedimentos del pasado geológico y puede acumularse en trampas geológicas naturales, de donde se extrae mediante la perforación de pozos. En condiciones normales es un líquido bituminoso que puede presentar gran variación en diversos parámetros como color y viscosidad (desde amarillentos y poco viscosos como la gasolina hasta líquidos negros tan viscosos que apenas fluyen. Estas variaciones se deben a la diversidad de concentraciones de los hidrocarburos que componen la mezcla. Es un recurso natural no renovable y actualmente también es la principal fuente de energía en los países desarrollados. El petróleo líquido puede presentarse asociado a capas de gas natural, en yacimientos que han estado enterrados durante millones de años, cubiertos por los estratos superiores de la corteza terrestre. El petróleo está formado principalmente por hidrocarburos, que son compuestos de hidrógeno y carbono, en su mayoría parafinas, naftenos y aromáticos. Junto con cantidades variables de derivados saturados homólogos del metano (CH4). Su fórmula general El crudo de petróleo se caracteriza por ser un líquido negro, viscoso y con una composición química sumamente compleja, pudiendo contener miles de compuestos, básicamente de la familia de los hidrocarburos. Los hidrocarburos componen la familia predominante de compuestos (un 50-98% de la composición), por lo que constituyen uno de los grupos de contaminantes ambientales más importantes, tanto por su abundancia, como por su persistencia en distintos compartimentos ambientales. Además de hidrocarburos, el petróleo contiene otros compuestos que se encuentran dentro del grupo de orgánicos, entre los que destacan sulfuros orgánicos, compuestos de nitrógeno y de oxígeno. También hay trazas de compuestos metálicos, tales como sodio (Na), hierro (Fe), níquel (Ni), vanadio (V) o plomo (Pb). Asimismo, se pueden encontrar trazas de porfirinas. Biorremediación del Petróleo usando diversos microorganismos La biorremediación es la adición de materiales a ambientes contaminados para producir una aceleración del proceso natural de biodegradación. La elevada complejidad de la composición del crudo de petróleo y derivados, implica la existencia de una amplia capacidad enzimática si se quiere conseguir una degradación significativa del crudo. La mayor parte de los estudios realizados se han llevado a cabo con cepas bacterianas individuales o con la combinación de diferentes cepas aisladas. En la mayoría de los casos, son degradadoras de alcanos, debido a que los alcanos son los componentes más abundantes del crudo de petróleo. No obstante en algunos casos, estas cepas tienen la capacidad de oxidar selectivamente las cadenas alquílicas de ciertos HAPs alquilados, compuestos abundantes en el crudo. BACTERIAS BIODEGRADADORAS DE PETROLEO Acinetobacter Lactobacillus Actinomyces Leumthrix Alcaligenes Moraxella Arthrobacter Nocardia Bacillus Peptococcus Beneckea Pseudomonas Achrornobacter Sarcina Brevebacterium Spherotilus Coryneformes Spirillum Erwinia Streptomyces Flavobacterium Vibrio Klebsiella Xanthomyces HONGOS DEGRADADORES DE PETROLEO Hongos degradadores de PD Oidiodendrum Allescheria Paecylomyses Aspergillus Phialophora Aureobasidium Penicillium Botrytis Rhodosporidium Candida Rhodotorula Cephalosporium Saccharomyces Cladosporium Saccharomycopisis Cunninghamella Scopulariopsis Debaromyces Sporobolomyces  Fusarium Torulopsis Gonytrichum Trichoderma Hansenula Trichosporon Helmintrosporium Mucor MATERIALES Placas Petri de Agar BHI con diferentes concentraciones de petróleo. (2%, 4%, 6% de petróleo). Asa y porta-asa microbiológica Mechero Pruebas bioquímicas Coloración de Gram Microscopio Prueba bioquímicas: o TSI o Urea o MEVP o LIA o SIM o OF o Gelatina o Nitritos FORMA DIRECTA PARA OBSERVAR LA CAPACIDAD DEGRADATIVA DE LAS BACTERIAS AISLADAS. Luego del paso de la práctica anterior, se requiere conocer si las bacterias aisladas son degradativas de petróleo ó no. Para lo cuál se realiza la siguiente prueba - Sembrar las colonias aisladas en Agar Cerebro Corazón que contengan diferentes concentraciones de petróleo (al 0.5%, 1%, 1.5%). Proveniente del: - Cultivo de las placas y de las bacterias aisladas anteriormente que provenian del caldo Pelleroni, y - Otro grupo provenientes de Caldo Acetato Mineral. - De la solución salina - Incubar 24 a 48 horas OBSERVACION Y RESULTADOS: Observar e identificar las bacterias que hayan desarrollado en cada uno de las diluciones. Observar las características macroscópicas y las microscópicas , para lo que elaborará la Coloración de Gram. El desarrollo de la bacteria indica por el consumo del microorganismo.  CUESTIONARIO 1.. Explique como está compuesto el petróleo, cuales son sus derivados y que diferencias existen entre ellos. 2. 2. Los nutrientes inorgánicos estimulan la biodegradación del petróleo? Explique porque. 3. 4. Explique a que se denomina Biolixiviación. 4. 5. Indique cuál es la acción del caldo acetato mineral y cuál del Caldo Palleroni. 5. 6. Haga una relación de las bacterias y hongos que se encuentran en tierra contaminada con petróleo y otras que biodegraden el petróleo. 6. Haga una relación de microorganismos con los que se haya trabajado en petróleos en el Perú. 7. Explique sobre los características de cada uno de los microorganismos que se aislaron y cuales eran los mejores para la biorremediación. 8. Explique sobre otros métodos que se use para la degradación de petróleo e indique los beneficios y desventajas de cada uno de ellos. 9. Explique a que se refiere la acción emulsificante de las bacterias degradadoras de petróleo. 10. Explique a que se refiere la actividad degradativa de las cepas bacterianas de petróleo. MICROBIOLOGIA AMBIENTAL PRACTICA N°13 y 14 CONTROL DE CALIDAD DE AIRE OBJETIVO OBJETIVO: Que el alumno aprenda a conocer las formas para determinar la cantidad de microorganismos (bacterias y hongos) que pueden estar presentes en el ambiente (aire) de un lugar determinado y aplicar los métodos aprendidos para la identificación de los microorganismos aislados. INTRODUCCION El aire contiene en suspensión diferentes tipos de microorganismos, especialmente bacterias y hongos. La presencia de uno ú otro tipo depende del origen, de la dirección e intensidad de las corrientes de aire y de la supervivencia de microorganismos. Los virus son las formas de vida mas simples , que se transmiten principalmente a través del aire. La bacterias son organismos más complejos que los virus y a diferencia de ellos son capaces de vivir en un medio adecuado, sin la necesidad de un huésped para completar su desarrollo. Algunas bacterias presentan esporas que son resistentes a condiciones adversas, éstas pueden resistir años en diferentes temperaturas, sequedad, falta de nutrientes , recuperando su estado normal y capacidad infectiva al entrar en contacto con un medio adecuado para su desarrollo. INTRODUCCION Los hongos son formas complejas de vida que presentan una estructura vegetativa denominada Micelio formado por hifas. La que surge de de la germinación de sus células reproductoras ó esporas. Las enfermedades transmitidas por el aire, producidas por bacterias, virus y hongos, son las respiratorias (neumonía, tosferina, tuberculosis, legionelosis, resfriado, gripe), sistémicas (meningitis, sarampión, varicela, micosis) y alérgicas. AIRE Un bioaerosol es aquello que se encuentra en suspensión en el aire que está o estaba vivo, o es producto de algo vivo. NECESIDAD DEL ANALISIS MICROBIOLOGICO DEL AIRE. El aire es un vehículo que puede transportar esporas de hongos y también bacterias adheridas a partículas de polvo o contenidas en gotitas microscópicas de líquido (aerosoles). Son los denominados bioaerosoles. Estos microorganismos pueden alcanzar los alimentos que están siendo procesados yalterarlos, por lo que es necesario conocer cuál es el nivel de riesgo que se está corriendo para aplicar medidas correctoras si esto fuese necesario. ANALISIS MICROBIOLOGICO DEL AIRE. El análisis microbiológico del aire puede consistir en un recuento en placa de microorganismos aerobios mesófilos (número de ufc por metro cúbico de aire) que puede complementarse con una investigación de lapresencia de determinados microorganismos patógenos. Son dos las peculiaridades destacables del análisis microbiológico del aire sobre los análisis de otros tipos de muestras: ANALISIS MICROBIOLOGICO DDEL AIRE a. Las bacterias viables presentes en el aire suelen estar lesionadas debido a una deshidratación notable. b. Por lo tanto, no es conveniente recoger las muestras de aire sobre medios selectivos, sino sobre medios que permitan la revivificación de estos microorganismos C. Las técnicas de toma de muestra son totalmente distintas.  PERMANENCIA El tiempo que permanecen los microorganismos en el aire depende de la forma, tamaño y peso del microorganismo y de la existencia y potencia de las corrientes aéreas que los sostengan y los eleven. La sedimentación de los microorganismos por gravedad sólo es importante en el aire en calma. El impacto que sufren las partículas del aire cuando encuentran un obstáculo,es mayor cuando partículas grandes inciden a altas velocidades hacia objetos pequeños. AIRE El lavado del aire por la lluvia termina rápidamente con el proceso de dispersión,siendo diez veces más eficiente que la sedimentación y la impactación. Algunos microorganismos, incluidos bacterias, virus y hongos, son capaces de viajar grandes distancias sin perder viabilidad. RECUENTO DE BACTERIAS PARA CONTROL DE CALIDAD DE AMBIENTES. Cada muestra puede ser ajustada para aspirar volúmenes variables de aire para permitir un muestreo del medio ambiente con un amplio rango de microorganismos concentrados. MUESTREO 1. METODO DE ´PLACAS: Usar medios: a. Agar Nutritivo para el recuento y aislamiento de bacterias aerobios en general: b. Agar saboraud: para el recuento y aislamiento de hongos. PROCEDIMIENTO - Seleccionar algunos ambientes de la universidad para la toma de muestras. - Ubicar ambas placas abiertas y expuestas al medio, en un lugar determinado por 10 minutos. - Tapar y sellar ambas placas - Llevar al laboratorio y dejas en incubación: o Las placas de Agar nutritivo en incubación a 37°C por 48 hras o Las placs de Agar saboraud dejar incubando a medio ambiente por 48 horas - Para el Recuento pasadas las 48 horas: - contar cada una de las UFC (Unidades Formadoras de Colonias) que hayan desarrollado en cada una de las placas. - Dejar en refrigeración las muestras para su identificación en la siguiente práctica MEDIOS DE CULTIVO Agar Nutritivo Se utiliza este medio de cultivo para efectuar el contaje de bacterias. Una vez tomada la muestra, se trasladan las placas Petri al laboratorio, dejándolas en la estufa de cultivo a 37ºC durante 48 horas. Agar-Sabouraud Se utiliza este medio de cultivo para efectuar el contaje de hongos. Una vez tomada la muestra, se trasladan las placas Petri al laboratorio dejándolas en la estufa de cultivo a 25ºC durante 5 días. PRACTICA N°14 ANALISIS DE AIRE PRACTICA N°14 CONTINUACIÓN DE ANALISIS DE AIRE Recuento de colonias Pasado el tiempo de incubación, se observa el crecimiento de las colonias y se procede al recuento de las mismas mediante un contador de colonias que proporciona el número de colonias formadas por placa. De las placas conservadas en refrigeración se continuará con: Agar Nutritivo para Bacterias Agar saboraud Con Crecimiento Placas de agar nutritivo con Bacterias (48 hrs) Contador de colonias Tinción de Gram CUESTIONARIO 1. Indicar cual es el número aceptable de bacterias y hongos en ambientes cerrados como hospitales, aulas, y laboratorios. 2. Explique sobre otros métodos que se usa , para el control de calidad de Aire. 3. Haga una lista de bacterias y hongos presentes en diferentes tipos de ambiente: Aulas, laboratorios, mercados, hospitales, oficinas y otros y el número aceptable de cada uno de ellos, de acuerdo a las normas Técnicas (NTP).