Biotechnologie Moléculaire: Isolation de Locus

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Questions and Answers

Quelle est la première étape de l'isolement des locus microsatellites selon les travaux pratiques?

Capture des séquences ciblées avec des particules magnétiques

Hybridation avec des sondes microsatellites

Amplification par PCR des produits ligaturés

Digestion de l'ADN génomique avec l'enzyme RsaI (correct)

Quel matériau de protection est requis lors de la manipulation des réactifs chimiques et bactéries?

Un masque facial

Des lunettes de protection uniquement

Une blouse blanche et des gants (correct)

Gants en latex uniquement

Quelle est la première étape de la méthode de lyse alcaline pour extraire l'ADN plasmidique?

Ajouter la solution de lyse fortement alcaline

Préparer la solution neutralisante

Cultiver les colonies positives (correct)

Centrifuger le surnageant

Quels types de fragments génétiques sont amplifiés par PCR dans le processus?

Produits amplifiés après ligation Signup and view all the answers

Quel est le rôle de la solution fortement alcaline dans la méthode de lyse alcaline?

Former des pores dans la paroi cellulaire Signup and view all the answers

Qu'est-ce qui est utilisé comme amorces lors de l'amplification par PCR?

Les adaptateurs ligaturés Signup and view all the answers

Quel est l'objectif principal des Travaux Pratiques mentionnés?

Isoler des locus microsatellites et analyser les résultats Signup and view all the answers

Quelle est la composition de la solution GTE utilisée dans l'extraction d'ADN?

50mM glucose, 10mM EDTA, 25mM Tris-HCl Signup and view all the answers

Quelle méthode est utilisée pour le séquençage de l'ADN dans les Travaux Dirigés?

Méthode de Sanger Signup and view all the answers

Quel appareil est utilisé pour mélanger les solutions dans la méthode de lyse alcaline?

Vortex Signup and view all the answers

Quel est le but de l'ajout de la solution neutralisante dans la méthode de lyse?

Neutraliser la solution alcaline Signup and view all the answers

Quels motifs microsatellites sont ciblés dans l'hybridation?

(CA)8, (TG)12, (AG)12 Signup and view all the answers

Pourquoi l'ADN plasmidique est-il précipité à l'isopropanol?

Pour l'extraire en quantité suffisante Signup and view all the answers

Quel est le rôle des particules magnétiques dans le processus d'isolement?

Capturer les séquences ciblées Signup and view all the answers

Quel est le phénomène induit par la solution de lyse dans la méthode de lyse alcaline?

Dénaturation des acides nucléiques Signup and view all the answers

À quelle température les colonies positives doivent-elles être cultivées?

37°C Signup and view all the answers

Pourquoi l'ADN plasmidique se renature-t-il rapidement ?

Parce que les brins ne se sont pas séparés. Signup and view all the answers

Quel facteur empêche la renaturation de l'ADN génomique ?

La précipitation des fragments d'ADN simple brin. Signup and view all the answers

Quel rôle jouent les alcools comme l'isopropanol dans la précipitation de l'ADN ?

Ils mobilisent l'eau du milieu. Signup and view all the answers

Quelle est la particularité des di-désoxynucléotides (ddNTP) par rapport aux dNTP ?

Ils n'ont pas de groupe hydroxyle (OH) à l'extrémité 3'. Signup and view all the answers

Quelle méthode est utilisée pour séparer les fragments d'ADN lors du séquençage ?

Électrophorèse sur gel de polyacrylamide. Signup and view all the answers

Quelle est la fonction de la source laser dans le processus de séquençage automatique ?

Exciter les fluorochromes pour émettre de la lumière. Signup and view all the answers

Quel est le résultat final du séquençage sur ordinateur ?

Des courbes présentant des pics de fluorescence. Signup and view all the answers

Quel colorant est associé au nucléotide cytosine (C) dans le séquençage ?

Bleu pour C. Signup and view all the answers

Quel est le rôle du gène hMSH2?

Il joue un rôle dans la réparation de mésappariements de l’ADN. Signup and view all the answers

Quelles étapes sont essentielles dans le programme de thermocyclage pour le séquençage Sanger?

Dénaturation, hybridation, extension. Signup and view all the answers

Quel est le lien établi entre le syndrome de Li-Fraumeni et le gène TOTO?

Une forte liaison a été trouvée avec des marqueurs microsatellites proches du gène TOTO. Signup and view all the answers

Quelles méthodes peuvent être utilisées pour purifier une réaction de séquençage?

Précipitation à l'éthanol, filtration à membrane. Signup and view all the answers

Quelle technique a été utilisée pour séquencer les inserts des clones recombinants?

Séquencage selon Sanger. Signup and view all the answers

Quel est le but principal de la mini-prep effectuée après la construction de la banque enrichie ?

Isoler et purifier l'ADN des clones recombinants. Signup and view all the answers

Quelles solutions ont été utilisées durant la mini-prep et quel est leur rôle ?

S1 est un tampon de lyse, S2 un tampon d'échantillonnage, S3 un tampon d'élution. Signup and view all the answers

Quel type de séquençage a été utilisé pour analyser les inserts des clones recombinants ?

Séquençage de Sanger. Signup and view all the answers

Lors de la réaction de séquençage, quel est le programme de thermocyclage typiquement utilisé ?

95°C pour 30s, 55°C pour 30s, 72°C pour 1min. Signup and view all the answers

Quel est le motif isolé des microsatellites étudiés dans l'exercice ?

Tous les choix sont des motifs isolés. Signup and view all the answers

Quel type d'allèle a été amplifié dans l'exercice, et quelle était sa taille ?

Un allèle de 240pb. Signup and view all the answers

Quel est un des facteurs évalués dans l'étude de l'instabilité des microsatellites ?

L'âge des sujets. Signup and view all the answers

Quelles cellules ont montré une instabilité accrue par rapport à l'âge dans cette étude ?

Cellules souches de sujets âgés. Signup and view all the answers

Quels sont les premiers 30 nucléotides de la séquence d'insert du côté 5'?

CGGGAATTCGATTTGTGTGC Signup and view all the answers

Quel vecteur a été utilisé pour cloner les inserts?

pGEM®-T Easy Vector Signup and view all the answers

Quel est le produit d'amplification de taille ciblé par la paire d'amorces désignée?

300 pb Signup and view all the answers

Comment est désignée la migration sur le gel d'agarose?

De gauche à droite Signup and view all the answers

Dans quel échantillon trouve-t-on le tissu tumoral d'une femme atteinte par le syndrome?

Piste 3 Signup and view all the answers

Quel type de motifs les amorces doivent-elles encadrer?

Motifs microsatellites Signup and view all the answers

Quel échantillon correspond à un tissu sain d'un homme non atteint par le syndrome?

Piste 1 Signup and view all the answers

Quel est probablement le but de la réaction d'amplification PCR dans ce contexte?

Détecter des microsatellites Signup and view all the answers

Study Notes

Module Optionnel: Biotechnologie Moléculaire

Le module porte sur la biotechnologie moléculaire, un domaine des sciences biologiques.
Il comprend des travaux pratiques dirigés, visant à isoler des locus microsatellites à partir d'une banque génomique.
L'ADN du puceron Aphis spiraecola est utilisé pour ces travaux.
Les travaux pratiques incluent l'extraction d'ADN plasmidique (Miniprep), le séquençage automatique et l'analyse bioinformatique des séquences d'inserts.
Les travaux dirigés ciblent le séquençage d'ADN (méthode Sanger), la désignation d'amorces pour l'amplification des locus microsatellites, le génotypage par les marqueurs microsatellites et l'application de ces marqueurs.

Principe d'isolement de locus microsatellites

L'ADN génomique est d'abord digéré par l'enzyme Rsal.
Des adaptateurs sont ajoutés aux fragments.
Une PCR est effectuée en utilisant les adaptateurs comme amorces.
Les produits amplifiés sont hybridés à des sondes microsatellites biotinylées.
Les séquences ciblées sont capturées par des particules magnétiques recouvertes de streptavidine.
Une PCR supplémentaire est effectuée en utilisant les adaptateurs comme amorces.
Le produit est cloné dans le vecteur pGEM-T Easy.

TP1: Extraction d'ADN plasmidique (mini-prep)

La méthode de lyse alcaline est utilisée.
Des bactéries recombinantes sont sélectionnées et cultivées dans un milieu LB liquide contenant de l'ampicilline.
Les bactéries sont centrifugées pour récupérer le culot.
Le culot est resuspendu dans une solution GTE (Glucose, EDTA, Tris-HCl).
Une solution de lyse alcaline (NaOH 0,2N et SDS 1%) est ajoutée.
Une solution neutralisante (K-acétate 1M) est ajoutée.
La centrifugation est effectuée à 10 000 rpm pendant 10 minutes pour éliminer les débris.
L'ADN plasmidique est précipité à l'aide de l'isopropanol.
Le culot est lavé à l'éthanol 70% et séché.
L'ADN plasmidique est resuspendu dans un tampon TE.

TP2: Séquençage automatique d'ADN

Le séquençage est basé sur la méthode de Sanger.
Des dideoxynucléotides (ddNTPs) marqués par des fluorochromes sont utilisés.
Des réactions séparées sont effectuées pour chaque nucléotide.
Les produits de réaction sont séparés par électrophorèse sur gel pour former des courbes.
Un ordinateur analyse les courbes pour déterminer la séquence nucléotidique.

TP3: Analyse bioinformatique de séquences

L'analyse des séquences d'inserts de clones recombinants est effectuée à l'aide de logiciels comme Chromas.
On identifie les motifs microsatellites présents dans les séquences.
On utilise le logiciel Primer3 pour trouver des couples d'amorces pour l'amplification des loci.

TD1: Séquençage de l'ADN (méthode de Sanger)

Cette méthode permet de déterminer la séquence nucléotidique d'un fragment d'ADN.
Elle implique l'utilisation de dideoxyribonucléotides terminateurs de chaîne.

TD2: Désignation d'amorces pour l'amplification des locus microsatellites

Ce travail implique la sélection d'amorces pour amplifier les marqueurs microsatellites.

TD3: Génotypage par les marqueurs microsatellites

Les marqueurs microsatellites sont utilisés pour déterminer le génotype d'un individu.
Des informations issues d'électrophorèse sont analysées.

TD4: Application des marqueurs microsatellites

Les marqueurs microsatellites sont appliqués pour des études de diversité génétique.

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Description

Ce quiz explore les méthodes d'isolement de locus microsatellites en biotechnologie moléculaire. Il couvre des techniques pratiques comme l'extraction d'ADN et le séquençage automatique, en utilisant l'ADN du puceron Aphis spiraecola. Les participants testeront leurs connaissances sur le processus de PCR et l'analyse bioinformatique des séquences.