Chapitre 3 : Bacilles Gram - ; Entérobactéries PDF

Camille MOUCHART 2024 CHAPITRE 3 : BACILLES GRAM - ; ENTEROBACTÉRIES 1. GÉNÉRALITÉS Famille : Enterobacteriaceae Réservoirs : ubiquitaires 1 (voire strictement intestinales par exemple le Shigella qui e...

Camille MOUCHART 2024 CHAPITRE 3 : BACILLES GRAM - ; ENTEROBACTÉRIES 1. GÉNÉRALITÉS Famille : Enterobacteriaceae Réservoirs : ubiquitaires 1 (voire strictement intestinales par exemple le Shigella qui est strictement pathogène dans les intestin de l’Homme) Certaine sont phytopathogène c.à.d. pathogène pour la plante. CARACTÈRES MORPHOLOGIQUES ET BIOCHIMIQUES - BG-, isolés (attention que quand-on voit des bacilles G-, ce ne sont pas forcément des Entérobactéries) - Résistant au sels biliaires (pousse donc sur GMC/XLD/CIN) - Fermente le glucose (source d’énergie (ATP)) - Oxydase négative - Aéro-anaérobie Les sels biliaire sont synthétiser par le foie et stocker dans la vésicule biliaire qui les déverseras lors de la digestion dans l’intestin. On retrouve donc la bile dans nos intestins où il y aussi des MO. Ses MO sont donc résistent à la bile. Rien de mieux que pour mettre en évidence que ses batteries, de mettre des sels biliaire dans la culture. 1 On les retrouve partout y compris dans les intestins 1 Camille MOUCHART 2024 GÉLOSE MAC CONKEY Fonction : Mise en évidence de BG- « intestinaux » fermentant ou pas le lactose Éléments du milieu Fonction Peptone Nutritif Sel biliaires Inhibiteur (anti non-intestinaux) Cristal violet Inhibiteur (anti G+) Lactose (b-galactosidase) Nutritif (fermentation) Rouge neutre Indicateur Chlorure de sodium (NaCl) Élément osmotique Agar Gélifiant Lecture : Croissance de BG- et intestinales G + et non intestinales à inhibées On empêche les bactéries ne résistant pas au sels biliaire et les Gram + de pousser. Il est donc inutile de faire une coloration de Gram. Si elle pousse sur Gélose Mac Conkey elle est donc Gram -. Il y a une bactéries qui est BG - et qui résiste au sel biliaire mais qui n’est pas dutout une bactéries intestinal et qui n’est pas une Enterobactéries, c’est la Pseudomonas. BG- « intestinales » lactose + à acidification du milieu à colonies fuchsia (+ halo de précipitation) à entérobactérie (coliforme) Pour voir si la bactérie possède du b-galactosidase et qui sais dès lors fermenter le lactose en acide lactique, on ajoute un indicateur de pH. Il deviendra alors rose fuchsia si le milieu devient acides. Alors si le pH ne diminue qu’un peu elle seras jaune. BG- « intestinales » lactose - à pas d'acidification (milieu neutre) à colonies incolores Lactose - à entérobactérie ou pas à rechercher oxydase On sait donc que la bactéries qui pigmente le milieu en jaune nous sais qu’elle est BG - mais pas spécialement si elle est incapable de fermenter. En tous cas on sait qu’elle ne sait pas fermenter le lactose. Une bactéries capable de fermenter un sucre complexe sais d’office fermenter du GLUCOSE. Cela veut dire qu’une bactérie capable de fermenter un polysaccharide sais d’office fermenter le glucose mais pas spécialement le lactose si elle ne possède pas l’enzyme b-galactosidase. CYTOCHROME OXYDASE Le cytochrome oxydase est une enzyme respiratoire. C’est le dernier accepteur d’électrons de la chaîne respiratoire chez les aérobies strictes (O2). Il n’y a donc que les bactéries aérobie strictes qui ont la cytochrome C oxydase. Ses dernier sont alors des non fermentants (ex. Pseudomonas) et donc absente chez les entérobactéries (fermentants). C’est pas la même enzyme qui permet la respiration aérobie chez l’entérobactéries. Ils en ont une autres pour ça mais pas la Cytochrome C oxydase. On peut donc distinguer les différents lactose – en entérobactéries ou Pseudomonas. Le cytochrome oxydase est donc un caractère distinctif. 2 Camille MOUCHART 2024 MODE OPÉRATOIR Sur colonie isolée de BG-, résistante aux sels biliaires et sucre - (lactose p.ex.) 1. Sur un papier filtre, déposer un disque de substrat (DMPD = Diméthyl-paraphénylène Diamine), avec une pince en plastique. 2. Déposer 2 à 3 gouttes d’eau de ville sur le disque à diffusion du réactif. 3. Avec une öse en plastique, prélever une colonie isolée de BG-/L-. 4. Faire une strie perpendiculaire au disque 5. Si apparition d’une trace bleue/violette à oxydase + à Pseudomonas 2. LES ESPÈCES ENTÉROPATHOGÈNES PRÉAMBULE : INFECTION INTESTINALE Après passage par la bouche (antiseptique), estomac (pH ~ 2) et intestins (bile) : Adhésion Enchâssement Invasion et multiplication dans la muqueuse Traversée de la muqueuse + multiplication dans les ganglions Bactériémie / Septicémie SALMONELLA SP. Genre : Salmonella (responsable d’infection intestinal) Espèces : Salmonella bongori Salmonella enterica 6 sous-espèces : Salmonella enterica arisonae, Salmonella enterica diarizonae, Salmonella enterica houtenae, Salmonella enterica indica, Salmonella enterica salamae et Salmonella enterica enterica. o Salmonella enterica enterica (S. e. e. X) (c’est chez elle qu’on retrouve les pathogène) Plein de sérovars 2(Ag O, H et K) pathongènes : § Salmonella enterica enterica Paratyphi § Salmonella enterica enterica Typhi § Salmonella enterica enterica Typhimurium § Salmonella enterica enterica Enteritidis Ses dernier sont classer sur leurs bagage antigénique. C.à.d. sur leurs antigènes3. C’est celle qui vont entrainer la pathogénie. Ce type d’antigène ne va pas induire des distinction de gravité de la pathologie pour les sérotypes différent. 2 Le terme sérovars est équivalent à « la variété ». 3 Un antigène est substance produite par le pathogène, il ne fait pas partie de soi (du patient). Il n’a rien à faire dans le corps ce qui engendre la production d’anticorps. 3 Camille MOUCHART 2024 Ils sont constitués de : Antigène H (flagelline) Antigène O (somatique) Antigène K (capsule) Polysaccharide Ses constituant pleuvant varié selon les différents sérovars (sérotypage (à voir plus loin)). Par exemple un S. e. enterica peut avoir K 3, O 121 et H 4. Ceci nous permet de réalisé qu’il y a des centaine de sérotype différents. S. e. e Typhimurium et S. e. e Enteritidis sont des salmonellose qui sont des zoonose 4car elle peut être transmit d’animal en animal et donc à l’humain. (L’épidémiologie est une science qui a pour objectif général la connaissance des problèmes de santé dans les populations et de leurs déterminants.) Pour pouvoir prouver que la Salmonella qui a été attraper en mangeant un aliment vienne bien de ce dernier, on compare le sérovar dont la personne est atteint et bien le même que celui de l’aliment. Par exemple la Salmonelle attraper par les Kinder il y a quelque années étais le même samovars qu’on a pu retrouver dans les œufs utiliser pour le Kinder. Si on est atteint par ses S. e. e. Paratyphi ou S. e. e.Typhi, c’est qu’on les a avalé d’une manier ou d’une autres des selles humain car ce sont des sérovars strictement humain. Cella pourrais être due à une mauvaise gestion des eau (arroser nos légume avec une eau mal filtré). C’est salmonellose ne sont donc pas des zoonose car strictement humaine. Attention à l’écriture des sérovars : Écris avec une majuscule et plus en étatique (ou souligné à l’écris). Pathologie du S. enterica : gastro-entérite, entérocolite, septicémie Réservoir : intestinal (pathogène voire porteurs sains) C’est la quelles ce sentent bien et c’est là qu’elles se multiplient. Elle est strictement intestinal mais on peut la retrouver dans l’environnement mais c’est pas la quelle ce multiplieras à l’exception d’un phénomènes de biofilm (à voir plus tard). Il existe des animaux porteur sain de Salmonella (par exemple certain reptiles). C.à.d. qu’ils sont porteur mais n’ont pas de réaction/symptômes. Pour nous n’importe quelle Salmonella est pathogène. On doit donc faire attention quand on rentre en contact avec les animaux porteur sain de Salmonella ou leurs restes (selles etc.). On ne peut donc pas balancer n’importe quelle effluent d’élevage dans les champs comme engrais à nos légumes. En d’autres mots, comme elles sont intestinal, les bactéries peuvent terminer dans les selles des animaux porteur de Salmonella. La Salmonella qui est infectieuse pour nous et une zoonose peut ensuite nous atteindre si on rentre en contacts avec ses selles. Chez les volailles on rencontre souvent des Salmonella. Leurs viandes et leurs œufs peuvent être atteint. C’est pour ça que la volaille dois bien être cuit. On considère que l’œuf est stérile mais lors de ca fabrication au sein de la poule, une bactérie pourrais s’y glisser. On doit donc faire attention quand on mange ses aliment crue comme par exemple dans de la mayonnaise, et ce qu’on donne à nos animaux destiné notre consommation. 4 (Une zoonose est une maladie infectieuse qui est passée de l'animal à l'homme.) 4 Camille MOUCHART 2024 Comme on la dis un peu plus haut, la Salmonella peut survivre via un biofilm dans l’environnement. Elle peut donc aussi se retrouver dans l’environnement (refluer part les excréments) mais elle ne s’y multiplie pas, sauf sous l’aspect de biofilm. Quand les bactéries ce retrouvant dans l’environnement elles sont capable de capter des molécules qui vont se gorger d’eau et ainsi, les bactéries, pourrais peut-être avoir accès à des substance organique qui leurs permettais de ce multiplier, des nutriments. Ce qui est important de comprendre est qu’ils leurs faut obligatoirement des sources énergétique, des nutriments, pour qu’elle puisse faire des multiplication Transmission : oro-fécale (+ poils, poussières, etc.) ; la Salmonella est invasive. Invasion des cellules épithéliales (I) Invasion mésentérique possible (G) Bactériémie (S) à vésicule biliaire possible En bactériémie, elle passe une fois dans la circulation sanguine puis elle est éliminé tandis que septicémie elle reste. On auras dès lors besoin antibiotique. Caractères morphologiques et biochimiques : La Salmonella sp. est une l’entérobactérie est donc elle est : Lactose - à non coliforme Saccharose – Xylose + LDC + H2S + XLD (XYLOSE – LYSINE – DÉSOXYCHOLATE) Origine de prélèvement : selles (SEULEMENT coproculture) Éléments du milieu Fonction Extrait de levure Nutritif Désoxycholate de Sodium (Na) Inhibiteur Chlorure de sodium (NaCl) Élément osmotique Xylose (3,5 g/L) Nutritif (fermentation) Lactose (7,5 g/L) Nutritif (fermentation) Saccharose (7,5 g/L) Nutritif (fermentation) Rouge de phénol Indicateur (mise en évidence de fermentation) Lysine (LDC = lysine décarboxylase) Nutritif (protéine) Thiosulfate de sodium (Na) Nutritif Citrate de fer Indicateur (production d’H2S) Agar Gélifiant 5 Camille MOUCHART 2024 Lecture : Si croissance à BG- ‘intestinal’ Les bactéries qui ne fermente rien poussant aussi car Si au moins un sucre est fermenter (+) à productions d’acides = ↓pH à colonies jaunes (+ précipité jaune) Si aucun sucre fermenté (-) colonies incolores Si LDC + à productions de ‘bases’= ↑ pH Si il y à décarboxylation de lysine, il reste de l’amine (-NH2) dans le milieu et libération de CO2 ce qui rende le milieu plus basique (­pH). o Attention que si la Xylose est + et LDC est + à les acides et les bases s’annulent mutuellement à colonies incolores o Si lactose et/ou saccharose + à colonies jaunes Car elles sont présentes en grande quantité (7,5 g/L) Si H2S est + à réaction avec le citrate de Fe à centre des colonies deveint noir A) IDENTIFICATION SI SELLE Une coproculture consiste à analyser les selles à la recherche de bactéries pathogènes ou d'une prolifération anormale de bactéries et donc à l’ensemencement de selles. 1. Isolement sur XLD 2. Incubation à colonies incolores à centre noir 3. Galerie Api 20E 4. Sérotypage (Sciensano) Une selles nous donnera toujours des colonies jaunes car ce sont toutes des bactéries intestinales mais si on trouve des colonies a centre noire on doit s’y intéresser. Les bactéries noires sont clairement capable de vivre en anaérobiose car elle produit de l’H2S, donc elle est capable de fermenter. Attention qu’il n’y donc pas d’intérêt de tester l’oxydase sur celle-ci. Ni sur celles qui ont rendu le milieu jaune car là c’est aussi claire quelle fermente des sucres car elle rendent le milieu acide. Si ma bactéries étais pas noir et ne produis donc pas de’H2S ni rend le milieu jaune alors on ne sait pas. On demande alors de faire l’oxydase. GALERIE API 20E Pour l’utiliser une Galerie API 20E, il faut savoir qu’on est face à une entérobactéries ( BG -) résistant au sels biliaire, fermentant et étant oxydase -. Dans « Galerie API 20E », le 20 représente les 20 positions sur une languette et le E pour entérobactéries. Cette galerie est équivalent à une vingtaine de boites de Petri avec plusieurs substrats pour plusieurs enzymes. 6 Camille MOUCHART 2024 SÉROTYPAGE Le sérotypage est la caractérisation des souches (des sérovars vue présédament par exemple) via leurs antigènes. O : LPS (somatique) H : flagelles K : capsule C’est environ le même système que le typage pour les Streptococcus b hémolytique. On a des flacon contenant des billes de latex correspondant avec un type d’antigène avec le quelle elle s’auto-agglutine (Ag). C’est donc « par essais - erreurs ». Mode opératoire : 1. Utilisation de billes de latex recouvertes d’anticorps connus 2. Mélange avec la souche à tester (antigènes inconnus) 3. Positif si agglutination B) IDENTIFICATION SI SANG 1. Isolement sur Mac Conkey 2. Incubation à colonies incolores 3. Recherche de l’oxydase à - Ici nous avons pas le choix de voir l’oxydase car on n’a aucun signe de si elle ferment. 4. Galerie Api 20E 5. Sérotypage (Sciensano) 7 Camille MOUCHART 2024 ESCHERICHIA COLI Genre : Escherichia Espèces : Escherichia coli Caractères morphologiques et biochimiques : BG –, isolés Glucose + Saccharose - Entérobactérie Oxydase – Aéro-anaérobies H2S - Lactose + (GMC / XLD) Pathologie : colibacilloses pré- et post-sevrage, entérites, septicémie Réservoir (et pathologie) : Ils ne font pas partie de la flore normale intestinale à pathogène/porteurs sains ! Sérotype différents qu’on regroupe ensemble sur base des symptômes quelles provoques : EPEC (Enteropathogène Escherichia coli) (O199 : H2,...) à jeunes animaux Adhésion + lésions/entérocytes ETEC (Enterotoxique Escherichia coli) à nouveaux-nés (à jeunes animaux) STRESS DU SEVRAGE Adhésion + entérotoxine (synthétise des toxines) NTEC (Nécrotoxique Escherichia coli) à jeunes et adultes Adhésion + cytotoxine (destruction des cellules) EHEC (Entérohémoragique Escherichia coli) (O138 : K82,...) à jeunes animaux Adhésion + vérotoxine (toxémie) à diarrhée hémorragiques (très virulent) Transmission : oro-fécale (+ poils, poussières, etc.) A) IDENTIFICATION SI SELLE Attention au context à si il n’y a pas de symptômes et pas d'autres pathogènes "clasiques". 1. Isolement sur XLD 2. Incubation à colonies jaune (+ milieu jaune) (car fermentante) 3. Galerie Api 20E à Escherichia coli 4. Sérotypage (Sciensano) B) IDENTIFICATION SI SANG 1. Isolement sur Mac Conkey 2. Incubation à colonies fushia (+ halo fushia posible) à lactose + 3. Galerie Api 20E 4. Sérotypage (Sciensano) 8 Camille MOUCHART 2024 YERSINIA SP. Famille : Yersiniaceae Genre : Yersinia Espèces et pathogène: Invasive ou toxinogène Yersinia enterocolitica à entérite (portage) o Porc et sanglier à asymptomatiques (amygdales à matières fécales) o Ovins/bovins/caprins à symptomatiques possibles o Chat/chien à plus rare Yersinia pseudotuberculosis à gastro-enterite, entericolite, septicémie o Oiseaux, rongeurs, faune sauvage à asymptomatiques ou malades Reservoire : Relativement ubiquitaire mais principallement (porc, sanglier à suidés). Il ne font pas partie de la flore normale intestinale. Ils sont pathogènes ! Transmission : oro-fécale (+ poils, poussières, etc.) Caractères morphologiques et biochimiques : BG –, isolés Glucose + Oxydase – Entérobactérie Aéro-anaérobies H2S - Lactose - à non coliforme Manitole + (CIN) Croissance à 29°C CIN (CEFSULODINE - IRGASAN – NOVOBIOCINE) Éléments du milieu Fonction Extrait de levure Nutritif Peptone Nutritif Pyruvates de Sodium (Na) Protecteur et stimulateur pour Yersinia Chlorure de sodium (NaCl) Élément osmotique (osmorégulateur) Mannitol Nutritif (fermentation) Rouge neutre Indicateur (mise en évidence de fermentation) Cristal violet Inhibiteur (de Gram +) Désoxycholate de Sodium (Na) Inhibiteur (de non intestinaux) Cefsulodin-Irgasan-Novobiocine Inhibiteur (antibiotique) Agar Gélifiant Lecture : Si croissance à BG-, résistant au désoxycholate de Sodium et aux antibiotiques Si mannitol + à acidification du milieu à petites colonies à centre rose fuchsia Yersinia enterocolitica à + halo pâle (œil de bœuf) 9 Camille MOUCHART 2024 A) IDENTIFICATION SI SELLE 1. Isolement sur CIN 2. Incubation à 29°C/48h/aéro à colonie à centre rose et bords translucides 3. Galerie Api 20E (37°C) LAC + H2S - MAN + SAC + B) IDENTIFICATION SI SANG 1. Isolement sur Mac Conkey 2. Incubation 37°C/24h/aéro à colonie incolore (lactose -) 3. Oxydase à - 4. Galerie Api 20E 3. LES ESPÈCES NON-ENTÉROPATHOGÈNES ESCHERICHIA COLI Genre : Escherichia Espèces : Escherichia coli Pathologies : infections urinaires (N°1), mammites ascendantes, pyodermites5,... Réservoirs : Flore normale intestinale 106 à 107 UFC/g Caractères morphologiques et biochimiques : BG –, isolés Glucose + Saccharose - Entérobactérie Oxydase – Aéro-anaérobies H2S - Lactose + (GMC et milieu ChromID CPS Elite) Bêta-glucuronidase + (cf. milieu ChromID) 5 La pyodermites est l’infection de la peau avec du pu 10 Camille MOUCHART 2024 MILIEU CHROMID CPS ELITE C’est une milieu : Polyvalent Différentiel à chromogène (colonies vont générer une couleur propre à eux) Le milieu possède plusieurs substrats enzymatiques chromogènes incolores pour mettre en évidence une enzyme. Si enzyme est « adaptée », il y a alors un clivage et une libération du groupement chromogène. On observera alors une couleur (de la colonie). Milieu polymicrobien à toutes les bactéries retrouvée dans une urines vont pousser Fonction et lecture : Mise en évidence de 4 caractéristiques biochimiques β-galactosidase + à colonies rose β-glucuronidase + à colonies bordeaux foncé Groupements chromogènes β-glucosidase + (~ esculinase) à colonies vert/bleu Tryptophane désaminase + à milieu brun orangé à Groupements non chromogènes Escherichia coli est β-galactosidase + et β-glucuronidase + à colonies bordeaux Les colonies peuvent aussi être transparentes si in n’y a pas les enzymes lui correspondant ou il y a plusieurs enzymes lui correspondant et donc les couleurs se mélanges. A) IDENTIFICATION SI SELLE 1. Ensemencement en sapin (à voir plus tard) sur milieu chromogène (ex. ChromID CPS Elite) 2. Incubation 37°C/24h/aéro à colonies rouges/bordeaux B) IDENTIFICATION SI AUTRES PRÉLÈVEMENTS (SAUF COPROCULTURE) 1. Isolement sur Mac Conkey 2. Incubation 37°C/24h/aéro. 3. Galerie Api 20E ou MALDI-TOF 11 Camille MOUCHART 2024 MALDI-TOF = MATRIX ASSISTED LASER DESORPTION IONIZATION - TIME OF FLIGHT MALDI-TOF est une technique rapide d’identification et ce fait à partir d’une colonie isolée et fraîche. 1. Analyte (colonie) associé à une matrice protectrice 2. Dépôt sur plaque appropriée 3. Ionisation des protéines bactériennes par rayon laser à émissions d'ions +/- lourds 4. Ions accélérés dans un champ électrique -> migration Vitesse de migration fonction de m/z (m = masse ; z = charge) à Temps de vol propre à chacun 5. Détection du passage des ions en fin de parcours par un spectromètre de masse à mesure du temps de vol à spectre spécifique 12 Camille MOUCHART 2024 KLEBSIELLA SP. Genre : Klebsiella Espèces et pathologies : Klebsiella pneumoniae à infections respiratoires (VRB), mammites, infections urinaires,... Klebsiella oxytoca à infections urinaires Réservoirs : Flore normale intestinale moins spécifique que l’Escherichia coli Caractères morphologiques et biochimiques : BG –, isolés Résistant au sel biliaire Entérobactérie Lactose + Oxydase – β-galactosidase + (GMC et milieu ChromID CPS Elite) à colonies rose β-glucosidase + (milieu ChromID CPS Elite) à colonies vert/bleu Urée + Indole - à Klebsiella pneumoniae Indole + (tryptophanase +) à Klebsiella oxytoca MILIEU CHROMID CPS ELITE C’est une milieu : Polyvalent Différentiel à chromogène (colonies vont générer une couleur propre à eux) Le milieu possède plusieurs substrats enzymatiques chromogènes incolores pour mettre en évidence une enzyme. Si enzyme est « adaptée », il y a alors un clivage et une libération du groupement chromogène. On observera alors une couleur (de la colonie). Milieu polymicrobien à toutes les bactéries retrouvée dans une urines vont pousser Fonction et lecture : Mise en évidence de 4 caractéristiques biochimiques β-galactosidase + à colonies rose β-glucuronidase + à colonies bordeaux foncé Groupements chromogènes β-glucosidase + (~ esculinase) à colonies vert/bleu Tryptophane désaminase + à milieu brun orangé à Groupements non chromogènes Klebsiella sp. est β-galactosidase + et β-gluconidase + à colonies bleu/gris 13 Camille MOUCHART 2024 A) IDENTIFICATION SI URINE 1. Isolement sur milieu chromogène (ex. ChromID CPS Elite) 2. Incubation 24h/37°C/aérobiose à colonies bleu/gris 3. Coloration de Gram à BG- isolés 4. Galerie Api 20E (Lac +, VP+, urée+, indole,...) LAC + Urée + Ajout de Kovac’s dans le milieu Aucun changement à indole - à tryptophanase - à Klebsiella pneumoniae Rose à indole + à tryptophanase + à Klebsiella oxytoca B) IDENTIFICATION SI AUTRES PRÉLÈVEMENTS 1. Isolement sur Mac Conkey 2. Incubation 37°C/24h/aéro. à colonie muqueux / gluant 4. Galerie Api 20E (Lac +, VP+, urée+, indole,...) ou MALDI-TOF Klebsiella pneumoniae Pas Klebsiella pneumoniae à muqueux, gluant ENTEROBACTER SP. Pathologies : Infections urinaires, mammites Réservoirs : Flore normale intestinale moins spécifique que l’Escherichia coli Caractères morphologiques et biochimiques : Entérobactérie LAC + (cf. gélose Mac Conkey et ChromID) Bêta-glucosidase + (cf. milieu ChromID) Urée - MILIEU CHROMID CPS ELITE C’est une milieu : Polyvalent Différentiel à chromogène (colonies vont générer une couleur propre à eux) Le milieu possède plusieurs substrats enzymatiques chromogènes incolores pour mettre en évidence une enzyme. Si enzyme est « adaptée », il y a alors un clivage et une libération du groupement chromogène. On observera alors une couleur (de la colonie). Milieu polymicrobien à toutes les bactéries retrouvée dans une urines vont pousser 14 Camille MOUCHART 2024 Fonction et lecture : Mise en évidence de 4 caractéristiques biochimiques β-galactosidase + à colonies rose β-glucuronidase + à colonies bordeaux foncé Groupements chromogènes β-glucosidase + (~ esculinase) à colonies vert/bleu Tryptophane désaminase + à milieu brun orangé à Groupements non chromogènes Enterobacter est β-galactosidase + et β-glucosidase à colonies bleu/gris Donc Enterobacter donne le même résultat que la Klebsiella sp. il faut donc faire une coloration de Gram pour éliminer le CG+ puis une galerie API 20 E. A) IDENTIFICATION SI URINE 1. Isolement sur milieu chromogène (ex. ChromID CPS Elite) 2. Incubation 24h/37°C/aérobiose à colonies bleu/gris 3. Coloration de Gram à BG- isolés 4. Galerie Api 20E (Lac +, VP+, urée+,...) LAC + Urée - VP+ B) IDENTIFICATION SI AUTRES PRÉLÈVEMENTS 1. Isolement sur Mac Conkey 5. Incubation 37°C/24h/aéro. à colonie ? 6. Galerie Api 20E (Lac +, VP+,...) ou MALDI-TOF 15 Camille MOUCHART 2024 PROTEUS SP. Espèces et pathologies : Proteus mirabilis et Proteus vulgaris à infections urinaires, mammites Réservoirs : Flore normale intestinale peu spécifique Caractères morphologiques et biochimiques : Entérobactérie Tryptophane désaminase + (Cf. ChromID) Indole - à Proteus vulgaris Indole + (tryptophanase +) à Proteus mirabilis MILIEU CHROMID CPS ELITE C’est une milieu : Polyvalent Différentiel à chromogène (colonies vont générer une couleur propre à eux) Le milieu possède plusieurs substrats enzymatiques chromogènes incolores pour mettre en évidence une enzyme. Si enzyme est « adaptée », il y a alors un clivage et une libération du groupement chromogène. On observera alors une couleur (de la colonie). Milieu polymicrobien à toutes les bactéries retrouvée dans une urines vont pousser Fonction et lecture : Mise en évidence de 4 caractéristiques biochimiques β-galactosidase + à colonies rose β-glucuronidase + à colonies bordeaux foncé Groupements chromogènes β-glucosidase + (~ esculinase) à colonies vert/bleu Tryptophane désaminase + à milieu brun orangé à Groupements non chromogènes Proteus sp. sont TDA à milieu brun orangé A) IDENTIFICATION SI URINE 1. Isolement sur milieu chromogène (ex. ChromID CPS Elite) 2. Incubation 24h/37°C/aérobiose à milieu brun orangé (TDA +) 3. Recherche de la tryptophanase (ajout de Kovac’s sur la colonie) Aucun changement à indole - à tryptophanase - à Proteus mirabilis Rose à indole + à tryptophanase + à Proteus vulgaris Question d’examen : combien de temps faut-il pour determiner le Proteus sp. dans un échantillon urine ? 24h 16 Camille MOUCHART 2024 B) IDENTIFICATION SI AUTRES PRÉLÈVEMENTS 1. Isolement sur Mac Conkey 2. Incubation 37°C/24h/aéro. à colonie incolore à LAC – 3. Oxydase à - 4. Galerie Api 20E (Lac +, VP+,...) ou MALDI-TOF LAC - H2S Urée + Ajout de Kovac’s Aucun changement à indole - à tryptophanase - à Proteus mirabilis Rose à indole + à tryptophanase + à Proteus vulgaris 17 Camille MOUCHART 2024 SI URINOCULTURE 18 Camille MOUCHART 2024 SI AUTRES PRÉLÈVEMENTS Oxydase -> - Galerie API 20E Si colonies Oxydase incolore -> LAC - GMC -> BG - Galerie API résistant aux Oxydase -> + 20NE sels biliaires Si colonies Galerie API 20E fuchsia -> LAC + (Aller voir TP 4 pour plus de un schéma plus claire) 19 Camille MOUCHART 2024 4. DANS LE DOMAINE AGROALIMENTAIRE On s’interesse au bactéries qui sont pathogène part ingestion et donc capable de ce multiplie dans l’intestin. ENTÉROBACTÉRIES Rappelons-nous que entérobactéries présente naturellement dans la flore normale intestinale 107 à 108 UFC/g. Ils sont des indicateur de contamination fécale peu spécifique. C’est un indicateur si il y une présence d’anomalie. Donc si il y des souillure supposée fécale. Les contamination fécale sont la principale source de pathogènes alimentaires. Il n’y a pas forcement de de pathogène s’est associé mais plus il y en a plus il y de risque. En d’autre mots ils sont pas tous responsable de symptôme mais plus il y en a plus c’est risqué. Dénombrements : Carcasses de bovins, ovins, caprins : M = 5*102 UFC/cm2 Lait pasteurisé : M = 5 UFC/ml Crème glacée : M =100 UFC/g ESCHERICHIA COLI Escherichia coli est présentes naturellement dans la flore intestinale à 106 à 107 UFC/g. Mais moins en quantité que vue ici au-dessus car ce sont des entérobactérie mais c’est pas le seul représentent de ses dernier. Ce sont des indicateur de contamination fécale spécifique. Spécifique car les entérobactéries sont retrouvable chez des plantes et autres mais Escherichia coli est que dans les intestin. On en a naturellement dans l’intestin mais pas forcément pathogène car ça dépend des souches. C’est un indicateur si il y une présence d’anomalie. Donc si il y des souillure supposée fécale. Ce sont des indicateur de contamination fécale spécifique. Indicateur si présent anomalie. Donc si il y des souillure supposée fécale. Les contamination fécale sont la principale source de pathogènes alimentaires. Il n’y a pas forcement de de pathogène s’est associé mais plus il y en a plus il y de risque. En d’autre mots ils sont pas tous responsable de symptôme mais plus il y en a plus c’est risqué. Dénombrements : VH : M = 500 UFC/g Beurre : M = 100 UFC/g Fruits et légumes pré-découpés : M = 1000 UFC/g SALMONELLA SP. Pour rappel, la Salmonella sp. ne fait pas partie de la flore normale. Il est pathogène par ingestion ! Recherche : VH à consommer crue : absence dans 25g Crèmes glacées : absence dans 25g 20