Chapitre 1_Cours.pdf

‭ hysiologie végétale‬ P ‭Chapitre 1_Absorption et assimilation de l’azote‬ ‭Chapitre 1 : Absorption et assimilation de l’azote‬ ‭Introduction‬ ‭ ’azote est‬‭un des minéraux les plus importants dans‬‭la plante‬‭(excepté C, O et H).‬ L ‭Il entre dans la compositio...

‭ hysiologie végétale‬ P ‭Chapitre 1_Absorption et assimilation de l’azote‬ ‭Chapitre 1 : Absorption et assimilation de l’azote‬ ‭Introduction‬ ‭ ’azote est‬‭un des minéraux les plus importants dans‬‭la plante‬‭(excepté C, O et H).‬ L ‭Il entre dans la composition de nombreuses molécules biologiques :‬ ‭‬ ‭fonction amine des acides aminés‬‭, donc on trouve beaucoup‬‭d’azote dans les protéines‬ ‭‬ ‭bases puriques et pyrimidiques‬‭→ briques élémentaires‬‭de la formation des acides nucléiques‬ ‭‬ ‭cofacteurs‬‭(NAD, NADP, FAD, …)‬ ‭‬ ‭pigments à noyau pyrrole‬‭, comme les chlorophylles‬‭(= hétérocycles chargés qui permettent de‬ ‭piéger au centre un ion Mg)‬ ‭‬ ‭composés secondaires‬‭(alcaloïdes, …)‬ ‭ ’azote est présent dans le sol sous différentes formes minérales :‬‭ammonium‬‭(NH‬‭4‬‭+‭)‬ ou‬‭nitrate‬‭(NO‬‭3‭-‬ ‬‭).‬ L ‭L’azote est le‬‭composé le plus important dans l'atmosphère‬‭,‬‭sous forme de N‬‭2‬ ‭ou lié à de l’oxygène au‬ ‭cours des orages (NO‬‭2‬‭, N‬‭2‭O ‬ ).‬ ‭ ’est un élément‬‭limitant pour la croissance des plantes‬‭→ on fertilise le sol avec des engrais qui‬ C ‭contiennent un mélange d’azote, de potassium et de phosphore (fertilisant NPK)‬ ‭ es végétaux chlorophylliens sont autotrophes pour le carbone puisqu’ils le prélèvent sous forme minérale.‬ L ‭Il en est de même pour l’azote.‬ ‭I.‬ ‭Absorption de l’azote minéral‬ ‭1.‬ ‭Mise en évidence des besoins azotés d’une plante‬ I‭l existe deux moyens d’évaluer les besoins en azote d’une plante :‬‭l’incinération ou la culture‬ ‭hydroponique.‬ ‭L’incinération d’une plante permet de minéraliser toute la matière organique. On peut alors doser l’azote‬ ‭minéral et savoir la part d’azote qu’il y a dans la plante.‬ ‭La culture hydroponique‬‭est une culture en milieu‬‭contrôlé hors sol en alimentant la plante uniquement‬ ‭avec une solution nutritive. L’azote minéral peut être dosé dans la solution au cours du temps. On sait donc‬ ‭ce qu'absorbe la plante.‬ ‭2.‬ ‭Absorption des ions‬ ‭a.‬ ‭Localisation‬ ‭Expérience :‬‭immersion des racines dans une solution‬‭d’eau minéralisée surmontée d’une solution d’huile.‬ ‭‬ ‭Si les racines de la plante trempent dans l'huile, il n’y a pas d’absorption d’azote‬ ‭‬ ‭Si les racines de la plante trempent dans l'eau, il y a une absorption d’azote‬ ‭⇒ Ce sont donc les racines qui permettent l’absorption de l’azote.‬ ‭ e sont surtout les‬‭jeunes racines qui ont un rôle‬‭dans l'absorption‬‭, car les vieilles racines se lignéfient‬ C ‭(lignine et suber) et deviennent alors imperméables.‬ ‭1‬ ‭ hysiologie végétale‬ P ‭Chapitre 1_Absorption et assimilation de l’azote‬ ‭ es poils absorbants vont‬‭multiplier la surface racinaire‬‭, et donc les zones d’échange avec le sol.‬ L ‭Poils absorbants =‬‭une cellule qui a eu une extension‬‭vers extérieur (= unicellulaire)‬ ‭Ils sont recouverts d’une paroi polysaccharidique et d’une membrane plasmique. Pour rentrer, tous les‬ ‭composés doivent traverser cette barrière, et le plus souvent l’utilisation de transporteurs est nécessaire‬ ‭pour traverser la membrane.‬ ‭ oie symplastique =‬‭voie de transport à travers les‬‭cellules‬ V ‭→ Les composés passent de cellules en cellules par des plasmodesmes‬ ‭ oie apoplastique =‬‭voie de transport en dehors des‬‭cellules, entre les cellules‬ V ‭→ Ce transport sera forcément à un moment couplé à un transport transmembranaire‬ ‭Il faut un transport transmembranaire pour rentrer dans une cellule.‬ ‭ u niveau de la racine, il y a la présence de l’endoderme → jonctions qui empêchent de passer entre les‬ A ‭cellules. C’est donc la fin du transport apoplastique, et on a forcément un transport transmembranaire‬ ‭⇒ L’endoderme permet de réguler le flux‬ ‭Il peut y avoir des améliorations de l’absorption par différents mécanismes :‬ ‭‬ ‭Certaines plantes font des‬‭symbioses avec des champignons‬‭qui forment un réseau autour des‬ ‭jeunes racines pour augmenter surface d’échanges‬ ‭‬ ‭Cluster roots =‬‭bouquets de racines‬ ‭‬ ‭Certaines plantes font des‬‭symbioses avec des bactéries‬‭qui fixent l’azote gazeux‬ ‭‬ ‭Exsudats racinaires‬‭→ les racines excrètent des polysaccharides,‬‭ce qui permet de faire des‬ ‭échanges avec des micro-organismes qui aident à la fixation de l’azote minéral ou organique‬ ‭b.‬ ‭Mécanisme d’absorption‬ ‭ es études physiologiques où on a fait varier la concentration en NO‬‭3‬ ‭d’une part et d’autres facteurs‬ D ‭externes (la température, la lumière, …) ont montré que le nitrate absorbé par la plante dépend plus de ses‬ ‭besoins que de la disponibilité dans le milieu.‬ ‭Il y a donc une‬‭régulation de l'absorption de cet‬‭ion ⇒ transport actif.‬ ‭ xpérience :‬‭des plantes cultivées sans nitrate sont‬‭transférées sur un milieu riche en nitrate‬ E ‭On a mesuré l’absorption dans le temps.‬ ‭→ On a une augmentation linéaire de l'absorption dans une première phase puis une courbe d'absorption‬ ‭qui devient exponentielle.‬ ‭Si on ajoute un inhibiteur de la transcription, il n’y a pas cette seconde phase.‬ ‭⇒ Il y a donc deux types de transporteurs qui participent à l’absorption du nitrate :‬ ‭‬ ‭Au début, on a des‬‭protéines de transport constitutives‬‭,‬ ‭‬ ‭Puis, on a des‬‭protéines de transport additionnelles‬‭(= protéines inductibles) qui permettent une‬ ‭absorption plus forte.‬ ‭Il existe beaucoup de transporteurs qui ne fonctionnent pas tous de la même manière :‬ ‭‬ ‭Les HATS (High Affinity Transporters) =‬‭protéines‬‭capables de piéger et de transporter de l’azote‬ ‭même s’il n’y a pas beaucoup d’azote dans le milieu‬ ‭‬ ‭Les LATS (Low Affinity Transporters) =‬‭protéines capables‬‭de fonctionner que s’il y a de fortes‬ ‭concentrations en composés azotés (nitrate, ammonium)‬ ‭2‬ ‭ hysiologie végétale‬ P ‭Chapitre 1_Absorption et assimilation de l’azote‬ ‭ es plantes disposent donc de plusieurs types de transporteurs membranaires pour le nitrate et‬ L ‭l’ammonium :‬ ‭‬ ‭Les transporteurs de‬‭haute affinité (HATS)‬ ‭‬ ‭Les transporteurs de‬‭basse affinité (LATS)‬ ‭‬ ‭Les transporteurs constitutifs =‬‭la transcription du gène codant pour le transporteur se fait de‬ ‭manière constante‬ ‭‬ ‭Les transporteurs inductifs =‬‭la transcription du‬‭gène codant pour le transporteur se fait grâce à un‬ ‭promoteur induit par la présence du composé‬ ‭c.‬ ‭De la racine au xylème‬ ‭ e nitrate (= ion négatif) va devoir rentrer dans les cellules avec un ion positif (= proton) pour ne pas créer‬ L ‭de différence de charge‬‭⇒ cotransport du nitrate et‬‭des protons (= symport)‬ ‭Le nitrate est ensuite réduit par la nitrate réductase pour donner du nitrite qui sera encore réduit en‬ ‭ammonium dans le plaste. L’ammonium est ensuite intégré dans des acides aminés.‬ ‭Il y a 3 devenirs du nitrate :‬ ‭‬ ‭Réduction en ammonium‬‭dans le plaste → deux enzymes‬‭: la nitrate réductase (NR), puis la nitrite‬ ‭réductase (NiR)‬ ‭‬ ‭Exportation‬‭dans le xylème → la diffusion simple par‬‭des plasmodesmes s’effectue le long d’un‬ ‭gradient radial du cortex, puis un transport actif s’effectue pour entrer dans le xylème‬ ‭‬ ‭Accumulation‬‭dans la vacuole → participe à l’abaissement‬‭du potentiel osmotique‬ ‭ e nitrate peut aussi rentrer en antiport avec des OH‬‭-‬‭.‬ L ‭L’Ammonium rentre en antiport avec des protons.‬ ‭ ’est le‬‭nitrate qui est majoritairement absorbé‬‭,‬‭car on en trouve plus de façon libre dans le sol.‬ C ‭L’ammonium est très réduit et donc chargé, il est donc prêt à former des AA. Les organismes se battent‬ ‭donc pour récupérer l’ammonium.‬ ‭ a plupart du temps,‬‭les anions sont complexés à des‬‭cations pour former des sels‬‭→ exemple : le nitrate‬ L ‭est annexé avec du K‬‭+‬ ‭pour donner du nitrate de potassium.‬ ‭ i on a un symport, on a un‬‭flux de protons‬‭et donc‬‭une‬‭acidification de la racine.‬‭On a donc une‬‭ATPase‬ S ‭qui va consommer de l’ATP pour expulser les protons.‬ ‭3.‬ ‭Absorption de l’ammonium‬ ‭ H‬‭4‬ ‭est la forme potentiellement la plus économique‬‭d'azote pour la plante car il est déjà sous forme‬ N ‭réduite.‬ ‭L’ammonium entre en antiport avec une excrétion de protons. Cependant, cette forme peut affecter la‬ ‭physiologie du végétal par deux effets principaux :‬ ‭‬ ‭L'acidification du milieu racinaire‬ ‭‬ ‭La perturbation de la nutrition hydrominérale regroupée sous le terme de‬‭syndrome ammoniacal.‬ ‭a.‬ ‭Acidification du milieu racinaire‬ ‭ ’absorption de NH‬‭4‬ ‭entraîne une accélération de la‬‭sortie de H‬‭+‬ ‭dans le milieu extérieur.‬ L ‭Cette acidification est de peu d'ampleur dans le sol en raison de son pouvoir tampon mais peut être‬ ‭significative dans le cas d'une nutrition hydroponique → si le milieu est très acide, les‬‭protons vont entrer‬ ‭3‬ ‭ hysiologie végétale‬ P ‭Chapitre 1_Absorption et assimilation de l’azote‬ ‭ n compétition avec certains cations‬‭comme potassium. Donc les protons vont rerentrer dans la plante au‬ e ‭détriment d’autres cations dont la plante a besoin.‬ ‭ ulture en hydroponie =‬‭fait de cultiver des plantes‬‭sur un sols totalement inerte → pas d'échanges de‬ C ‭minéraux avec la plante, juste un rôle de structure ou d’éponge.‬ ‭On fait couler un liquide nutritif dilué et on peut mesurer le pH.‬ ‭b.‬ ‭Syndrome ammoniacal‬ ‭ i une plante est arrosée uniquement avec de l’ammonium, elle va avoir le syndrome ammoniacal.‬ S ‭→ Syndrome ammoniacal =‬‭la plante va grandir moins‬‭vite, les feuilles sont jaunissantes, il y a moins de‬ ‭matière fraîche produite. Cela est dû à :‬ ‭‬ ‭Une baisse de cations → NH‬‭4‬‭+‬ ‭utilise les mêmes canaux‬‭ioniques que le K‬‭+‬‭, il y a donc compétition.‬ ‭Une fois entré, on a une intégration rapide de l'ammonium dans les acides aminés et donc il‬ ‭disparaît rapidement en tant que cations, d'où un déficit en cations.‬ ‭‬ ‭Un déficit en acide organique‬ ‭○‬ ‭les acides organiques sont utilisés avec l'ammonium pour former des acides aminés‬ ‭○‬ ‭l'absence de nitrate empêche la formation d'acides organiques. L'absorption de nitrate‬ ‭conduit à une sortie de OH‬‭-‬‭. Or ces OH‬‭-‬ ‭peuvent se‬‭combiner avec du CO‬‭2‬ ‭pour faire des‬ ‭carbonates (HCO‬‭3‭)‬ qui peuvent former des acides organiques‬‭en réagissant avec R-COO‬‭-‬‭.‬ ‭‬ ‭Une augmentation des acides aminés par assimilation de l'ammonium et une baisse des sucres.‬ ‭c.‬ ‭Nutrition mixte‬ ‭ a nutrition mixte montre que‬‭le nitrate facilite‬‭l'absorption de l'ammonium.‬‭En effet, le nitrate entre‬‭en‬ L ‭symport avec des H‬‭+‭,‬ et l'ammonium entre en antiport‬‭avec des H‬‭+‭.‬ ‬ ‭Par ailleurs, le nitrate migre facilement dans les feuilles et induit une augmentation de la photosynthèse.‬ ‭ Une nutrition mixte est favorable à la plante.‬‭Ceci‬‭se traduit par une production de matière fraîche plus‬ ⇒ ‭importante.‬ ‭Par l'absorption des deux ions (ammonium et nitrate), la plante résout les problèmes :‬ ‭‬ ‭De l'acidification de la rhizosphère‬ ‭‬ ‭Du maintien de l'osmoticum‬‭→ le nitrate est absorbé‬‭et mis en réserves dans les vacuoles‬ ‭‬ ‭D’une photosynthèse meilleure‬‭→ migration du nitrate‬‭vers les feuilles, réduction dans les feuilles‬ ‭en échanges d'assimilats vers la racine.‬ ‭Le nitrate d’ammonium est le sel préférentiellement utilisé dans les engrais chimiques.‬ ‭d.‬ ‭Adaptations à la nutrition ammoniacale‬ ‭ ans la nature, l'ammonium qui provient de la dégradation de l'azote organique est rapidement oxydé en‬ D ‭nitrate par les bactéries nitrificatrices. Cependant ces transformations peuvent être inhibées par‬ ‭‬ ‭une température trop basse‬ ‭‬ ‭un pH trop bas‬ ‭‬ ‭un manque d'oxygène‬ ‭Il existe aussi des‬‭mécanismes d'adaptations.‬ ‭‬ ‭Les conifères ont souvent des ectomycorhizes qui permettent à la plante d'oxyder l'ammonium en‬ ‭nitrate. Ceci permet de rétablir la balance ammonium/nitrate dans la plante‬ ‭‬ ‭Les plantes en C4 produisent plus d'acides organiques grâce à la carboxylation du PEP par la‬ ‭PEPcase or ce PEP provient du pyruvate donc du glucose. Ces acides organiques peuvent donc‬ ‭piéger plus facilement l'ammonium pour faire des acides aminés et là aussi absorber le surplus‬ ‭d’ammonium.‬ ‭4‬ ‭ hysiologie végétale‬ P ‭Chapitre 1_Absorption et assimilation de l’azote‬ ‭‬ D ‭ ’autres plantes comme le riz, qui a un aérenchyme, émet de l'oxygène au niveau de ses racines‬ ‭facilitant la présence de bactéries nitrificatrices qui vont oxyder l’ammonium en nitrate.‬ ‭4.‬ ‭Origine de l’azote minéral‬ ‭a.‬ ‭L’humidification‬ ‭ ar une triple action mécanique, chimique et biologique, les animaux du sol interviennent dans‬‭les‬ P ‭processus de décomposition de la matière organique‬‭.‬ ‭Cette décomposition conduit à‬‭l’humus‬‭(matière organique)‬‭par l'action des microflores humidifiantes, ou à‬ ‭des éléments minéraux si l’humus est réduit en éléments plus simples par une microflore minéralisante.‬ ‭ ’action mécanique :‬ L ‭Les animaux dans le sol fragmentent les matières organiques. Les vers de terre les fragmentent‬ ‭grossièrement. Puis, dans l'ordre, les myriapodes, les collemboles, les acariens et enfin les nématodes‬ ‭procèdent à une fragmentation de plus en plus fine. Cette fragmentation a pour effet d'augmenter‬ ‭considérablement la surface d'attaque des matières organiques par les bactéries et les champignons du‬ ‭sol.‬ ‭ e passage de la matière organique dans le tube digestif de ces animaux a pour effet de la mélanger à‬ L ‭diverses sécrétions intestinales, formant des colloïdes humiques. Il s'ensuit la formation d'agrégats stables‬ ‭dont les plus remarquables sont ceux que laissent les lombrics.‬ ‭ ous ces animaux participent au transport actif de la matière organique dans les horizons du sol. En outre,‬ T ‭en fouissant, ces animaux améliorent l'aération du sol ainsi que la circulation de l'eau. On estime que les‬ ‭vers de terre assurent à eux seuls plus de 50 % de la macroporosité dans le sol quand le travail‬ ‭mécanique (labour) n'en assurerait qu'à peine un quart‬ ‭ ’action chimique :‬ L ‭Les vers de terre ne se contentent pas de répartir les matières organiques dans le profil d'un sol. Parce‬ ‭que le calcium est indispensable à leur métabolisme, les vers de terre circulent aussi cet élément. On‬ ‭estime que ces animaux, en remontant cet élément vers les couches supérieures, s'opposent au lessivage‬ ‭et par voie de conséquence, à la décalcification des sols.‬ ‭ es déjections des vers de terre sont très riches en potassium, en ammoniaque, en phosphore et en‬ L ‭magnésium. Ces éléments sont surtout mieux échangeables et mieux assimilables quand ils ont transité‬ ‭par leur tube digestif que lorsqu'ils sont adsorbés sur les colloïdes argilo-humiques. La faune du sol joue‬ ‭un rôle fondamental d'intermédiaire entre le sol et la plante.‬ ‭ ’action biologique :‬ L ‭Tous les animaux dans le sol sont nécessairement microphytophages. La raison en est que les aliments‬ ‭que ces animaux consomment sont obligatoirement couverts de bactéries, de mycéliums ou de‬ ‭cyanobactéries.‬ I‭l est certain qu'un bon nombre de ces microorganismes sont détruits par les processus digestifs (bactéries‬ ‭saprophytes surtout). Mais il est probable aussi que d'autres de ces organismes, non détruits, sont‬ ‭stimulés au cours de ce transit. C'est probablement le cas des organismes de la microflore humidifiante‬ ‭puisque l'on constate que l'humus se forme plus rapidement à partir des déjections animales qu'à partir‬ ‭des débris végétaux n'ayant pas subi de transit intestinal. ‘ou l’intérêt du lombricomposteur‬ ‭ n résumé :‬ E ‭Les microflores vont fragmenter la MO (ils la digèrent) jusqu’à ce que des bactéries finissent le travail =‬ ‭action mécanique‬ ‭5‬ ‭ hysiologie végétale‬ P ‭Chapitre 1_Absorption et assimilation de l’azote‬ ‭ es vers de terre additionnent des sécrétions à cette MO qui vont l’hydrolyser =‬‭action chimique‬ L ‭Toute cette microflore se nourrit de la fragmentation de cette MO, et elle se renouvelle donc elle participe‬ ‭aussi à la production de MO =‬‭action biologique‬ ‭Schéma cycle de l’azote‬ ‭b.‬ ‭Minéralisation de l’humus‬ ‭‬ A ‭ mmonisation :‬‭C’est la première étape de minéralisation‬‭de l’azote qui conduit à la libération‬ ‭d’ammonium (NH‬‭4‬‭+‭)‬ , ammoniac (NH‬‭3‭)‬ ou ammoniaque (NH‬‭4‭O ‬ H)‬‭suivant le pH. Cette minéralisation‬ ‭fait suite à une protéolyse (l'azote organique provient surtout de la dégradation des protéines).‬ ‭Deux types de réactions sont réalisées par des bactéries ammonifiantes comme‬‭Bacillus subtilis‬‭→ la‬ ‭bactérie va dégager du CO‬‭2‬ ‭et produire de l’ammonium.‬ ‭→ pas besoin de connaître les réactions‬ ‭‬ N ‭ itrification :‬ ‭Cette étape conduit à la formation‬‭de nitrates par nitrosation et nitratation. Cette‬ ‭oxydation est très exergonique et dégage de l’énergie.‬ ‭II.‬ ‭Assimilation des ions nitrates et ammoniacaux‬ ‭1.‬ ‭La réduction des nitrates‬ ‭a.‬ ‭Généralités‬ ‭ xpérience :‬‭Des plants de tomate sont cultivés quelques‬‭jours sans azote, puis on les arrose avec du‬ E ‭nitrate.‬ ‭‬ ‭Au bout de 24H, on a une majorité de nitrate dans feuilles‬ ‭‬ ‭Au bout de 36H, on a une majorité de nitrite‬ ‭‬ ‭Au bout de 48H, on a une majorité d’asparagine (AA)‬ ‭ On a donc‬‭une réduction qui se fait de manière séquentielle‬‭: nitrate → nitrite → ammonium puisque‬ ⇒ ‭l’ammonium est intégré dans l’AA asparagine.‬ ‭ itrate réductase (NR) :‬ N ‭On observe une compétition entre respiration et réduction des nitrates → la nitrate réductase fonctionne‬ ‭plus rapidement en absence d’O‬ ‭Le NADH viendrait donc de l'activité respiratoire (Cycle de Krebs = formation de cofacteurs réduits).‬ ‭→ les cofacteurs qui donnent le pouvoir réducteur sont produits pendant la respiration cellulaire‬ ‭ itrite réductase (NiR) :‬ N ‭On observe une compétition entre activité photosynthétique et réduction du nitrite → la nitrite réductase‬ ‭fonctionne plus rapidement sans CO‬‭2‬ ‭Le NADPH viendrait donc de la photosynthèse.‬ ‭→ C’est une enzyme qui fonctionne avec des cofacteurs issus de la photosynthèse‬ ‭ a réduction de l'azote s'effectue donc en deux étapes : la NR est située dans le cytosol alors que la NiR‬ L ‭est située dans le plaste.‬ ‭6‬ ‭ hysiologie végétale‬ P ‭Chapitre 1_Absorption et assimilation de l’azote‬ ‭ 'activité de chacune est liée à des transporteurs qui permettent aux nitrates et nitrites de traverser la‬ L ‭membrane plasmique, le tonoplaste ou l'enveloppe chloroplastique.‬ ‭Schéma réduction du nitrate en ammonium → (NO‬‭3‭-‬ ‬ ‭et‬‭NO‬‭2‭-‬ ‬‭)‬ ‭b.‬ ‭Structure et fonction de la nitrate réductase‬ ‭ a nitrate réductase est une‬‭enzyme homodimérique‬‭.‬‭Chaque monomère est constitué de 3 domaines‬ L ‭fonctionnels.‬ ‭A chaque domaine est associé un cofacteur. Les 3 domaines permettent le transfert des électrons‬ ‭provenant du NADH au nitrate.‬ ‭Cette enzyme est une petite cascade d'oxydo-réductions‬ ‭ 'étude in vitro de cet enzyme a permis de mettre en évidence des donneurs et des accepteurs artificiels‬ L ‭d'électrons. Ces molécules ont permis de caractériser la sous-unité dysfonctionnante chez des mutants.‬ ‭Par ailleurs, la caractérisation de ces mutants a été réalisée par la mesure d'activité enzymatique partielle‬ ‭et par la reconnaissance par un anticorps.‬ ‭→ Il est important d’avoir des mutants pour étudier le fonctionnement d’une protéine.‬ ‭c.‬ ‭Régulation de la nitrate réductase‬ ‭L'étude de la régulation d'une enzyme s'effectue généralement par 3 voies :‬ ‭‬ ‭Le clonage des gènes et l'étude des activités enzymatiques correspondantes‬ ‭‬ ‭L’expression des gènes caractérisés dans des plantes transgéniques‬ ‭‬ ‭L'étude de mutants déficients pour ce gène‬ ‭ omment isoler des mutants ?‬ C ‭Des mutants déficients en nitrate réductase (NR-) ont été isolés par traitement mutagène sur graines.‬ ‭‬ ‭Une plante sauvage est capable d’absorber le nitrate et le chlorate. Si la nitrate réductase‬ ‭fonctionne, il y a la production de nitrite et de chlorite. La chlorite entraîne la mort des cellules → les‬ ‭graines ne germent pas‬ ‭‬ ‭Une plante mutée sur la nitrate réductase ne peut pas assimiler le nitrate et le chlorate. Les cellules‬ ‭ne vont donc pas mourir. De plus, l’ajout d’ammonium permet la production d’acides aminés‬ ‭(comme la glutamine) et donc la croissance de la plante.‬ ‭⇒ Seul les mutants poussent‬ ‭ omment étudier l’expression d’un gène ?‬ C ‭(Southern Blot = ADN)‬ ‭L’expression d’un gène était initialement étudiée grâce à la technique du‬‭Northern Blot (ARN).=‬‭quantifier‬ ‭(ou semi-quantifier) la production d’un ARNm particulier‬ ‭Blot =‬‭transfert des ARNm qui ont sur le gel sur un‬‭papier particulier (nitrocellulose)‬ ‭On baigne ensuite la feuille dans une sonde complémentaire de l’ARN qu’on veut mettre en évidence‬ ‭→ cette sonde complémentaire va s’hybrider spécifiquement avec l’ARN qu’on souhaite étudier‬ ‭ ène de ménage =‬‭gène qui est exprimé de manière constante‬‭dans n’importe quel conditions, il permet‬ G ‭de calibrer pour savoir si les deux extractions ont été bien réalisées‬ ‭→ Exemple : L’ATP synthase est un gène de ménage‬ ‭ e clonage et la connaissance de la séquence codante de la NR permet de faire des sondes pour des‬ L ‭Northern blot, et permet, après extraction des ARNm, de faire une réverse transcription pour obtenir des‬ ‭7‬ ‭ hysiologie végétale‬ P ‭Chapitre 1_Absorption et assimilation de l’azote‬ ‭ DNc. Ces ADNc peuvent être utilisés comme matrices avec des amorces spécifiques pour l'amplification‬ A ‭par PCR de la séquence codant pour la NR.‬ ‭ T-PCR =‬‭on fait un traitement avec une Reverse transcriptase‬‭(= enzyme qui permet de refaire le‬ R ‭deuxième brin des ARNm) → double brin =‬‭ADN complémentaire‬ ‭On peut désigner des amorces sur l’ADN complémentaire qui sont spécifiques pour amplifier un gène‬ ‭⇒ Forte amplification du gène codant pour la nitrate réductase‬‭(même résultat que le northern blot)‬ ‭ RT-PCR quantitative =‬‭on fait une PCR et on mesure‬‭l’amplification à chaque cycle de PCR‬ q ‭→ Les fluorochromes viennent s’intercaler à chaque cycle d’amplification (fluorescence)‬ ‭ e gène de la nitrate réductase est très exprimé lorsque la plante est arrosée avec de l’azote. L’expression‬ L ‭du gène est faible ou nulle quand la plante est arrosée avec de l’eau.‬ ‭⇒ Régulation transcriptionnelle‬ ‭ estern Blot =‬‭Mesurer la quantité de protéines‬ W ‭→ transfert sur de la nitrocellulose, puis hybridation avec un anticorps qui va s'attacher spécifiquement sur‬ ‭la protéine nitrate réductase.‬ ‭ xpérience :‬‭chez des plantes mutantes pour le gène‬‭de la nitrate réductase (NR-), on a réalisé des‬ E ‭transformations pour réintroduire ce gène soit avec son promoteur, soit avec un promoteur constitutif, donc‬ ‭non régulé (= plante témoin)‬ ‭(Diapo 11b → Schéma : vert = promoteur constitutif / bleu = promoteur inductible)‬ ‭Ces plantes sont cultivées au départ en absence de nitrate.‬ ‭‬ ‭Chez la plante témoin, on retrouve en abondance des transcrits du gène NR, des protéines NR et‬ ‭une activité enzymatique (AE) de cette enzyme.‬ ‭‬ ‭Chez la plante portant le gène natif avec son promoteur, on observe aucune présence de transcrits,‬ ‭ni de protéines.‬ ‭La transcription du gène NR est donc initié par la présence du substrat de l’enzyme‬ ‭⇒ Contrôle transcriptionnel‬ ‭ ans un second temps, l’addition de nitrate induit de manière cinétique la production d’ARNm, puis la‬ D ‭traduction de protéines correspondantes et enfin la présence de protéines actives.‬ ‭Une seconde carence de nitrate entraîne d’abord la disparition de protéines actives, alors que le gène‬ ‭correspondant est toujours fortement exprimé‬ ‭⇒ Contrôle post-traductionnel‬ ‭ xpérience :‬‭on a pris une plante sauvage et un mutant‬‭pour le phytochrome (= pigment qui capte la‬ E ‭lumière rouge même en basse intensité).‬ ‭‬ ‭À l'obscurité, on obtient aucune synthèse d’ARNm du gène‬‭NR‬‭chez les deux plantes.‬ ‭‬ ‭En lumière rouge, on a la production d’ARNm de NR chez la plante sauvage.‬ ‭Le phytochrome est donc un photorécepteur impliqué dans l’induction de la transcription du gène‬‭NR‬‭.‬ ‭⇒ Contrôle transcriptionnel du gène‬‭NR‬‭par la lumière.‬ ‭ e passage de la lumière à l’obscurité induit très rapidement une chute de l’activité enzymatique et de la‬ L ‭traduction, alors que la transcription reste plus longtemps active.‬ ‭⇒ Contrôle post-transcriptionnel‬ ‭8‬ ‭ hysiologie végétale‬ P ‭Chapitre 1_Absorption et assimilation de l’azote‬ ‭ lusieurs facteurs jouent un rôle dans la régulation de la NR et de la NiR :‬ P ‭(Diapo 12b → pas besoin d’apprendre le schéma)‬ ‭‬ ‭La présence d’AA joue un rôle négatif sur la transcription → si la plante a beaucoup d’azote sous‬ ‭forme d’AA libres, il n’y a pas besoin d’assimiler de l’azote‬ ‭‬ ‭S’il y a beaucoup de sucres, on a beaucoup d’acides organiques → il y a donc plus d’activité de la‬ ‭nitrate réductase (effet positif)‬ ‭‬ ‭Cytokinine = hormone impliquée dans la division cellulaire (impliquée dans la croissance) → effet‬ ‭positif‬ ‭‬ ‭Acide abscissique = hormone de stress (impliquée dans le ralentissement du métabolisme) → effet‬ ‭négatif‬ ‭ a régulation de l’activité enzymatique s’effectue par phosphorylation‬‭→ la protéine phosphorylée est‬ L ‭inactive, et sa déphosphorylation entraîne un changement de conformation et de son activité.‬ ‭S’il n’y a plus de nitrate, la protéine est phosphorylée et donc elle est inactive (= contrôle‬ ‭post-traductionnel)‬ ‭2.‬ ‭L’assimilation de l’ammonium‬ ‭a.‬ ‭Sources d’ammonium‬ ‭Il existe 4 sources d’ammonium disponibles pour la plante :‬ ‭‬ ‭La réduction des nitrates‬‭d’abord en nitrite, puis‬‭en ammonium‬ ‭‬ ‭La fixation symbiotique de l’azote atmosphérique‬‭→‬‭la symbiose entre une bactérie du sol‬ ‭(Rhizobium) et une plante de la famille des Fabacées (pois, haricot, lentille, luzerne, …) permet de‬ ‭capter le diazote pour le réduire en NH‬‭3‬ ‭par une enzyme,‬‭la nitrogénase.‬ ‭‬ ‭La photorespiration‬‭→ voie de remobilisation de l’ammonium‬‭(deux glycines peuvent conduire à‬ ‭une sérine avec la libération d’un ion ammonium)‬ ‭Photorespiration =‬‭processus qui implique 3 compartiments‬‭→ résultat de la double fonctionnalité de la‬ ‭rubisco‬ ‭‬ ‭Le catabolisme des protéines‬‭→ dans des feuilles âgées,‬‭il permet de libérer des acides aminés‬ ‭et/ou des fonctions amines qui peuvent être utilisées dans la synthèse de nouveaux acides aminés.‬ ‭b.‬ ‭Mécanisme d’assimilation‬ ‭ ’assimilation de l’ammonium s’effectue en deux étapes.‬ L ‭Une glutamine synthase (GS) permet de fixer un ion ammonium sous la forme d’une fonction amine sur du‬ ‭glutamate pour donner la glutamine (deux fonctions NH‬‭3‭)‬.‬ ‭Cette fonction amine est transférée sur de l’α-cétoglutarate (acide organique) pour redonner deux‬ ‭glutamates. L’enzyme est la GOGAT (Glutamine OxoGlutarate AminoTransférase).‬ ‭Un des glutamates va retourner dans le cycle, alors que l’autre devient un glutamate libre.‬ ‭3.‬ ‭La glutamine synthase (GS)‬ ‭Isoforme =‬‭forme quasiment identique d'une protéine‬‭à certaines configurations géométriques près.‬ ‭ 'isolement d’organes et d'organismes a conduit à caractériser différentes ARNm très proches codant pour‬ L ‭des isoformes de la même enzyme.‬ ‭→ Il existe donc‬‭un gène GS spécifiquement exprimé‬‭dans les racines.‬‭Il existe aussi‬‭deux gènes GS dans‬ ‭les feuilles‬‭conduisant à deux isoformes, l’une adressée‬‭dans le plaste‬‭et l’autre‬‭dans le cytosol.‬ ‭9‬ ‭ hysiologie végétale‬ P ‭Chapitre 1_Absorption et assimilation de l’azote‬ I‭l y a donc un peptide signal qui permet d’adresser la protéine au chloroplaste avec une étape de transition‬ ‭par une fixation du peptide sur l’enveloppe chloroplastique.‬ ‭La partie adressage n’intervient pas dans la fonctionnalité de l’enzyme.‬ ‭Utilisation d’un gène rapporteur :‬ ‭‬ ‭Le gène Gus n’existe pas chez les plantes, on prend donc le promoteur du gène dont on veut‬ ‭étudier l’expression et on le met en amont du gène rapporteur‬ ‭Pour voir l’expression, on cuve avec un substrat, et on obtient une coloration bleue si le gène est exprimé‬ ‭‬ ‭La GFP → lorsque la plante est excitée par une lumière bleue, elle va émettre une lumière verte si‬ ‭le gène est exprimé‬ ‭Facteurs de régulation du gène et de la protéine GS :‬ ‭‬ ‭L’apport de NH‬‭4‭+‬ ‬ ‭et/ou de NO‬‭3‬‭-‬ ‭augmentent l’activité‬‭la transcription et l’activité enzymatique de la‬ ‭GS‬ ‭‬ ‭Les lumières rouge (phytochrome) et bleue (cryptochrome) augmentent la transcription de la GS2‬ ‭‬ ‭La photorespiration (par abaissement [CO‬‭2‬‭]) augmente‬‭la libération de NH‬‭4‬‭, et par conséquent‬ ‭confirme que le substrat de la GS augmente sa transcription‬ ‭4.‬ ‭Du nitrate à la glutamine – la GDH‬ ‭ e nombreux transporteurs sont nécessaires pour traverser la membrane plasmique et les différents‬ D ‭compartiments intracellulaires (vacuole, plaste, …)‬ ‭ a glutamate déshydrogénase (GDH)‬‭est impliquée dans‬‭l’assimilation de l’ammonium en glutamate.‬ L ‭Cette voie est peu exprimée, mais elle permet de générer du glutamate pour amorcer le cycle‬ ‭(glutamate/glutamine).‬ ‭ e cycle du glutamate ne fonctionne que s’il y a un équilibre entre le glutamate et l’α-cétoglutarate. Or, du‬ L ‭glutamate va pouvoir s’échapper du cycle pour former de la glutamine dans le cytosol en utilisant de‬ ‭l’ammonium.‬ ‭→ Cette GDH peut donc‬‭fonctionner dans les deux sens‬‭,‬‭permettant d’équilibrer la quantité de glutamate‬ ‭et d’α-cétoglutarate pour une bonne assimilation de l’ammonium par le cycle GS/GOGAT.‬ ‭ Il existe deux voies d’assimilation de l’ammonium‬‭(une plastidiale et une cytosolique)‬ ⇒ ‭L’assimilation de l’ammonium conduit à deux acides aminés (= glutamate et glutamine)‬ ‭5.‬ ‭Biosynthèse des acides aminés‬ ‭ a biosynthèse des autres acides aminés à partir du glutamate et de la glutamine s’effectue principalement‬ L ‭par‬‭transamination.‬ ‭Les transaminases catalysent le‬‭transfert d’un groupement‬‭α-aminé d’un AA au carbone α d’un acide‬ ‭organique‬‭produisant ainsi un nouvel AA et un autre‬‭acide organique.‬ ‭L’action des transaminases est‬‭réversible‬‭, elle fonctionne‬‭dans les 2 sens.‬ ‭Les transaminases sont‬‭régulées par le pH du milieu‬‭et les concentrations en substrats et produits.‬ ‭ Les transaminases jouent un rôle extrêmement important dans la synthèse des AA et redistribuent‬ ⇒ ‭l’azote du glutamate à d’autres acides organiques.‬ ‭10‬ ‭ hysiologie végétale‬ P ‭Chapitre 1_Absorption et assimilation de l’azote‬ ‭ ’asparagine‬‭est un AA particulier, c’est celui qui circule le plus dans le phloème de nombreuses plantes.‬ L ‭Il existe plusieurs voies de biosynthèse de l’asparagine :‬ ‭‬ ‭Amidation de l’aspartate‬ ‭‬ ‭Transamidation (un peu comme une transamination), mais elle implique deux acides aminés‬ ‭comme substrat et deux autres comme produit. Cette enzyme nécessite de l’ATP‬ ‭(Diapo 17a → schéma vue d’ensemble de la biosynthèse des acides aminés)‬ ‭ a synthèse des acides aminés n’est pas toujours une simple transamination → exemple de la synthèse‬ L ‭des acides aminés aromatiques : tyrosine et phénylalanine.‬ ‭Cyclisation à partir du PEP et de l’érythrose, obtention en plusieurs étapes du shikimate qui est ensuite‬ ‭phosphorylé, puis du PEP vient se condenser, et enfin perte d‘un OP. Transfert de l’énol pyruvate sur un‬ ‭autre carbone. Transamination puis réduction ou décarboxylation pour obtenir tyrosine et phénylalanine‬ ‭(Diapo 17b → pas besoin d’apprendre les schémas)‬ ‭ La transamination est toujours nécessaire pour introduire la fonction amine, mais la biosynthèse d’un AA‬ ⇒ ‭est pas toujours aussi simple‬‭→ la construction du‬‭squelette hydrocarbonée est un peu plus compliquée‬ ‭Conclusion‬ ‭‬ M ‭ ajoritairement, les AA sont synthétisés à partir de composés minéraux azotés (sels) → les plantes‬ ‭sont donc aussi autotrophes pour l’azote.‬ ‭‬ ‭Une biosynthèse des acide aminés qui coûte de l’énergie (réduction du NO‬‭3‬ ‭en NH‬‭4‬‭)‬ ‭‬ ‭La diversité des acides aminés issus de transamination → on ne peut pas dissocier métabolisme‬ ‭des acides organiques issus de la photosynthèse et métabolisme de l’azote et des acides aminés‬ ‭‬ ‭Symbiose et carnivorie = deux voies alternatives d’améliorer une nutrition azotée‬ ‭11‬