Gentechnik - University Salzburg PDF

P A R I S - L O D R O N UNIVERSITY SALZBURG Gentechnik P A R I S - L O D R O N UNIVERSITY SALZBURG Gentechnik Definition: Anwendung moderner molekularbiologischer Methoden...

P A R I S - L O D R O N UNIVERSITY SALZBURG Gentechnik P A R I S - L O D R O N UNIVERSITY SALZBURG Gentechnik Definition: Anwendung moderner molekularbiologischer Methoden zur Änderung der genetischen Eigenschaften von Organismen "rekombinante DNA-Technologie“: weil damit Erbinformation gezielt re- bzw. neukombiniert werden kann P A R I S - L O D R O N UNIVERSITY SALZBURG Gentechnik beinhaltet die Herstellung von Proteinen für medizinische und technische Anwendungen Herstellung von transgenen Pflanzen und Tieren Gendiagnostik somatische Gentherapie CRISPR/Cas9? Seit 2018 ebenfalls Gentechnik! P A R I S - L O D R O N CRISPR/Cas9 UNIVERSITY SALZBURG (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) Emmanuelle Charpentier Jennifer Doudna Feng Zhang P A R I S - L O D R O N UNIVERSITY SALZBURG CRISPR/Cas: Erworbene Immunität von Bakterien P A R I S - L O D R O N UNIVERSITY SALZBURG CRISPR/Cas9: Gezieltes Genome Editing in eukaryotischen Zellen https://www.transgen.de/ Unterliegt seit 2018 auch dem Gentechnikgesetz: warum erst seit 2018? Eingriffe in die Keimbahn nicht erlaubt P A R I S - L O D R O N UNIVERSITY SALZBURG Keine Gentechnik ist: klassische Züchtungsverfahren extrakorporale Befruchtung Übertragen von Embryonen auf Leihmütter zellbiologische Verfahren wie Herstellung von tierischen Hybriden (z.B. Schiege) Herstellung von Pflanzenhybriden (z.B. Tomatoffel) Embryoteilung und Embryotransfer bei Nutztieren P A R I S - L O D R O N UNIVERSITY SALZBURG Die Werkzeuge der Gentechnologie Spender DNA (z.B. ein Gen oder auch eine bestimmte Nukleotidsequenz) Vektor- oder Plasmid-DNA: Fungieren als Genfähren Restriktionsenzyme: fungieren als „genetische Scheren“ Ligasen: fungieren als genetische Kleber DNA-Transfermethoden Wirtsorganismen P A R I S - L O D R O N UNIVERSITY SALZBURG Klonieren DNA Plasmid rekombiniertes Klon Fragment Plasmid Ligation Einschleusen in Selektion Wirtszelle P A R I S - L O D R O N UNIVERSITY SALZBURG Mikroorganismen in der Gentechnik Ideale Voraussetzungen für die Erforschung wissenschaftlicher Fragen in der Molekularbiologie: Sind klein Vermehren sich schnell Genom lässt sich manipulieren Leicht zu kultivieren P A R I S - L O D R O N UNIVERSITY SALZBURG Häufig verwendete Klonierungswirte P A R I S - L O D R O N UNIVERSITY SALZBURG Spender-DNA P A R I S - L O D R O N UNIVERSITY SALZBURG Restriktionsenzyme Typ I schneidet die DNA an einer zufälligen Stelle weit von der Erkennungssequenz entfernt. Benötigt ATP. Typ II schneidet die DNA innerhalb oder in unmittelbarer Nähe der Erkennungssequenz. Benötigt kein ATP. Typ III schneidet die DNA etwa 20 bis 25 Basenpaare von der Erkennungssequenz entfernt. Benötigt ATP. P A R I S - L O D R O N UNIVERSITY SALZBURG Restriktionsenzyme Typ II: erkennen eine bestimmte Sequenz auf einem DNA-Strang, den sie genau dort durchtrennen. Es gibt sehr viele Restriktionsenzyme, von denen jedes seine spezifische Erkennungsstelle auf der DNA hat. Die Erkennungssequenzen der Restriktionsendonukleasen vom Typ II bestehen meist aus palindromischen Sequenzen von vier, sechs oder acht Basenpaaren 5'-GAATTC-3' 3'-CTTAAG-5' In der gentechnischen Praxis : Scheren P A R I S - L O D R O N UNIVERSITY SALZBURG Nomenklatur der Restriktionsenzyme Eco R I Gattungsname Artname Stamm/Serotyp Reihenfolge d. Entdeckung Escherichia coli Stamm R 1. Enzym P A R I S - L O D R O N UNIVERSITY SALZBURG Große Anzahl an Restriktionsenzyme Restriktions- Herkunfts- Erkennungssequenz endonuklease organismus (‡= Schnittstelle) Eco RI E. coli RY13 G‡AATTC Bam HI Bacillus G‡GATCC amylo-liquefacies Hind III Haemophilus A‡AGCTT influenzae Rd P A R I S - L O D R O N UNIVERSITY SALZBURG Herkunft der Restriktionsenzyme z.B. Schutz der Bakterien gegen Bakteriophagen: spezifische Spaltung der viralen DNA mit Restriktionsendonukleasen P A R I S - L O D R O N UNIVERSITY SALZBURG Bakterien schützen ihre eigene DNA durch Methylierung Die DNA des Wirtes ist genau an den Stellen, die die Enzyme spalten, mit einer Methylgruppe (- CH3) versehen und so geschützt Dies erfolgt wiederum durch Enzyme (DNA- Methyltransferasen), die die gleiche Abfolge von Basenpaaren erkennen, wie die Enzyme, die DNA spalten P A R I S - L O D R O N UNIVERSITY SALZBURG Restriktionsenzyme sind Dimere mit DNA angepasster Struktur Restriktionsenzym- dimer DNA P A R I S - L O D R O N UNIVERSITY SALZBURG GAATTC Erkennungssequenz: Restriktion P A R I S - L O D R O N UNIVERSITY SALZBURG Restriktion  P A R I S - L O D R O N UNIVERSITY SALZBURG Restriktion Glatte Enden Enden Klebrige P A R I S - L O D R O N UNIVERSITY SALZBURG Isoschizomere Isoschizomere: Unterschiedliche Restriktions- endonukleasen mit identischen Erkennungssequenzen. Beispiel: HindIII: HsuI: 5´- A/AGCTT 5´-A/AGCTT Enzyme, die die identische Sequenz erkennen, aber einmal 3'- und einmal 5'-überstehende Enden produzieren, dürfen nicht mit Isoschizomeren verwechselt werden! Sie liefern auch keine kompatiblen Enden. Beispiel: KpnI: Asp718: GGTAC/C G/GTACC P A R I S - L O D R O N UNIVERSITY SALZBURG Klonieren Eine linearisierte DNA Sequenz kann in Bakterien nicht vermehrt werden: Einfügen in einen Vektor → Restriktionsprodukt und Vektor müssen kompatible Enden haben! EcoR1 EcoR1 BamH1 BamH1 DNA Plasmid rekombiniertes Fragment Plasmid Ligation P A R I S - L O D R O N UNIVERSITY SALZBURG Spender-DNA Wie kann man einen definierten Bereich aus dem Chromosom unabhängig von möglichen Restriktionsschnittstellen erhalten? P A R I S - L O D R O N UNIVERSITY SALZBURG PCR: Polymerase Kettenreaktion PCR: in vitro Methode zur Vervielfältigung spezifischer DNA Sequenzen Spender-DNA Primer DNA Polymerase Zielsequenz P A R I S - L O D R O N UNIVERSITY SALZBURG PCR: Polymerase Kettenreaktion Typischer Reaktionsansatz: DNA Template 5´ Primer 3´ Primer Desoxynukleotide (dNTPs): dATP, dCTP, dTTP, dGTP Pufferlösung H2O DNA Polymerase P A R I S - L O D R O N UNIVERSITY SALZBURG PCR: Polymerase Kettenreaktion 5´- Primer: definiert den zu vervielfältigen Bereich am 5´-Ende 3´- Primer: definiert den zu vervielfältigen Bereich am 3´-Ende 3´ Primer 5´ 3´ 3´ 5´ 5´ Primer PCR Reaktion mit einer DNA Polymerase durchgeführt, die hohe Temperaturen toleriert P A R I S - L O D R O N UNIVERSITY SALZBURG PCR: Polymerase Kettenreaktion Schritte der PCR: P A R I S - L O D R O N UNIVERSITY SALZBURG PCR Zyklus 1 Denaturierung: 95°C „Annealing“ der Primer: 54-63°C Elongierung: 72°C P A R I S - L O D R O N UNIVERSITY SALZBURG PCR Zyklus 2 Denaturierung Primer Annealing Elongierung P A R I S - L O D R O N UNIVERSITY SALZBURG PCR Zyklus 3 P A R I S - L O D R O N UNIVERSITY SALZBURG PCR Zyklus 4 P A R I S - L O D R O N UNIVERSITY SALZBURG PCR Zyklus 5 P A R I S - L O D R O N UNIVERSITY SALZBURG PCR P A R I S - L O D R O N UNIVERSITY SALZBURG Nachweis der PCR Reaktion 5´ 3´ 3´ 5´ PCR Fragmente habe eine kalkulierbare Größe  P A R I S - L O D R O N UNIVERSITY SALZBURG Anode Kathode Elektrophorese P A R I S - L O D R O N UNIVERSITY SALZBURG Elektrophorese P A R I S - L O D R O N UNIVERSITY SALZBURG Elektrophorese P A R I S - L O D R O N UNIVERSITY SALZBURG Primer Primer sind Oligonukleotide, die als Startpunkt der DNA-Polymerase dienen 5` gcctattagccaggtgtggtggtgcacatggactcatggatggaggaagttta 3` 3´ cggataatcggtccacaccaccacgtgtacctgagtacctacctccttcaaat 5´ 5` gcctattagccaggtgtggtggtgcacatggactcatggatggaggaagttta 3` acctacctccttc 5´ 5´ attagccaggtgtggtggtgc 3´ cggataatcggtccacaccaccacgtgtacctgagtacctacctccttcaaat 5´ forward 5´– primer : 5`-attagccaggtgtggtggtgc-3` reverse 3´– primer : 5`-cttcctccatcca-3` P A R I S - L O D R O N UNIVERSITY SALZBURG Primer Ein paar Kriterien für die Primerwahl: 18-30 Nukleotide lang Gleichmäßige Verteilung der Nukleotide (1:1:1:1) Base G oder C am 3´-Ende Keine Hairpin-loops (komplementäre Rückfaltungen) Primer-Dimer Bildung sollte ausgeschlossen sein Schmelztemperatur zwischen 65°C-70°C, Annealing-Temperatur sollte 10-15°C niedriger liegen G-C-Basenpaarungen durch drei Wasserstoffbrücken stabilisiert, T-A- Basenpaarungen nur über zwei G-C-Basenpaarungen sind also „stabiler“, die Schmelztemperatur nimmt also mit der Anzahl an G- und C- Nukleotiden zu (Der GC-Gehalt sollte über 40% liegen) P A R I S - L O D R O N UNIVERSITY SALZBURG Klonieren kompatible Enden? EcoR1 EcoR1 BamH1 BamH1 DNA Plasmid rekombiniertes Fragment Plasmid Ligation P A R I S - L O D R O N UNIVERSITY SALZBURG Einfügen von zusätzlichen Restriktionsschnittstellen 5` gcctattagccaggtgactcatggatggaggaagttta 3` Ausgang 3´ cggataatcggtccactgagtacctacctccttcaaat 5´ 3. Zyklus: 5` GAATTCattagccaggtgactcatggatggaggaag 3` 1. PCR Amplikat 3´ CTTAAGtaatcggtccactgagtacctacctccttc 5´ Ziel mit Schnitt- stelle! 5` gcctattagccaggtgtggtggtgcacatggactcacggatggaggaagttta 3` gcctacctccttc 5´ 5´ G A A TT C attagccaggtgtggtggtgc 3´ cggataatcggtccacaccaccacgtgtacctgagtacctacctccttcaaat 5´ forward – primer : 5`-GAATTCattagccaggtgtggtggtgc-3` reverse – primer : 5`-cttcctccatccg-3` P A R I S - L O D R O N UNIVERSITY SALZBURG Spender-DNA P A R I S - L O D R O N UNIVERSITY SALZBURG Klonieren eines Gens Wenn man über PCR keine zusätzliche Schnittstelle für Restriktionsenzyme einfügen möchte: Restriktionsfragment PCR-Fragment Häufig: „TA“ –Zwischenklonierung Taq Polymerase fügt ein A an das 3´Ende 5` tgactcatggatggaggaaga 3` 3´aactgagtacctacctccttc 5´ P A R I S - L O D R O N UNIVERSITY SALZBURG H2O Ligation P A R I S - L O D R O N UNIVERSITY SALZBURG Plasmide Plasmide sind im Verhältnis zum Chromosom sehr kleine ringförmige DNA-Moleküle Plasmide replizieren sich unabhängig von der Haupt-DNA durch eine bestimmte Nukleotidsequenz In der Gentechnologie tragen die Plasmide häufig Resistenzgene P A R I S - L O D R O N UNIVERSITY SALZBURG Plasmide Es gibt: Fruchtbarkeits-(F)Plasmide, die nur transfer (tra)-Gene enthalten. Ihre einzige Funktion ist die Einleitung der Konjugation Resistenz-(R-)Plasmide, die Resistenzgene gegen Antibiotika oder Gifte enthalten Klonierungsplasmide, die hauptsächlich zur Ligation von neuen Sequenzen und deren Vermehrung dienen Expressionsplasmide, die für die Expression der neuen Sequenzen optimiert sind  Characteristics of a Cloning Vector P A R I S - L O D R O N UNIVERSITY SALZBURG Plasmid zum Klonieren Origin of replication (ORI) – Replikationsursprung: markiert den Ort für den Start der Replikation: spezifische Sequenz von Nukleotiden Seletionsmarker: ermöglicht die Selektion von Zellen, in der die rekombinierte DNA vorkommt: Transformanten Polylinker oder “Multiple Cloning Site” (MCS): Stelle, die viele Restriktionsenzym-Erkennungssequenzen enthält P A R I S - L O D R O N UNIVERSITY SALZBURG Bildung eines rekombinanten Vektors P A R I S - L O D R O N UNIVERSITY SALZBURG Genetischer Austausch bei Prokaryoten Transformation: Aufnahme von freier DNA Konjugation: Genübertragung von einer Bakterienzelle zu einer anderen durch einen Mechanismus, an dem Zell- Zellkontakte und Plasmide mitwirken Transduktion: Übertragung von Genen durch einen Virus von einer Zelle zu einer anderen P A R I S - L O D R O N UNIVERSITY SALZBURG Transformation Griffiths Experimente mit Pneumococcus (Erreger einer tödlichen Lungenentzündung): Lebende glatte S-Zellen enthalten eine Kapsel und töten Mäuse, weil Immunzellen Bakterien mit Kapseln nicht töten können Rauhe R-Zellen besitzen keine Kapsel und sind nicht pathogen Eine Kombination lebender R- und toter S-Zellen tötet Mäuse: Die lebenden S-Typ Zellen können aus den Tieren isoliert werden. Aus den toten S-Zellen wird die DNA, die die Kapselbildung kodiert freigesetzt und von den R-Zellen aufgenommen, wodurch sie zu S-Typzellen transformiert werden. P A R I S - L O D R O N UNIVERSITY SALZBURG Transformation DNA liegt als ein großes Einzelstück vor Wenn die Zelle lysiert wird, läuft die DNA aus und kann dabei brechen Die DNA kann leicht von anderen, kompetenten Bakterien aufgenommen werden P A R I S - L O D R O N UNIVERSITY SALZBURG Kompetenz Eine Zelle, die DNA aufnehmen kann, wird als kompetent bezeichnet Zellen, die nicht kompetent sind, können z.T. chemisch kompetent gemacht werden Transformation chemisch kompetenter Bakterien: 1. Kompetente E. coli auf Eis auftauen 2. Zugabe der DNA 3. Inkubation auf Eis für 30 min 4. Hitzeschock (37°C-42°C) für ca. 60 sec 5. Zugabe von Medium 6. Kultivierung für 30 min bei 37°C 7. Ausplattieren auf Selektionsplatten P A R I S - L O D R O N UNIVERSITY SALZBURG Transformation 42°C 0°C + + LB-Medium 37°C 37°C ü/N Amp/IPTG/X-Gal P A R I S - L O D R O N UNIVERSITY SALZBURG Transformation Voraussetzung, um genetischen Austausch nachzuweisen: Merkmalsunterschiede: z.B. Ampicillin Resistenz Alle Kolonien Bakterien mit Resistenzplasmid LB Platten LB Amp Platten P A R I S - L O D R O N UNIVERSITY SALZBURG Transformation Aber: Wie kann man denn nachweisen, dass das aufgenommene Plasmid tatsächlich das Insert trägt? P A R I S - L O D R O N UNIVERSITY SALZBURG Blau-Weiß Selektion: Das Operon-Model Operon Promotor Operator LacZ Funktionseinheit auf DNA von Prokaryoten Modell zur Regulation der Genexpression Kodiert für Proteine, die für den Abbau von Laktose gebraucht werden (sofern Laktose vorhanden ist) P A R I S - L O D R O N UNIVERSITY SALZBURG Das Lac-Operon Repressor β-Galactosidase Permease β-Galactosid- Transacetylase Promotor Operator LacZ Poly- Repressor merase keine LacZ (β-Galactosidase) Expression – spaltet Lactose Promotor Operator LacZ Poly- Repressor merase IPTG (Induktor) oder Allolactose (Isomer der Lactose) Promotor Operator LacZ Poly- merase Promotor Operator LacZ Poly- merase LacZ Expression P A R I S - L O D R O N UNIVERSITY SALZBURG Blau-Weiss Selektion Promotor Operator LacZ Poly- merase LacZ Expression LacZ 5-Brom-4-Chlor-3-Indoxyl- ß-D-Galactopyranosid Galactose (X-Gal) + 5-Brom-4-Chlor-3-Indoxyl O2 5,5`-Dibrom-4,4`-Dichlor-Indigo P A R I S - L O D R O N UNIVERSITY SALZBURG Blau-Weiss Selektion: Das Operon-Model Promotor Operator LacZ MCS LacZ Poly- merase LacZ Expression Blaue Kolonien Promotor Operator LacZ Insert LacZ Poly- merase keine LacZ Expression Weiße Kolonien P A R I S - L O D R O N UNIVERSITY SALZBURG Blau-Weiss Selektion: Das Operon-Model P A R I S - L O D R O N Transduktion UNIVERSITY SALZBURG Allgemeine Transduktion: Übertragung von Bakterien-DNA durch einen virulenten Bakteriophagen. Bei der Phagenvermehrung in der Bakterienzelle kann es zufällig passieren, dass in einen Phagen ein Stück der Bakterien-DNA eingebaut wird. P A R I S - L O D R O N UNIVERSITY SALZBURG Konjugation Ausbildung von Plasmabrücken zwischen zwei Zellen und die darauf folgende Übertragung von DNA als Träger von Erbinformation. Über sogenannte Fertilitäts (F)-Pili (oder Sexpili) verbinden sich zwei Bakterienzellen miteinander und können so DNA-Stränge von der Spenderzelle zur Empfängerzelle übertragen. P A R I S - L O D R O N UNIVERSITY SALZBURG Konjugation Der Transfer erfolgt gerichtet vom fertilen („fruchtbaren“) Bakterium (mit F+, F' oder Hfr) zum nichtfertilen (F−). Entscheidend dafür ist ein Fertilitätsfaktor. Fertile Bakterien haben entweder ein Fertilitätsplasmid (F+), besitzen ein Fertilitätsplasmid mit zusätzlichen Genen (F') oder haben den Fertilitätsfaktor in ihrem Genom integriert. Diese werden dann als Hfr- Stamm bezeichnet (für engl. high frequency of recombination), da sie sehr häufig mit anderen Bakterien konjugieren. P A R I S - L O D R O N UNIVERSITY SALZBURG F-Plasmid tra-Region enthält die Gene, die am transponierbare Elemente konjugativen Transfer mitwirken für die Integration in das bakterielle Chromosom: Bildung von Hfr-Stämmen Größe des Plasmids Ursprungsstelle des Transfers während Gene für die Replikation des F- der Konjugation Plasmids in normal wachsenden Zellen P A R I S - L O D R O N UNIVERSITY SALZBURG Zusammenfassung