Cours Génétique - Alexis Lalouette 2018-2019 2.pdf

SV03U040–VT03U040 : Biologie moléculaire et génétique 2 Alexis Lalouette [email protected] 1 Lectures: -William Klug et Michael Cummings – Génétique – Pearson - James Watson – Biologie moléculair...

SV03U040–VT03U040 : Biologie moléculaire et génétique 2 Alexis Lalouette [email protected] 1 Lectures: -William Klug et Michael Cummings – Génétique – Pearson - James Watson – Biologie moléculaire du gène – Pearson - Jean-Luc Rossignol – Génétique, gènes et génomes – Dunod - Griffiths, Carroll, Wessler, Doebley – Introduction à l’analyse génétique – De Boeck 2 Rappels Qu’est ce que la génétique ? Science de la transmission et de l’expression des caractères Démarche expérimentale 3 Rappels - transmission 4 Rappels - transmission Copie de l’information Mécanisme de transmission Structure de l’information : ADN, chromosomes, gènes Variabilité de l’information sous-tendant la variabilité des caractères Mécanismes de transmission : mitose et méiose 5 Rappels – expression Expression génétique ARN et ADN Expression Protéines Caractères Environnement Couleur du pelage Chapitre 4 – cours de Licence 1 Biologie Moléculaire et Génétique 30BU02SV 6 Rappels – expression Comment faire le lien ADN Expression génétique 20.000 gènes 7 Rappel – démarche expérimentale ADN Expression génétique 20.000 gènes Différence Différence Différence ADN Expression génétique 20.000 gènes 8 Rappels - définitions - génome et génotype Génome d’un individu/organisme Ensemble du matériel génétique (patrimoine héréditaire) de cet individu/organisme. Génotype (définition transitoire) Etat de ce génome à chaque position 9 Rappels - génome et génotype Organisation du génome humain Gènes → protéine ou RNA = 28 % Gène 1 Chromosome Gène 2 3000 Megabase: 3 milliards paires de bases 23 paires de chrosomosomes 19 000 gènes 10 Rappels - génome et génotype 19 000 19 000 E. coli 15 000 6 000 4 000 11 4,6. 106 12. 106 120. 106 3. 109 1,2. 109 Rappels - gène / site Site : position sur le chromosome Gène : unité fonctionnelle 12 Rappels - gène / site - génotype -On appelle allèles les différentes formes que peut prendre un site ou un gène. -On appelle allèle sauvage la forme allélique de référence (ici : a+) Gène : A Allèles : a+ a1 C►T a2 G►C a3 Les allèles a1, a2 et a3 sont mutés dans le même gène mais sur des sites différents 13 Rappels - gène / site - génotype - Le génotype est la composition génétique d’un individu / ensemble des allèles. -Chez la levure (état haploïde), en considérant deux sites A et B, et deux allèles pour chacun de ces sites (respectivement a1, a2 et b1, b2), il y a 4 génotypes possibles: Génotype 1 : a1 b1 Génotype 2 : a2 b1 Génotype 3 : a1 b2 Génotype 4 : a2 b2 14 Rappels - mutation 15 Rappels - phénotype Phénotype pheno = apparent (ce qui se voit) Ensemble des caractères observables chez un individu Nomenclature Phénotype est entre crochet [jaune, ride] 16 [vert, lisse] [Rouge-Brun] [white] Rappels - phénotype -Le phénotype est le résultat observé de l’interaction entre l’expression d’un allèle d’un gène et le milieu extérieur. -Le phénotype se définit pour un caractère observé. Exemple : Anémie falciforme Mutation ponctuelle dans le gène de la b-globine Changement d’un acide aminé en position 6 Hémoglobine anormale Hématies en faucille Destruction des hématies Anomalies de la circulation sanguine Accumulation des cellules en faucille dans la rate Anémie Dommages aux organes Fibrose de la rate Fatigue Insuffisance cardiaques Insuffisance rénale Rhumatismes 17 Rappels - notion de dominance/récessivité Considérons le site A, ses deux allèles a1 et a2 et le caractère X associé à l’expression de A Génotype au site A Zygotie au site A Phénotype (caractère X) a1/a1 homozygote [X1] a2/a2 homozygote [X2] a1/a2 hétérozygote ? Si les individus a1/a2 sont de phénotype [X1], on dit que le phénotype associé à l’expression de l’allèle a1 est dominant par rapport au phénotype associé à l’expression de l’allèle a2. Si les individus a1/a2 sont de phénotype [X2], on dit que le phénotype associé à l’expression de l’allèle a1 est récessif par rapport au phénotype associé à l’expression de l’allèle a2. Si les individus a1/a2 ont un phénotype résultant de l’expression des deux allèles (phénotype [X1-2]), on dit que les phénotypes associés à l’expression des allèles a1 et a2 sont codominants. 18 Rappels - comment se transmettent les gènes : mitose B B Une cellule 2 n chromosomes à 1 chromatide A A Quantité d’ADN : 2 n Phase S : réplication de l’ADN Une cellule B B 2 n chromosomes à 2 chromatides A A Quantité d’ADN : 4 n Phase M : mitose B B B B A A A A 19 Deux cellules - 2 n chromosomes à 1chromatide - Quantité d’ADN : 2 n Rappels - comment se transmettent les gènes : méiose Phase S Première division Seconde division Réplication de méiose de méiose « réductionnelle » « équationnelle » B B B B B B B B B B 1 cellule 1 cellule 2 cellules 4 cellules Quantité ADN : 2n Quantité ADN : 4n Quantité ADN : 2n Quantité ADN : n 20 Rappels - comment se transmettent les gènes cycles de vie 2n Chr n Chr 2n Chr diploïde haploïde diploïde ♀ Méiose Fécondation ♂ Naissance 21 Rappels - comment se transmettent les gènes cycles de vie Mitose Mitose Haploïde Haploïde (n) (n) Fusion Fécondation Zygote (2n) Diploïde (2n) Méiose 22 4 spores haploïdes (n) I – Introduction The Nobel Prize in Physiology or Medicine, 1995 23 I – Introduction - 1 – Le modèle drosophile Thomas Hunt Morgan (1866-1945) Prix Nobel de Physiologie ou Médecine (1933) pour ses découvertes sur le rôle des chromosomes dans l’hérédité. 24 I – Introduction - 1 – Le modèle drosophile – a - Présentation Facile à élever en laboratoire – coût faible Une génération tous les 10-15 jours Organisme prolifique 4 paires de chromosomes Génome séquencé dans de nombreuses espèces Drosophila melanogaster : 120,000,000 de paires de bases Très grande collection de mutants disponible Transgenèse facile 25 I – Introduction - 1 – Le modèle drosophile – b – Cycle de vie 26 I – Introduction - 1 – Le modèle drosophile – c - Développement www.flybase.org 27 I – Introduction - 1 – Le modèle drosophile – c - Développement 28 I – Introduction - 1 – Le modèle drosophile – c - Développement 29 I – Introduction - 2 – Question scientifique - Quels sont les mécanismes menant à la segmentation ? - Quels sont les gènes qui en sont responsables 30 I – Introduction - 2 – Question scientifique Bridges 1915 31 I – Introduction - 2 – Question scientifique Bridges 1915 32 I – Introduction - 2 – Question scientifique Analyse génétique du complexe bithorax Bridges 1915 33 I – Introduction - 2 – Question scientifique – gènes affectant le nombre, la taille ou la polarité des segments ? Les mutations homéotiques (par exemple bithorax) semblent être impliquées dans l’étape finale du processus de réponse. Ces mutations changent l’identité des segments ; par exemple, Ultrabithorax transforme le segment metathoraciques et le premier segment abdominal en segments mesothoraciques. Les locus homéotiques n’affectent toutefois pas le nombre total, la taille ou la polarité des segments. Mise en place Identité 34 I – Introduction - 2 – Question scientifique – gènes affectant le nombre, la taille ou la polarité des segments ? Mise en place Identité Quels sont les gènes impliqués dans la mise en place du nombre de segments et de leur polarité ? 35 Les approches expérimentales Biochimie Génétique Purifier les composants Obtenir des mutants Mettre au point des altérés pour la fonction réactions in vitro étudiée Identifier les Les analyser composants Cloner les gènes nécessaires impliqués Déterminer leurs intérêts Cours BMGI 2018-2019 – A. Plessis, M. Nadal 36 I – Introduction - 3 – Démarche expérimentale Aucun mutant n’affecte le nombre, la taille ou la polarité des segments → des mutations dans ces gènes doivent altérer la viabilité des adultes → recherche de nouvelles mutations affectant la taille, la polarité ou le nombre de segments Création de nouveaux mutants Regarder l’effet des mutations sur la larve plutôt que sur l’adulte Approche génétique : mutagenèse suivie d’un crible Recherche de mutations récessives 37  Bilan 2 crible pour mutants A réplication Mutagenèse: agent mutagène qui augmente le taux de mutations (donc la fréquence des mutants) Sélection indirecte (méthode des repliques velours)de mutants conditionnels c’est-à-dire dont l’effet dépend de l’environnement (=des conditions) Ici mutation à effet thermosensible: pas d’effet aux basses température dites permissives et un effet aux températures plus élevées (dites restrictives) Tests biochimiques Identification de nombreux mutants ts ne pouvant répliquer correctement l’ADN à température restrictive >>> trois ADN polymérases. 38 Cours BMGI 2018-2019 – A. Plessis, M. Nadal II – Démarche expérimentale – 1 - Mutagenèse Agent mutagène Méthanesulfonate d'éthyle (EMS) I II III IV Mutations au hasard I II III IV Mutations somatiques : non transmises Mutations germinales : transmises 39 II – Démarche expérimentale – 1 - Mutagenèse F0* I II III IV I II III IV I II III IV I II III IV I II III IV Mutations somatiques : non transmises I II III IV I II III IV Mutations germinales : transmises Beaucoup de spermatozoïdes … → beaucoup de mutations différentes 40 : mutation II – Démarche expérimentale – 2 – Crible – a - principe Crible génétique : protocole expérimental permettant d’isoler des mutations présentant un phénotype donné parmi une population de mutants F0* I II III IV I II III IV Parmi toutes ces mutations seules quelques-unes, à l’état homozygote, I II III IV affectent le nombre, la taille ou la I II III IV polarité des segments. I II III IV Comment les trouver ? I II III IV 41 II – Démarche expérimentale – 2 – Crible – a - principe F0* Altération dans l’organisation des segments ? I II III IV I II III IV I II III IV I II III IV I II III IV I II III IV I II III IV I II III IV I II III IV I II III IV I II III IV I II III IV → Mettre les mutations récessives à l’état homozygote pour observer le phénotype éventuel 42 II – Démarche expérimentale – 2 – Crible – a - principe Altération dans l’organisation des segments ? I II III IV I II III IV → Définition du caractère à observer et des phénotypes à cribler. Perturbation dans le nombre ou la polarité des segments chez la larve. 43 II – Démarche expérimentale – 2 – Crible – b - protocole 2600 F1 F0* X I II III IV I II III IV I II III IV I II III IV I II III IV I II III IV I II III IV I II III IV I II III IV I II III IV I II III IV I II III IV I II III IV I II III IV I II III IV I II III IV I II III IV I II III IV 44 Comment isoler les mutations récessives ? II – Démarche expérimentale – 2 – Crible – b - protocole 2600 F1 I II III IV ♂ F1 a1/a+ [+] I II III IV I II III IV I II III IV I II III IV I II III IV I II III IV 45 Comment isoler les mutations récessives ? II – Démarche expérimentale – 2 – Crible – b - protocole 2600 ♂♀ F1 x 2600 ♀♀ WT ♂ F1 a1/a+ [+] ♀ WT a+/a+ X I II III IV I II III IV Génotype Phénotype ♂ a1 a+ ♀ F2 : 50% a1/a+ a+ 50% a+/a+ a1/a+ a+/a+ a+ [WT] 2600 descendances a1/a+ a+/a+ F2 46 Comment isoler les mutations récessives ? II – Démarche expérimentale – 2 – Crible – b - protocole 2600 ♂ F2 x 2600 ♀ F2 ♂ F2 a1/a+ [+] ♀ F2 a1/a+ X Génotype Phénotype ♂ a1 a+ F3 : 50% a1/a+ [WT] ♀ 25% a+/a+ a1 a1/a1 a+/a+ 25% a1/a1 [m] a+ ou a1/a+ a+/a+ [WT] 47 Comment isoler les mutations récessives ? II – Démarche expérimentale – 2 – Crible – b - protocole 2600 2600 F1 2600 F2 Isolement de 56 lignées portant une ou des mutations affectant la taille, la polarité ou le nombre de segments 48 Comment isoler les mutations récessives ? II – Démarche expérimentale – 2 – Crible – c - Résultat Polarité 49 Résultat du crible II – Démarche expérimentale – 2 – Crible – c - Résultat Pair-rule 50 Résultat du crible II – Démarche expérimentale – 2 – Crible – c - Résultat Gap 51 Résultat du crible II – Démarche expérimentale – 2 – Crible – c - Résultat 12 16 28 52 Résultat du crible II – Démarche expérimentale – 2 – Crible – d – Questions 12 16 28 1 – Pour chaque « mutant », combien de sites mutés responsables du phénotype ? 2 – Les différents mutants sont-ils mutés sur les ou les mêmes gènes ? 3 – Où sont localisés les sites mutés les uns par rapport aux autres ? 53 III - Analyse des résultats – 1 - nombre de sites mutés – a - Exposé du problème 2600 2600 F1 2600 F2 56 F3 Spermatozoïdes Mouches Lignées (souches) 1 lignée parmi les 28 qui présentent un défaut de polarité des segments a1 1 site muté [m] I II III IV a1 a1 b1 2 sites mutés [m] I II III IV a1 b1 54 Pour chaque « mutant », combien de sites mutés responsables du phénotype ? III - Analyse des résultats – 1 - nombre de sites mutés – a - Exposé du problème Souche pure 1 : Caractère étudié : forme des pois. Phénotypes associés : [lisse] ou [L] et [ridé] ou [R]. Souche pure 2 : Combien de sites impliqués dans le déterminisme de la forme des pois diffèrent entre la souche pure 1 et la souche pure 2 ? a1 a2 1 site muté a1 a2 a1 b1 a2 b2 2 sites mutés a1 b1 a2 b2 III - Analyse des résultats – 1 - nombre de sites mutés – b – Cas d’un seul site Il n’y a qu’un seul site A qui diffère entre les deux souches pures et qui est impliqué dans le déterminisme de la forme des pois. a1 Souche pure 1 : Phénotype [L], génotype a1 a2 Souche pure 2 : Phénotype [R], génotype a2 a1 a2 P1: [L] X P2: [R] 1 2 a a P1 P2 a1 a2 a1 a2 [L] Phénotype associé à l’expression de l’allèle a1 est dominant par rapport au phénotype associé à l’expression de l’allèle a2 (a1 > a2). III - Analyse des résultats – 1 - nombre de sites mutés – b – Cas d’un seul site a1 a1 F1: [L] X F1: [L] a2 a2 F1 a1 a2 F1 50% 50% a1 a1 a1 [L] [L] 50% a1 a2 a2 a2 a2 [L] [R] 50% a1 a2 en F2 : 75% [L] et 25% [R] III - Analyse des résultats – 1 - nombre de sites mutés – c – Cas d’un seul site sur un chromosome sexuel S1 : phénotype œil rouge [R] Un seul site W, porté par le chromosome X, impliqué dans le déterminisme de la couleur S2 : phénotype œil blanc [B] des yeux diffère entre ces deux souches. w1 w2 ♀S1 [R] ♀ S2 [B] w1 w2 w1 w2 ♂ S1 [R] ♂ S2 [B] ♂ hémizygotes III - Analyse des résultats – 1 - nombre de sites mutés – c – Cas d’un seul site sur un chromosome sexuel w1 w2 w2 w1 ♀S1 [R] X ♂ S2 [B] ♀ S2 [B] X ♂ S1 [R] w1 w2 ♂ ♂ w2 w1 ♀ ♀ w2 w1 w1 w2 w1 [R] [R] w2 [R] [B] w1 w2 w2 w1 ♀ : 1 [R] ♀ : 2 [R] w w F1 F1 w1 w2 ♂: [R] ♂: [B] III - Analyse des résultats – 1 - nombre de sites mutés – c – Cas d’un seul site sur un chromosome sexuel w2 w1 w1 w2 ♀ : 1 [R] X ♂ : [R] ♀ : 2 [R] X ♂ : [B] w w ♂ ♂ w2 w1 ♀ ♀ w1 w1 w2 w1 w1 [R] [R] w1 1 [R] [R] w1 w w2 w1 w 2 w2 w2 w 2 [B] [R] [B] [B] w 2 w2 Au total: 75% [R], 25% [B] Au total: 50% [R], 50% [B] ♀ : 100%[R] ♀ : 50% [R], 50% [B] ♂ : 50% [R] ; 50% [B] ♂ : 50% [R], 50% [B] III - Analyse des résultats – 1 - nombre de sites mutés – d – Cas de deux sites Il y a deux sites A et B qui diffèrent entre les deux souches pures et qui sont impliqués dans le déterminisme de la forme des pois. a1 b1 Souche pure 1 : Phénotype [L], génotype a1 b1 a2 b2 Souche pure 2 : Phénotype [R], génotype a2 b2 a1 b1 a2 b2 P1: 1 1 [L] X P2: 2 2 [R] a b a b P1 P2 a1b1 a2b2 a1 b1 [L] a2 b2 III - Analyse des résultats – 1 - nombre de sites mutés – d – Cas de deux sites b1 b2 b1 b2 a1 a2 a1 a2 Méioses Méioses Associations b1 25% b2 25% b1 b2 alléliques a1 a2 a1 a2 parentales Associations 25% 25% alléliques b1 b2 b2 b2 a2 a1 a1 a1 recombinées 62 Proportions ? III - Analyse des résultats – 1 - nombre de sites mutés – d – Cas de deux sites Associations alléliques Associations alléliques parentales recombinées F1 a1b1 a2b2 a1b2 a2b1 F1 1/4 1/4 1/4 1/4 Associations alléliques Associations alléliques a1b1 a1 b1 a2 b2 a1 b2 a2 b1 [L] 1 1 [L] 1 1 [?] 1 1 [?] a1 b1 a b a b a b parentales 1/4 1/16 1/16 1/16 1/16 a1 b1 a2 b2 a1 b2 a2 b1 a2b2 [L] 2 2 [R] 2 2 [?] 2 2 [?] 1/4 a2 b2 a b a b a b 1/16 1/16 1/16 1/16 a1b2 a1 b1 a2 b2 a1 b2 a2 b1 [?] 1 2 [?] 1 2 [?] 1 2 [L] recombinées 1/4 a1 b2 a b a b a b 1/16 1/16 1/16 1/16 a1 b1 a2 b2 a1 b2 a2 b1 a2b1 [?] 2 1 [?] 2 1 [L] 2 1 [?] 1/4 a2 b1 a b a b a b 1/16 1/16 1/16 1/16 III - Analyse des résultats – 1 - nombre de sites mutés – d – Cas de deux sites – relation génotype-phénotype a1 b1 a2 b2 a1 b2 [L] [R] [L] a1 b1 a2 b2 a2 b1 a1 b2 a1 b2 a2 b1 1 1 [?] 2 2 [?] 2 1 [?] a b a b a b Déjà observé a2 b1 a2 b1 a1 b2 [?] [?] [?] a1 b1 a2 b2 a1 b2 a2 b2 a1 b1 [L]  [L] a1 b1 a2 b2 III - Analyse des résultats – 1 - nombre de sites mutés – d – Cas de deux sites – relation génotype-phénotype a1 b1 a2 b2 a1 b2 [L] [R] [L] a1 b1 a2 b2 a2 b1 a1 b2 a1 b2 a2 b1 [L] [?] [?] a1 b1 a2 b2 a2 b1 a2 b1 a2 b1 a1 b2 1 1 [L] 2 2 [?] 1 2 [?] a b a b a b a2 b2 a1 b1 [L]  [L] a1 b1 a2 b2 III - Analyse des résultats – 1 - nombre de sites mutés – d – Cas de deux sites – relation génotype-phénotype Cas 1 Cas 2 Un seul site homozygote pour Les deux sites doivent être l’allèle 2 suffit pour donner le homozygotes pour l’allèle 2 phénotype [R] pour donner le phénotype [R] a1 b2 a2 b2 [R] [L] [R] a2 b1 a2 b2 [R] [L] [L] a2 b1 a2 b1 [R] [L] [L] a1 b2 a1 b2 [R] [L] [R] NON III - Analyse des résultats – 1 - nombre de sites mutés – d – Cas de deux sites Associations alléliques Associations alléliques parentales recombinées F1 a1b1 a2b2 a1b2 a2b1 F1 1/4 1/4 1/4 1/4 Cas 1 Associations alléliques Associations alléliques a1b1 a1 b1 a2 b2 a1 b2 a2 b1 [L] 1 1 [L] 1 1 [L] 1 1 [L] a1 b1 a b a b a b 9/16 : [L] parentales 1/4 1/16 1/16 1/16 1/16 7/16 : [R] a1 b1 a2 b2 a1 b2 a2 b1 a2b2 [L] 2 2 [R] 2 2 [R] 2 2 [R] 1/4 a2 b2 a b a b a b 1/16 1/16 1/16 1/16 Cas 2 a1b2 a1 b1 a2 b2 a1 b2 a2 b1 15/16 : [L] [L] 1 2 [R] 1 2 [R] 1 2 [L] recombinées 1/4 a1 b2 a b a b a b 1/16 : [R] 1/16 1/16 1/16 1/16 a1 b1 a2 b2 a1 b2 a2 b1 a2b1 [L] 2 1 [R] 2 1 [L] 2 1 [R] 1/4 a2 b1 a b a b a b 1/16 1/16 1/16 1/16 III - Analyse des résultats – 1 - nombre de sites mutés – e – conclusion 1 site 12/16 : [L] 4/16 : [R] 2 sites 9/16 : [L] 7/16 : [R] III - Analyse des résultats – 1 - nombre de sites mutés – f – variabilité expérimentale Expérience 1 Expérience 2 Expérience 3 N % N % N % [L] 773 77,3% 144 72% 380 76% [R] 227 22,7% 56 28% 120 24% Total 1000 100% 200 100% 500 100% III - Analyse des résultats – 1 - nombre de sites mutés – f – variabilité expérimentale a1 Plante F1, génotype a2 Organes reproducteurs 50% de gamètes a1 (des milliers/millions) 50% de gamètes a2 (des milliers/millions) Croisement F1xF1 et analyse de 100 F2  Tirage aléatoire de 100 gamètes ♀ et de 100 gamètes ♂ parmi les milliers/millions présents dans les organes reproducteurs III - Analyse des résultats – 1 - nombre de sites mutés – f – variabilité expérimentale Petite expérience de génétique virtuelle … a1 a1 F1 2 X F1 2 a a 50% a1 50% a1 Organes reproducteurs : 50% a2 50% a2 Face : a1 10 tirages aléatoires chez chacun des deux parents : Pile : a2 Si deux sites, on peut faire la même expérience avec les 4 génotypes des gamètes a1b1, a1b2, a2b2, a2b1 III - Analyse des résultats – 1 - nombre de sites mutés – g – Résultat 56 ♂ F2 x ♀ F2 ♂ F2 ♀ F2 X Phénotype F3 [WT] ≈ 75% [m] ≈ 25% Pour chacune des 56 lignées de drosophiles, il n’y a qu’un seul site muté impliqué dans le déterminisme du nombre, de la forme ou de la polarité des segments 72 III - Analyse des résultats – 2 – Gènes touchés – a - Exposé du problème 56 souches #1 - Chacune souche mutée sur un seul site I II III IV impliqué dans le déterminisme de la taille, #2 de la polarité ou du nombre des segments I II III IV #3 I II III IV - Aucune idée de la localisation chromosomique de ces sites #4 I II III IV #5 I II III IV #6 I II III IV Ces souches sont-elles … mutées sur le même gène ? #56 I II III IV 73 III - Analyse des résultats – 2 – Gènes touchés – a - Exposé du problème Cas 1 : même gène a1 a2 a1 a2 a1 b + a + b2 Cas 1 : gène différent a1 b a+ b ➡ Test de complémentation fonctionnelle 74  3. Schéma général A Séquences Séquence SC: contrôlant nécessaire Séquence l’initiation de la à la fin de la Codante transcription transcription Initiation Terminaison transcription transcription SC ADN TRANSCRIPTION ARNpol A SC S ARNm Ribosome U T G O TRADUCTION ARN t P Polypeptide Cours BMGI 2018-2019 – A. Plessis, M. Nadal 75  A ATTENTION Un phénotype donné -Peut résulter de différentes mutations dans un même gène -Peut résulter de mutations dans des gènes différents Cours BMGI 2018-2019 – A. Plessis, M. Nadal  A Bilan test de complémentation -N'est applicable qu'à l'étude de mutants d'expression récessive. -Nécessite l'analyse d'une phase diploïde. -Permet de déterminer si 2 mutants sont mutés ou non dans un même gène -Permet d’estimer un nombre minimal de gènes impliqués dans un processus biologique Cours BMGI 2018-2019 – A. Plessis, M. Nadal  A Bilan test de complémentation Si Mi x Mj ➡ [+], il y a complémentation, les deux souches sont mutées sur deux gènes différents Si Mi x Mj ➡ [m], il n’y a pas complémentation, les deux souches sont mutées sur un même gène mais ont des allèles différents de ce gène Cours BMGI 2018-2019 – A. Plessis, M. Nadal III - Analyse des résultats – 2 – Gènes touchés – b - Test de complémentation fonctionnelle ♂ lignée #1 X ♀ lignée #56 Même gène Gènes différents a+ a+ a1 b + a + b2 x x a1 a2 a+ b a+ b a1 ? a b ? 25% 2 [m] 100% [+] a a+ b 79 III - Analyse des résultats – 2 – Gènes touchés – c - Résultat Segment-polarity : 6 gènes Pair-rule : 6 gènes Gap : 3 gènes 80 III - Analyse des résultats – 3 – Localisation génétique Pour chaque mutant, un seul site muté. Les différents mutant sont mutés dans des gènes différents. Où se trouvent les sites mutés dans le génome ? 81 III - Analyse des résultats – 3 – Localisation génétique – a – Brassage interchromosomique Deux caractères: - Couleur des spores, deux phénotypes associés : [N] et [B] - Auxotrophie pour l’arginine, deux phénotypes associés : [arg+] et [arg-] Deux souches: SSR : a+b+ [arg+, N] S1 (souche pure): a1b1 [arg-, B] S1: a1b1 [arg-, B] x SSR a+b+ [arg+, N] On croise plein de S1 avec plein de SSR Fusion des spores Plein de fusions de spores a + b+ diploïdes : On forme plein de diploïdes a 1 b1 Méioses Il y a plein de méioses a+b+ [arg+, N] a+b1 [arg+, B] On observe quelques spores produites a1b1[arg-, B] a1b+[arg-, N] Association parentale Association recombinée III - Analyse des résultats – 3 – Localisation génétique – a – Brassage interchromosomique Résultats d’une méiose b1 b+ a1 a+ b1 b+ a 1 a+ b1 b1 b + b+ a1 a1 a+ a+ a1 b1 a+ b1 a+ b1 a1 a+ b1 b+ ou a1 b+ a+ b+ a1 b+ 2x b1 2x b+ ou 2x b 2x b+ a1 a+ a+ 1 a1 4P Equiprobabilité 4R III - Analyse des résultats – 3 – Localisation génétique – a – Brassage interchromosomique Résultats d’un grand nombre de méioses S1: a1b1 [arg-, B] x SSR a+b+ [arg+, N] Fusion des spores a + b+ diploïdes : a 1 b1 1000 Méioses b1 b+ b b+ a1 a+ a+ 1 a1 a1b1 a+b+ a+b1 a1b+ [arg-, B] [arg+, N] [arg+, B] [arg-, N] ≈1000 = ≈1000 Associations parentales ≈1000 = ≈1000 Associations recombinées 50% 50% III - Analyse des résultats – 3 – Localisation génétique – a – Brassage interchromosomique Résultats d’une expérience de génétique : observation de 200 spores b1 b+ b b+ a1 a+ a+ 1 a1 « urne » de spores a1b1 a+b+ a+b1 a1b+ [arg-, B] [arg+, N] [arg+, B] [arg-, N] ≈1000 = ≈1000 Association parentale ≈1000 = ≈1000 Association recombinée 50% 50% Expérience Tirage aléatoire de 200 spores parmi 4000 de génétique Associations alléliques parentales Associations alléliques recombinées a+ b + a1 b 1 a+ b 1 a1 b + [arg+, N] ≈ [arg-, B] [arg+, B] ≈ [arg-, N] ≈50 ≈50 ≈50 ≈50 P ≈ R III - Analyse des résultats – 3 – Localisation génétique – a – Brassage interchromosomique Notion de fréquence de recombinaison et d’indépendance génétique Associations alléliques parentales Associations alléliques recombinées a+ b + a1 b 1 a+ b 1 a1 b + [arg+, N] [arg-, B] [arg+, B] [arg-, N] 52 49 48 51 P = 101 R = 99 P≈R On ne peut pas exclure qu’on a fait un tirage aléatoire de spores à partir d’une urne contenant 50% de P et 50% de R On définit la fréquence de recombinaison entre A et B 𝐑 𝐅𝐫𝐞𝐜 𝐀𝐁 = 𝐏+𝐑 Si P ≈ R (𝐅𝐫𝐞𝐜 𝐀𝐁≈ 0,5), on dit que A et B sont indépendants génétiquement III - Analyse des résultats – 3 – Localisation génétique – b – Brassage intrachromosomique S1: a1b1 [arg-, B] x SSR a+b+ [arg+, N] b1 b+ a1 a+ Fusion des spores a +b+ b1 b+ diploïdes : a1 a+ a 1b1 Méioses a+b+ [arg+, N] : ? a1b1[arg-, B] : ? Association parentale a+b1 [arg+, B] : ? a1b+[arg-, N] : ? Association recombinée ? III - Analyse des résultats – 3 – Localisation génétique – b – Brassage intrachromosomique – Résultats possibles d’une méiose SSR a+b+ [arg+, N] a+b1 [arg+, B] a1b+ [arg-, N] a+ 1 co b+ a1b1 [arg-, B] 2ème division de méiose 1ère division de méiose Réplication Fusion 0 co a1 b1 a+b+ [arg+, N] a+b+ [arg+, N] a1b1 [arg-, B] S1 a1b1 [arg-, B] III - Analyse des résultats – 3 – Localisation génétique – b – Brassage intrachromosomique – Résultats possibles d’une méiose a+b+ [arg+, N] association allélique parentale a+b1 [arg+, B] association allélique recombinée Méiose 1 co a1b+ [arg-, N] association allélique recombinée a1b1 [arg-, B] association allélique parentale a+b+ [arg+, N] association allélique parentale a+b+ [arg+, N] association allélique parentale Méiose 0 co a1b1 [arg-, B] association allélique parentale a1b1 [arg-, B] association allélique parentale III - Analyse des résultats – 3 – Localisation génétique – b – Brassage intrachromosomique – Résultats possibles d’une méiose 1 co 2 co 2 co 2P 2R 3 crossing-overs 4 crossing-overs 5 crossing-overs 4R 4P Quels types de spores va-t-on obtenir lors de méioses à multiples crossing-overs ? III - Analyse des résultats – 3 – Localisation génétique – b – Brassage intrachromosomique – Résultats possibles d’une méiose 1-3 2P + 2R 1-4 4R 12 34 2-3 4P 2-4 2P + 2R III - Analyse des résultats – 3 – Localisation génétique – b – Brassage intrachromosomique – Résultats possibles d’une méiose +1 CO 2P / 2R 12 34 Méiose ayant déjà eu 2 CO +1 CO De façon équiprobable : 2P/2R, 4R, 4P 12 34 +1 CO 2P / 2R 12 34 III - Analyse des résultats – 3 – Localisation génétique – b – Brassage intrachromosomique – Résultats d’un grand nombre de méioses n méioses à 0 crossing over : 4P (4 x n) spores P m méioses à 1 crossing-over : 2P / 2R (2 x m) spores P et (2 x m) spores R o méioses à >1 crossing over : 4P : 2P / 2R (2 x o) spores P et (2 x o) spores R : 4R Sur n+m+o méioses, on va produire : (4n+2m+2o) gamètes P (2m + 2o) gamètes R III - Analyse des résultats – 3 – Localisation génétique – b – Brassage intrachromosomique – Résultats d’un grand nombre de méioses Sur n+m+o méioses, on va produire : (4n+2m+2o) gamètes P (2m + 2o) gamètes R n=0 ; m=0 ; o=1000 P≈R≈2000 n=0 ; m=50 ; o=950 P≈R≈2000 n=0 ; m=100 ; o=900 P≈R≈2000 n=100 ; m=200 ; o=700 P≈2200 R≈1800 n=400 ; m=600 ; o=0 P=2800 R=1200 n=1000 ; m=0 ; o=0 P=4000 R=0 III - Analyse des résultats – 3 – Localisation génétique – b – Brassage intrachromosomique – Résultats d’un grand nombre de méioses a+ a1 a+ a1 b+ b1 b1 b+ ≈1000 ≈1000 ≈1000 ≈1000 a+ a1 a+ a1 b+ b1 b1 b+ >1000 >1000 1000 2500 P a1b1[arg-, B] : 2500 P a1b1[arg-, B] : ? mais > 2500 a+b1 [arg+, B] : 2500 a+b1 [arg+, B] : ? mais < 2500 R a1b+[arg-, N] : 2500 R a1b+[arg-, N] : ? mais < 2500 Observation de 214 spores = tirage aléatoire de 214 spores parmi des milliers a+b+ [arg+, N] : 96 P a1b1[arg-, B] : 91 a+b1 [arg+, B] : 12 R a1b+[arg-, N] : 15 Hypothèse d’indépendance rejetée donc les deux sites sont liés génétiquement III - Analyse des résultats – 3 – Localisation génétique – d – résolution d’un problème - haploïdes Résultats expérimentaux Production des spores sur 214 spores a+b+ [arg+, N] : 96 a+b+ [arg+, N] : 43,7% P a1b1[arg-, B] : 91 P a1b1[arg-, B] : 43,7% a+b1 [arg+, B] : 12 a+b1 [arg+, B] : 6,3% R a1b+[arg-, N] : 15 R a1b+[arg-, N] : 6,3% La fréquence de recombinaison observée sur Fréquence de recombinaison observée 214 spores est une estimation Frec A-B observée = 27/214 = 0,126 de la fréquence de recombinaison réelle III - Analyse des résultats – 3 – Localisation génétique – d – résolution d’un problème - haploïdes n rec 27 Frec A-B = = = 0,126 N Total 214 Hypothèse d’indépendance rejetée P>R ou FrecA-B a 2 F1 : [L, N] a 2 b2 b1 > b 2 N2 : F1 [L, N] x P2 [C, B] F2 (autofécondation) [L, N] 156 [L, N] 659 [L, B] 38 [L, B] 91 [C, N] 42 [C, N] 87 [C, B] 164 [C, B] 163 III - Analyse des résultats – 3 – Localisation génétique – d – résolution d’un problème – diploïdes – test cross a 1 b1 a 2 b2 F1 [L, N] x P2 [C, B] a 2 b2 a 2 b2 Associations alléliques Associations alléliques parentales recombinées F1 a1b1 a2b2 a1b2 a2b1 P1 (1-r)/2 (1-r)/2 r/2 r/2 a 1 b1 a 2 b2 a1 b 2 a 2 b1 a 2 b2 a 2 b2 a 2 b2 a 2 b2 [L, N] [C, B] [L, B] [C, N] 156 164 38 42  r r= nR 80 nR =  2    nT r= = 0,2  2 nT 400 III - Analyse des résultats – 3 – Localisation génétique – d – résolution d’un problème – diploïdes – test cross Question posée : peut-on considérer que les deux sites sont indépendants génétiquement ?  urnes de gamètes contient 25% a1b1, 25% a2b2, 25% a1b2 et 25% a2b1 F1 a1b1 a2b2 a1b2 a2b1 P1 (1-r)/2 (1-r)/2 r/2 r/2 a 1 b1 a 2 b2 a1 b 2 a 2 b1 a 2 b2 a 2 b2 a 2 b2 a 2 b2 [L, N] [C, B] [L, B] [C, N] 156 / 100 164 / 100 38 / 100 42 / 100 r = 0,2 / r = 0,5 III - Analyse des résultats – 3 – Localisation génétique – d – résolution d’un problème – diploïdes – test cross F1 Frec-A-B = 80/400 = 0,2 Hypothèse d’indépendance rejetée P>R ou FrecA-B a 2 F1 : [L, N] a 2 b2 b1 > b 2 N2 : F1 [L, N] x P2 [C, B] F2 (autofécondation) [L, N] 156 [L, N] 659 [L, B] 38 [L, B] 91 [C, N] 42 [C, N] 87 [C, B] 164 [C, B] 163 III - Analyse des résultats – 3 – Localisation génétique – d – résolution d’un problème – diploïdes – intercross Association allélique Association allélique parentale recombinée F1 a1b1 a2b2 a1b2 a2b1 F1 (1-r)/2 (1-r)/2 r/2 r/2 a 1 b1 [L, N] a 2 b 2 [L, N] a 1 b 2 [L, N] a 2 b1 [L, N] a1b1 Association allélique a 1 b1 2 1 a b 1 2 1 a b 1 1 a b 1 1− r  1− r  1− r r 1− r r (1-r)/2       parentale  2   2  2 2 2 2 a 1 b1 [L, N] a 2 b 2 [C,B] a 1 b 2 [L, B] a 2 b1 [C, N] a2b2 a 2 b2 2 a 2 b2 2 a 2 b2 a 2 b2 1− r 1− r  1− r  1− r r r (1-r)/2   2     2   2  2 2  2 a 1 b1 [L, N] a 2 b 2 [L, B] a 1 b 2 [L, B] a 2 b1 [L, N] a1b2 Association allélique a1 b 2 a1 b 2 a1 b 2 2 a1 b 2 2 1− r r 1− r r r r recombinée r/2 2  2 2  2   2   2 a 1 b1 [L, N] a 2 b 2 [C, N] a 1 b 2 [L, N] a 2 b1 [C, N] a2b1 a 2 b1 1 − r r a 2 b1 a 2 b1 2 a 2 b1 2 1− r r r r r/2 2  2 2  2   2   2 III - Analyse des résultats – 3 – Localisation génétique – d – résolution d’un problème – diploïdes – intercross Question posée : peut-on considérer que les deux sites sont indépendants génétiquement ? Hypothèse d’indépendance Résultat expérimental urne de gamètes Tirage attendu [L, N] 9/16 562,5 659 [L, B] 3/16 187,5 91 [C, N] 3/16 187,5 87 [C, B] 1/16 62,5 163 → hypothèse d’indépendance rejetée donc les deux sites sont liés génétiquement 113 III - Analyse des résultats – 3 – Localisation génétique – d – résolution d’un problème – diploïdes – intercross 659 1000 163 1000 91 1000 87 1000 1 ± 2x0,4 rA-B = 0,2 III - Analyse des résultats – 3 – Localisation génétique 115