Cours de Microbiologie Mars 2021 PDF

PHYSIOLOGIE ET ECOLOGIE MICROBIENNES Cours Théorique Prof. A. EL HAJJAB 1  PEM Plan général I- Les enzymes microbiennes II- Nutrition des micro-organismes III- Paramètres physico-chimiques de la croissance microbienne IV...

PHYSIOLOGIE ET ECOLOGIE MICROBIENNES Cours Théorique Prof. A. EL HAJJAB 1  PEM Plan général I- Les enzymes microbiennes II- Nutrition des micro-organismes III- Paramètres physico-chimiques de la croissance microbienne IV- Cinétique de la croissance microbienne V- Le métabolisme microbien VI- Les agents antimicrobiens VII- Immunologie, Sérologie 2  PEM Plan général I- Les enzymes microbiennes II- Nutrition des micro-organismes III- Paramètres physico-chimiques de la croissance microbienne IV- Cinétique de la croissance microbienne V- Le métabolisme microbien VI- Les agents antimicrobiens VII- Immunologie, Sérologie 3  Chapitre I: LES ENZYMES MICROBIENNES I.1- Généralités I.2- Enzymes constitutives & enzymes inductibles I.3- Enzymes exo-cellulaires & enzymes endo- cellulaires I.4- Applications 4 I- Les enzymes microbiennes I.1- Généralités I.1.1- Définitions I.1.2- Principales propriétés I.1.2.1- Constitution I.1.2.2- Spécificité d’action I.1.2.3- Paramètres de l’activité enzymatique 5 I- Les enzymes microbiennes I.1- Généralités I.1.1- Définitions Une enzyme est une protéine qui sert à accélérer la vitesse d’une réaction biochimique au sein d’un organisme vivant sans en modifier le résultat. Cette accélération, qui atteint des proportions considérables (plusieurs millions de fois), s’appelle la catalyse. La réaction enzymatique est donc une réaction catalytique. 6 I- Les enzymes microbiennes I.1- Généralités I.1.1- Définitions Les enzymes n’ont pas un seul rôle d’accélérateur ou de catalyseur de réaction, mais sont également de ciseaux biologiques qui découpent ou décomposent les substrats Exple: saccharase ou invertase qui décompose le saccharose en glucose et fructose 7 I- Les enzymes microbiennes I.1- Généralités I.1.1- Définitions Sur un plan terminologique: la fonction d’une enzyme est caractérisée par le suffixe employé, qui se termine toujours par « ase ». La racine du nom de l’enzyme désigne le substrat sur lequel elle agit. 8 I- Les enzymes microbiennes I.1- Généralités I.1.1- Définitions Une enzyme donnée est spécifique d’une réaction, elle catalyse toujours la même transformation, se produisant sur le même corps chimique, on trouve Six Catégories: Les oxydoréductases catalysent les réactions d’oxydoréduction. Exemple : la peroxydase. Les transférases qui permettent le transfert d’un groupement fonctionnel d’une molécule à une autre. Exemple : les amino-transférases (transaminases). Les hydrolases qui hydrolysent (coupent) des liaisons chimiques. Exemple : les nucléases hydrolysent l’ADN 9 ou l’ARN. I- Les enzymes microbiennes I.1- Généralités I.1.1- Définitions Les lyases coupent des liaisons qu’elles remplacent immédiatement par d’autres. Exemple : l’adénylate cyclase transforme l’ATP en AMP cyclique. Les isomérases réorganisent les groupements fonctionnels d’une molécule pour en fabriquer des isomères. Exemple : la glucose-6-phosphate isomérase permet l’isomérisation du D-glucose en D-fructose. Les ligases ou synthétases servent à réunir deux molécules pour en former une nouvelle. Exemple : l’ADN ligase qui couple deux molécules d’ADN. 1 0 I- Les enzymes microbiennes I.1- Généralités I.1.1- Définitions - Enzyme (diastase) : substance macro- moléculaire de nature protéique (au moins en partie) jouant le rôle de bio-catalyseur - Substrat(s) : substance(s) sur laquelle (lesquelles) s’exerce l’action de l’enzyme - Produit(s) de la réaction enzymatique : substance(s) résultant de la réaction enzymatique 1 1 I- Les enzymes microbiennes I.1- Généralités I.1.1- Définitions 1 2 I- Les enzymes microbiennes I.1- Généralités I.1.2- Principales propriétés I.1.2.1- Constitution Les enzymes sont des bio molécules (molécules synthétisées par les êtres vivants) indispensables à toutes les réactions biochimiques. Elles ne sont souvent actives qu’après liaison de l’apoenzyme avec le coenzyme. 1 3 I- Les enzymes microbiennes I.1- Généralités I.1.2- Principales propriétés I.1.2.1- Constitution - Apoenzyme: Est une enzyme sans son coenzyme, c'est-à-dire la protéine à laquelle la coenzyme se liera pour produire une holoenzyme active. Il s’agit d’une substance protéique à PM élevé, inactive seule 1 4 I- Les enzymes microbiennes I.1- Généralités I.1.2- Principales propriétés I.1.2.1- Constitution - Coenzyme: substance organique dialysable (PM faible), inactive seule. - Schématiquement : coenzyme + apoenzyme = holoenzyme = une enzyme catalytiquement active 1 5 I- Les enzymes microbiennes I.1- Généralités I.1.2- Principales propriétés I.1.2.1- Constitution - L’apoenzyme pour devenir active a besoin d’être associées à un cofacteur pour devenir des holoenzymes, c’est-à-dire des enzymes actives - Certaines travailleent seules (100% autonome) mais d’autres ont besoin d’aide pour devenir actives - Co-facteur enzymatique: ion métallique ne faisant pas partie de l’enzyme, mais nécessaire à son activité Exemple : ion Mn+ cofacteur enzymatique de la nitrate réductase 1 6 I- Les enzymes microbiennes I.1- Généralités I.1.2- Principales propriétés I.1.2.1- Constitution 1 7 I- Les enzymes microbiennes I.1- Généralités I.1.2- Principales propriétés I.1.2.1- Constitution Co-facteur enzymatique: interviennent dans une réaction enzymatique - Pour transporter ou compléter un substrat - Pour accepter un produit - Comme participant à la structure de l’enzyme 1 8 I- Les enzymes microbiennes I.1- Généralités I.1.2- Principales propriétés I.1.2.2- Spécificité de l’action - Spécificité de substrat: portée par l’apoenzyme (site spécifique: structure complémentaire de celle du substrat): Enzyme c’est la clé, le substrat c’est la serrure la protéine se lie à son substrat grace à leur site de liaison - Spécificité de réaction: due au coenzyme 1 9 enzyme et substrat 10 Exemple d’action enzymatique : hydrolyse du saccharose 11 I- Les enzymes microbiennes I.1- Généralités I.1.2- Principales propriétés Conséquence de la spécificité: notion de système enzymatique 22 I- Les enzymes microbiennes I.1- Généralités I.1.2- Principales propriétés I.1.2.3- Paramètres de l’activité enzymatique - Activité très rapide: 104 à 106 molécules de substrat/molécule d’enzyme/minute (dans les conditions optimales) - Concentration nécessaire très faible - Enzyme toujours intacte en fin de réaction 23 I- Les enzymes microbiennes I.1- Généralités I.1.2- Principales propriétés I.1.2.3- Paramètres de l’activité enzymatique Effets des principaux paramètres - Température : minimale, optimale et maximale - pH: minimal, optimal, maximal - Concentration en enzyme - Concentration en substrat 24  Vitesse de l’activité enzymatique V en fonction de la température T et du pH V V T min. T opt. T max T pH min pH opt pH max pH 25  Vitesse de l’activité enzymatique V en fonction de la concentration en enzyme E et de la concentration en substrat S (Ps: point de saturation) V V Ps E Ps S 26 I- Les enzymes microbiennes I.1- Généralités I.1.2- Principales propriétés I.1.2.3- Paramètres de l’activité enzymatique Inactivation des enzymes - Inactivation réversible ou temporaire: froid, pH , blocage des cofacteurs enzymatiques. - Inactivation irréversible ou définitive (dénaturation): chaleur, alcool, pH extrêmes, certains sels (hypochlorites : eau de Javel) 27 I- Les enzymes microbiennes I.2- Enzymes constitutives et enzymes inductibles - Enzyme constitutive: entre dans la constitution de la cellule; existe même en absence de son substrat Exemple: invertase chez Saccharomyces cerevisiae 28 I- Les enzymes microbiennes - Enzyme inductible (adaptative): n’est synthétisée qu’en présence de son substrat (substrat = inducteur) Exemple: β-galactosidase chez Escherichia coli 29 I- Les enzymes microbiennes I.3- Enzymes exo-cellulaires et enzymes endo-cellulaires - Enzyme exo-cellulaire (exo-enzyme): excrétée, agit à l’extérieur du corps microbien 30  I- Les enzymes microbiennes - Enzyme endo-cellulaire (endo-enzyme): agit à l’intérieur du corps microbien; le substrat pénètre à l’intérieur du micro-organisme Parfois nécessité d’une perméase; exemple: galactoside-perméase pour lactose chez Escherichia coli 31 I- Les enzymes microbiennes I.4- Applications I.4.1- Enzymes et propriétés des micro- organismes: Toutes les propriétés des micro-organismes sont sous la dépendance d’enzymes. Exemples: - Métabolisme: toutes réactions - Pouvoir pathogène et pouvoir toxinogène Exemple: coagulase chez Staphylococcusaureus 32 I- Les enzymes microbiennes I.4- Applications I.4.2- Enzymes: critères d’identification des micro-organismes Exemple: recherche de la catalase pour orienter l’identification des cocci à Gram positif 33  I- Les enzymes microbiennes I.4- Applications I.4.3- Applications industrielles - Production industrielle d’enzymes microbiennes Exemples: lipases, protéases, amylases, etc. - Bioconversions: transformation de molécules à l’aide de micro-organismes Exemples:. Fixation du groupement amide sur la pénicilline 34  PEM Plan général I- Les enzymes microbiennes II- Physiologie Microbienne II- 1- Nutrition des micro-organismes II- 2- Paramètres physico-chimiques de la croissance microbienne II-3- Cinétique de la croissance microbienne II-4- Le métabolisme microbien VI- Les agents antimicrobiens VII- Immunologie, Sérologie 35  INTRODUCTION La physiologie microbienne est l’ensemble des conditions où la cellule bactérienne  Se forme, se développe  Vit, se reproduit  Dépérit et meurt Cette discipline regroupe la Nutrition la croissance (paramètres et cinétique) le métabolisme microbien 36  Chapitre II-1 NUTRITION DES MICRO-ORGANISMES Généralités 1- L’eau 2- La source d’énergie 3- La source de Carbone 4- La source d’Azote 5- Les éléments minéraux 6- Les facteurs de croissance 37 II- 1- La nutrition des micro-organismes Généralités o Pour les micro-organismes unicellulaires (Bactéries et Levures), croissance = augmentation de l’effectif. on parle de colonie Colonie: c’est l’ensemble d’individus issus d’un individu unique par voie asexuée 38 II- 1- La nutrition des micro-organismes Généralités o Pour les Pluricellulaires (Champigons), croissance = augmentation de la taille du mycélium (élongation et ramification des filaments) On parle également du terme Thalle : ensemble de filaments (hyphes), souvent assemblés en mycelium II- 1- La nutrition des micro-organismes Généralités Levures en bourgeonnement Gélose lactosée Bactérie en phase de croissance prête à se diviser (SCISSIPARITE) 40 II- 1- La nutrition des micro-organismes Généralités scissiparité Bourgeonnement de levures 41 II- 1- La nutrition des micro-organismes Généralités Penicillium sp. au microscope optique Aspergillus sur milieu Malt-Agar II- 1- La nutrition des micro-organismes Généralités o Pour tous les micro-organismes, croissance = multiplication = Division = développement = pousse 43 II- 1- La nutrition des micro-organismes Généralités La croissance des micro-organismes dépend de: o Facteurs physico-chimiques; o La présence éventuelle de substances inhibitrices; o Facteurs biologiques (antagonisme, stimulation, agents biologiques antimicrobiens); o Facteurs nutritionnels : eau, sources d’énergie, de Carbone et d’Azote, éléments minéraux + facteurs de croissance (éventuellement). 44 II- La nutrition des micro-organismes Rappel du plan Généralités 1- L’eau 2- La source d’énergie 3- La source de Carbone 4- La source d’Azote 5- Les éléments minéraux 6- Les facteurs de croissance 45 II- La nutrition des micro-organismes 1- L’eau o Généralités, notion d’activité de l’eau o Échanges entre micro-organisme et milieu o aw minimale et aw optimale de croissance o Micro-organismes osmophiles o Micro-organismes halophiles o Application à la conservation des aliments 46 II.La nutrition des micro-organismes II.1- L’eau Généralités, notion d’activité de l’eau - L’eau: 80 à 90% du poids des micro-organismes - Seule l’eau libre du milieu est utilisable et assimilable - La proportion d’eau libre s’exprime par l’activité de l’eau ou aw(activity of water) aw = Pression de vapeur du milieu = ERH Pression de vapeur de l’eau pure 100 ERH= Humidité relative d’équilibre 47 Formule permettant de calculer l’aw 0 < aw< 1 48 II.La nutrition des micro-organismes 1- L’eau - H20 indisponsable pour de nombreuses réactions cellulaires d’hydrolyse Exemple : Lactose + H2O glucose + galactose - H20 Nécessaire comme solvant des constituants cellulaires : - H20 permet le transport des nutriments du milieu de culture dans le cytoplasme et assure la disponibilité de ces constituants 50 II- La nutrition des micro-organismes II.1- L’eau Échanges entre micro-organisme et milieu - Expression en pression osmotique. Milieu isotonique: équilibre. Milieu hypotonique: turgescence; le micro- organisme absorbe de l’eau; son aw augmente (éclatement en cas d’écart important: lyse). Milieu hypertonique: plasmolyse; le micro- organisme perd de l’eau, son aw interne diminue 51 II- La nutrition des micro-organismes II.1- L’eau Valeurs cardinales de l’aw pour les micro-organismes: - aw optimale de croissance - aw minimale de croissance Remarque: pour une activité métabolique donnée (ex.: production d’une toxine), ces valeurs peuvent différer de celles de la croissance 52 II- La nutrition des micro-organismes II.1- L’eau - Aw optimale de croissance (souvent 0,9 à 1) En général, bactéries plus hygrophiles que levures et moisissures Exemples: Bactéries (Clostridium,Salmonella, Staphylococcus) : 0,990-0,995 Moisissures: Aspergillus glaucus: 0,93; Xeromyces bisporus: 0,90 53 II- La nutrition des micro-organismes II.1- L’eau Valeurs moyennes des aw minimales des différents groupes microbiens Bactéries à Gram négatif, quelques levures 0,95- ≈ 1 Majorité des cocci, lactobacilles, qq moisissures 0,91-0,95 Majorité des levures 0,87-0,91 Majorité des moisissures, Staphylococcus aureus 0,80-0,87 Moisissures xérophiles 0,67-0,75 Levures osmophiles 0,60-0,65 54 AW Microorganismes inhibés aux Aw aliments ayant l’Aw de l’intervalle 100 aw de l’aliment, l’aliment absorbe de l’eau Pour les produits à aw faible (céréales, épices, etc.), l’aw peut devenir favorable au développement des moisissures La température joue un rôle important dans l’échange d’humidité et dans la croissance elle même 146 III- Paramètres physicochimiques de la croissance microbienne III-3- L’Humidité relative de l’air Eau disponible (activité en eau) aw c'est l'eau disponible pour la multiplication des germes (de 0 à 1). C'est aussi l'eau qui peut s'évaporer à la température ambiante Aliment : comment baisser l' aw ? Aliments naturels ont des aw élevés (0.98 - 0.99), qui conviennent parfaitement aux germes. 147 III- Paramètres physicochimiques de la croissance microbienne III-3- L’Humidité relative de l’air Pour inhiber, faut baisser l' aw Viande, poissons aw = 0.99 (teneur en eau 75%) Légumes aw = 0.99, Fruits aw = 0.98, Charcuterie sèche aw = 0.85-0.95, Pain frais aw = 0.78 (teneur en eau 30%) Confitures aw = 0.75-0.80, Céréales aw = 0.70 Epices aw = 0.30-0.50 148  III- Paramètres physicochimiques de la croissance microbienne III-3- L’Humidité relative de l’air diminuer l'aw des aliments pour diminuer la croissance des germes. => enlever de l'eau: sécher, déshydrater, voire lyophiliser. - Ajouter sel ou sucre - Congeler aussi abaisse l'aw (glace à -18°C. aw = 0.84) Attention ne pas confondre aw et teneur en eau, Par exemple : les fruits secs contiennent 20% d'eau, la viande séchée 10% d'eau et la même aw = 0.7 les noix sèche 5% d'eau. 149  III- Paramètres physicochimiques de la croissance microbienne III-3- L’Humidité relative de l’air Les micro-organismes craignent la sécheresse, mais peut- on avoir des précisions? hygrophiles, mésophiles, xérophiles (xéros = sec). halotolérants et halophiles (halos = sel). Mais le plus utile à savoir c'est que : - les bactéries "normales" ont besoin de beaucoup d'eau libre Bactéries 0,93 < aw < 0,99 - les coques tolèrent mieux le sec que les bacilles, et S. aureus est la plus "dromadaire" des bactéries pathogènes 150 III- Paramètres physicochimiques de la croissance microbienne III-3- L’Humidité relative de l’air - les levures arrivent à croître au dessus de 0.8 - les moisissures sont les plus résistantes au sec, et poussent au dessus de 0.7, mais lentement bactéries pathogènes les seuils minimaux : aw > 0.95 Clostridium perfringens aw > 0.94 Salmonella aw > 0.93 Clostridium botulinum (10% de NaCl) aw > 0.90 Staphylococcus aureus "résiste" au dessus de 0.86, et toxine +0.93) Réglementation: Préparation alimentaire stabilisée si aw ≤ 0.91 Stable aussi si aw < 0.95 et pH < 5.2 151 III- Paramètres physicochimiques de la croissance microbienne Rappel du plan III.1- La Température III.2- Le pH III.3- L’Humidité Relative de l’Air III.4- Le potentiel Redox III.5- La pression osmotique III.6- Interférences entre les paramètres physico-chimiques 152 III- Paramètres physicochimiques de la croissance microbienne III-4- Le potentiel Redox Redox : Potentiel d'oxydo-réduction et Oxygène Le Redox capacité à accepter ou céder des électrons (oxydation: perte d’électrons/ réduction: gain d’électrons) Dans l'aliment, redox difficile à mesurer et variable dans temps. - cuisson de la viande (formation de composés de maillard, réducteurs) et l'ébullition (qui chasse l'air) rendent l'aliment réducteur (pot-au-feu, conserves). - croissance d'une importante population bactérienne rend l'aliment réducteur. - gros morceaux compacts, les aliments pâteux gardent leur anaérobiose (jambon entier, gros morceau de boeuf du pot-au-feu, gruyère, sauce épaisse). 153 III- Paramètres physicochimiques de la croissance microbienne III-4- Le potentiel Redox aliment peu épais (tranche de viande), liquide (lait), "poreux" et vivant (légumes), ou finement divisé (poudre) et exposé à l'air ne peut pas devenir réducteur, 154 III- Paramètres physicochimiques de la croissance microbienne III-4- Le potentiel Redox Classification des micro-organismes en fonction de leurs exigences en potentiel Redox (types respiratoires): -Aérobies stricts: Pseudomonas psychrophiles des tanks à lait, Bacillus - Aérobies facultatifs ou Aéro-anaérobies: entérobactéries (Salmonella, E.coli), levures - Microaérophiles: faible teneur en O2: - lactobacilles & autres bactéries lactiques. - Anaérobies stricts: Clostridium botulinum et perfringens. 155  milieu gélosé zone de croissance microbienne Anaérobie Microaérophile strict Aérobie Mésoanaérobie Aéro-anaérobie strict facultatif Différents types respiratoires des micro-organismes 156  III- Paramètres physicochimiques de la croissance microbienne III.4- Le potentiel Redox - Aérobies stricts: rH: env. 20 - Anaérobies stricts: rH< 8 ou même < 6 - Aéro-anaérobies facultatifs: métabolisme respiratoire (présence d’O2) ou fermentatif (absence d’O2) - Microaérophiles: rH < 14 - Mésoanaérobies: : rH: 8 à 12 157  III- Paramètres physicochimiques de la croissance microbienne III.4- Le potentiel Redox Répartition des différents groupes microbiens: - Bactéries: toutes catégories possibles - Levures: aéro-anaérobies facultatives (métabolisme dominant oxydatif ou fermentatif); Rhodotorula aérobies strictes - Moisissures: aérobies strictes ou micro- aérophiles 158 III- Paramètres physicochimiques de la croissance microbienne III-4- Le potentiel Redox Structure physique et composition de l'aliment (nutriments) Structure physique de l'aliment : Obstacles & barrières naturelles: La "peau" est un "emballage" naturel anti-contamination, qui écarte les microbes. - Peau et aponévroses des animaux, et de leurs muscles - Coquille et membranes coquillières de l'oeuf entier 159 III- Paramètres physicochimiques de la croissance microbienne III-4- Le potentiel Redox - "peau" des fruits, paroi des cellules végétales - graisse solide isolant les parties aqueuses (confit, beurre, voire mayonnaise "solide") liquides (lait, sang) ne présentent pas d'obstacle à la diffusion des germes. Souvent les procédés technologiques conduisent à enlever ou fragiliser ces barrières. On doit donc les reconstituer si possible: emballages divers, "croûte" du pain et du fromage, gels et émulsions qui "immobilisent" les bactéries, et tous les autres procédés vus (pH, aw, t°C) 160  III- Paramètres physicochimiques de la croissance microbienne III-4- Le potentiel Redox Composition de l’aliment : Nutriments favorables aux bactéries - Les aliments contiennent tous les nutriments nécessaires au développent bactérien. Cependant l'équilibre de ces nutriments peut favoriser tel ou tel germe; - Les bactéries utilisent plus facilement le glucose que l'amidon, et les acides aminés que les protéines, mais beaucoup de micro- organismes sont protéolytiques. - Beaucoup de pathogènes se développent particulièrement bien sur les denrées animales (viande et jaune d’œuf). 161 CONCLUSION En résumé, pour conserver les aliments, il faut combattre les germes, par 3 approches complémentaires : 1- Eviter la contamination, 2- Tuer les germes, et/ou 3- Inhiber leur développement Le plus important de ce qui précède c'est que: 1- On peut tuer les bactéries par la chaleur. Savoir expliquer D, z et certaines t°C critiques 2- On peut inhiber les bactéries par le froid. Savoir quelques t°C critiques 3-Les aliments "secs" ou "acides" sont protégés. Savoir quelques aw et pH critiques 162 III- 2- Paramètres physicochimiques de la croissance microbienne Rappel du plan III.1- La Température III.2- Le pH III.3- L’Humidité Relative de l’Air III.4- Le potentiel Redox III.5- La pression osmotique III.6- Interférences entre les paramètres physico-chimiques 163 III- Paramètres physicochimiques de la croissance microbienne 5- La pression osmotique Effet de la pression osmotique La bactérie accumule dans le cytoplasme une concentration élevée en substrats PO int > PO ext Si forte augmentation de l'osmolarité du milieu extracellulaire risque d’efflux d'eau plasmolyse inhibition de processus vitaux: biosynthèse de macromolécules, réplication de l'ADN etc… : arrêt de croissance, Pour éviter cela, la bactérie doit ajuster sa pression osmotique interne a une valeur supérieure a celle du milieu externe, C’est l’osmorégulation: accumulation de K+, d’acides amines, sucres etc… 164 III- Paramètres physicochimiques de la croissance microbienne 5- La pression osmotique Selon ce pouvoir d’osmorégulation, on distingue 4 groupes de bactéries Groupe Exemple [NaCl] toleree Non Halophiles E. coli 0a4% Halophiles Pseudomonas 0,2 a 5 % marina Halophiles Pediococcus 2,3 a 20,5 % modérés halophilus Halophiles Halobacterium 5 a 36 % extrêmes 165 III- Paramètres physicochimiques de la croissance microbienne Rappel du plan III.1- La Température III.2- Le pH III.3- L’Humidité Relative de l’Air III.4- Le potentiel Redox III.5- La pression osmotique III.6- Interférences entre les paramètres physico-chimiques 166  III- 2- Paramètres physicochimiques de la croissance microbienne III.6- Interférences entre ces différents paramètres pH et aw Température Durée de Catégorie de conservatio viande n pH > 5,2 ou < + 5°C 15 jours Très aw > 0,95 périssabl e 5