Cours de Cytogénétique GUELMIM PDF

Cours de Cytogénétique conventionnelle Pr Nadia SERBATI Médecin généticien Professeur de Génétique Médicale Cours pour 1ère Année Médecine FMPG  Objectifs du cours Donner la définition du caryotype métaphasique Citer les différ...

Cours de Cytogénétique conventionnelle Pr Nadia SERBATI Médecin généticien Professeur de Génétique Médicale Cours pour 1ère Année Médecine FMPG  Objectifs du cours Donner la définition du caryotype métaphasique Citer les différentes étapes d’obtention de métaphases Citer les indications du caryotype métaphasique en post-natal Citer les indications du caryotype métaphasique en anté-natal. Connaitre la structure du chromosome métaphasique Connaitre les critères de classement des chromosomes.  Introduction Les organismes vivants : Unicellulaires (bactéries, virus et levures) ou Multicellulaires (Homme) Classés en fonction de la structure des cellules qui les composent : les procaryotes: cellules de petite taille 1-10 µm, ne possèdent pas de noyau et sont faites d’un seul compartiment cellulaire. Une membrane plasmique marque les limites de la cellule. Les cellules eucaryotes: plus volumineuses 10-100 µm, ont un noyau séparé du cytoplasme par une enveloppe nucléaire. Les cellules procaryotes et eucaryotes possèdent le même matériel génétique: les acides nucléiques. Organisation du matériel génétique chez l’Homme Dans le noyau, l’ADN s’associe à des protéines (Histones et non Histones), et subit un haut degré de condensation pour qu’elle puisse s’y tenir. La chromatine est la substance nucléaire qui fixe les colorants basiques. Dans le noyau interphasique, elle se présente comme un mélange de fibres irrégulières dont le diamètre est variable en fonction du degré d’empilement. Euchromatine: Forme déreoulée Hétérochromatine: Forme condensée Transcription (+) Transcription( -) La cytogénétique est la science qui étudie les chromosomes et leurs anomalies. Elle est basée sur l’observation et l’analyse des chromosomes des cellules en mitoses. Le cycle cellulaire Degrés de condensation filament d’ADN chromosome métaphasique  Outils de diagnostic génétique du chromosome à l’ADN  LE CARYOYPE METAPHASIQUE 1955: Premier caryotype au monde 1959: découverte de la première aberration chromosomique (trisomie 21 ou syndrome de Down C’est l’ensemble des chromosomes classés d’un individu. Le stock chromosomique est caractéristique de l’espèce, il est composé d’un ensemble de N chromosomes tous différents qui constitue le lot de base du caryotype ou lot haploïde. Chez l’Homme, le stock de chromosomes complet = deux lots haploïdes. Le nombre Haploïde étant N = 23.  Caryotype Le caryotype = processus d'appariement et de mise en ordre de tous les chromosomes d'un organisme offrant ainsi un large aperçu du génome et révélant les caractéristiques structurales de chaque chromosome. Source d'informations pour le diagnostic des anomalies congénitales, des troubles génétiques, et même des cancers.  LE CARYOYPE METAPHASIQUE Principe et technique du caryotype métaphasique : Le caryotype est la représentation obtenue par microphotographie de l’aspect morphologique de l’ensemble des chromosomes d’une cellule en métaphase. Cette technique de microscopie optique permet l’observation à un instant du cycle cellulaire du matériel héréditaire humain sans pour autant en analyser le contenu, c’est-à-dire les gènes. Obtenir des cellules en Obtenir des métaphases division : analysables culture cellulaire  LE CARYOYPE METAPHASIQUE Principe et technique du caryotype métaphasique : Les types d’échantillons - Les lymphocytes sanguins (cellules les plus utilisés) : Le sang total, recueilli stérilement sur héparine et incubé 48 à 72 heures dans un milieu de culture contenant une lectine à fort pouvoir mitogène (Phytohémaglutunine ou PHA) - Les fibroblastes obtenus après biopsies cutanées le plus souvent, la croissance cellulaire demande 1 à 3 semaines. - Les cellules amniotiques. - Les cellules du trophoblaste. - Les cellules de moelle et de tissu tumoral.  LE CARYOYPE METAPHASIQUE Principe et technique du caryotype métaphasique : Obtenir des cellules en division : Culture cellulaire Les lymphocytes sanguins (cellules les plus utilisés) : Le sang total, recueilli stérilement sur héparine et incubé 48 à 72 heures dans un milieu de culture contenant une lectine à fort pouvoir mitogène (Phytohémaglutunine ou PHA) Sang total, Incubé 72 recueilli heures dans un Le sang total, recueilli stérilement sur milieu de stérilement héparine culture + PHA)  LE CARYOYPE METAPHASIQUE Principe et technique du caryotype métaphasique : Obtenir des cellules en division : Culture cellulaire Les fibroblastes obtenus après biopsies cutanées le plus souvent, la croissance cellulaire demande 1 à 3 semaines.  LE CARYOYPE METAPHASIQUE Principe et technique du caryotype métaphasique : Obtenir des cellules en division : Culture cellulaire 12 – 14 SA 14 – 17 SA Les cellules du trophoblaste. Les cellules amniotiques  LE CARYOYPE METAPHASIQUE Principe et technique du caryotype métaphasique : Obtenir des cellules en division : Culture cellulaire Les cellules de moelle osseuses  II. Techniques du caryotype humain métaphasique A- Principaux tissus étudiés en cytogénétique humaine Caryotype postnatal: ( lymphocytes T, fibroblastes). Caryotype prénatal : (villosités choriales, amniotique, sang liquide du cordon fœtal). Caryotype hématologique : (moelle osseuse, blastes). Caryotype tumoral : (tissu tumoral, ganglions, épanchement liquidien). 21  LE CARYOYPE METAPHASIQUE Principe et technique du caryotype métaphasique : Obtenir des cellules en division : Culture -Les lymphocytes sanguins cellulaire (cellules les plus utilisés) : incubé 48 à 72 heures dans un milieu de culture contenant une lectine à fort pouvoir mitogène (Phytohémaglutunine ou PHA) -Les fibroblastes et les amniocytes ou trophoblaste obtenus après biopsies cutanées, amniocentèse ou biopsie du trophoblaste, la croissance cellulaire demande quelques jours à plusiers semaines. -Impératifs de la culture: -Cellules vivantes: prélèvement acheminé rapidement au laboratoire; cellules non fixées non congelées; - Absence de contamination bactérienne ou fongique: Milieu de culture stérile pour éviter toute contamination qui pourrait empêcher la culture et faire échouer le caryotype B- Obtention des métaphases analysables : 1. Culture cellulaire (Lymphocytes T +++): Le sang recueilli stérilement sur héparine et incubé 48 à 72 h dans un milieu de culture contenant une lectine à fort pouvoir mitogène (phytohémaglutinine PHA). 2. Blocage en métaphase par la colchicine : La colchicine bloque l’appareil fusorial par blocage de la polymérisation de la tubuline. 3. Choc hypotonique : Dispersion des chromosomes suite à l’éclatement de la membrane nucléaire. 4. Fixation des préparations chromosomiques (mélange méthanol/ Acide acétique) 5. Étalement sur lames 23  LE CARYOYPE METAPHASIQUE Principe et technique du caryotype métaphasique: Obtenir des métaphases analysables - Blocage des divisions cellulaires en mitoses : par blocage de l’appareil fusorial (colchicine: poison bloque le fuseau mitotique). - Choc hypotonique : la dispersion chromosomique se fait grâce à l’action d’une solution hypotonique. - Fixation des préparations chromosomiques (mélange méthanol/acide acétique). - Etalement sur lames - Coloration par Giemsa - Lecture au microscope - Analyse du caryotype grâce à des logiciels Obtenir des métaphases analysables  LE CARYOYPE METAPHASIQUE Identifier les chromosomes La morphologie simple : La coloration au Giemsa aboutit à une coloration homogène des chromosomes, et permet de classer les chromosomes en fonction de leur taille, et de leur indice centromérique. Chaque chromosome est constitué de deux chromatides soeurs réunies par un centromère (ou constriction primaire) dont la position permet de définir les bras courts ou p et les bras longs ou q. Les extrémités distales des chromosomes sont les télomères.  Centromère Zone de constriction se traduisant par un raccourcissement de l'épaisseur de la chromatine. Cette région est appelée centromère. Au niveau du centromère, chaque chromatide porte un kinétochore : qui est le centre d'organisation des microtubules responsables de la fixation des chromosomes au fuseau de division, lors de la mitose ou de la méiose. Rôle fondamental dans l'alignement correct des chromosomes en métaphase et à la ségrégation correcte des chromosomes dans les cellules filles au cours de l'anaphase. Une perte de centromère aboutit à une instabilité chromosomique.  Télomères Les télomères sont des structures spécialisées situées aux extrémités terminales des chromosomes. Elles sont indispensables pour préserver l'intégrité du matériel génétique au cours des divisions cellulaires. Leur rôle est multiple tel que : La prévention d'une recombinaison chromosomique aberrante La ségrégation des chromosomes durant la mitose et la méiose; L’'attachement des chromosomes à la matrice nucléaire.  Télomères Rôle anti vieillissement Anti dégradation par l’exonucléase  DESCRIPTION DU CARYOTYPE HUMAIN (LE CARYOTYPE NORMAL) Critères de classement des chromosomes : Les chromosomes humains sont classés en en fonction de leur taille et de la position du centromère qui définit l’indice centromérique : p/(p+q). selon la taille: Les chromosomes d’une même cellule présentent des tailles différentes. Chez les humains, on distingue 8 groupes : le plus grand chromosome mesure environs 8 μm, le plus petit environ 1μm. Selon l’indice centromérique L’indice centromérique permet de classer les chromosomes en : La position du centromère défini l'indice centrométrique, calculé comme suit: Ic = p / (p+q). Métacentriques (p = ou ≈ q) Submétacentriques (p