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Ayudantía Clase 16: REGULACIÓN DE LA EXPRESIÓN GÉNICA POSTRANSCRIPCIONAL: IRNA Y RNAS NO CODIFICANTES. Josefa Vallejos Aravena Curso de Biología Molecular 2024 Facultad de Ciencias, Universidad de Chile  Principales RNA no codificantes Existen muc...

Ayudantía Clase 16: REGULACIÓN DE LA EXPRESIÓN GÉNICA POSTRANSCRIPCIONAL: IRNA Y RNAS NO CODIFICANTES. Josefa Vallejos Aravena Curso de Biología Molecular 2024 Facultad de Ciencias, Universidad de Chile  Principales RNA no codificantes Existen muchos tipos de RNA. Solo los mRNA codifican para proteínas y son minoritarios, mientras que el resto cumple funciones estructurales y regulatorias. Diferentes tipos de RNA son transcritos por diferentes RNApol. Los RNA pueden formar estructuras, interactuando consigo mismos o con proteínas. También pueden presentar modificaciones que facilitan la interacción con proteínas. En eucariontes, las subunidades 5.8S, 18S y 28S de rRNA se codifican en un solo transcrito que sufre modificaciones químicas y luego es procesado en los 3 rRNAs. Las modificaciones son pseudouridinaciones y 2- O-metilaciones catalizadas por snoRNPs asociadas a snoRNAs.  rRNA tRNA snoRNA Los rRNA constituyen la mayor parte del ribosoma y son fundamentales en la síntesis proteica, mientras que los tRNA son esenciales para la traducción del código genético, entregando los aminoácidos correctos al ribosoma durante la traducción del mRNA. Modificaciones en los tRNA Los tRNA también están sujetos a modificaciones postranscripcionales que son esenciales para su función. Por ejemplo, en la primera base del anticodón del tRNA se puede encontrar inosina, lo que permite que el tRNA reconozca múltiples codones. Estas modificaciones contribuyen a la degeneración del código genético, permitiendo que un solo tRNA reconozca varios codones. El snoRNA es una clase de RNA pequeño que reside en el nucleolo y participa en las modificaciones químicas del rRNA, facilitando su maduración y funcionalidad. El snoRNA guía las modificaciones, como la 2'- O-metilación y la pseudouridilación, que son necesarias para que los rRNA adopten su estructura correcta y desempeñen su función en la síntesis proteica. RNA largos no codificantes (lncRNA) y RNA no codificantes (ncRNA) Xist ncRNA participa en la inactivación por epigenética del cromosoma X en mamíferos. Este proceso implica la transcripción de Xist RNA, que recubre el cromosoma X al interactual con el retrotramposon LINEs y lo inactiva mediante la reclutación de complejos de modificación epigenética, como el complejo PcG (H3K27me3), promoviendo la compactación de la cromatina y el silenciamiento transcripcional. RNA largos no codificantes (lncRNA) y RNA no codificantes (ncRNA) HOTAIR (HOX Antisense Intergenic RNA) es un RNA largo no codificante (lncRNA) que se transcribe a partir del locus HOXC en el cromosoma 12. Con una longitud de aproximadamente 2.2 kb, HOTAIR contiene dominios estructurales que le permiten interaccionar con diferentes proteínas y moléculas de RNA, facilitando su función reguladora. Regula a distancia la expresión de genes del complejo HOX, permite que los diferentes genes del complejo se expresen diferencialmente en diferentes partes del organismo. HOTAIR es esencial para el desarrollo bilateral en los organismos multicelulares. Su expresión diferencial en fibroblastos está relacionada con perfiles distintos de expresión en los complejos HOXA y HOXD. HOTAIR se asocia a regiones específicas de estos complejos y recluta al complejo PRC2 (Polycomb Repressive Complex 2), lo que conduce a la trimetilación de histonas. Este proceso resulta en la formación de heterocromatina, lo que silencia ciertos loci genéticos, modulando así la expresión de genes críticos para el desarrollo. RNA largos no codificantes (lncRNA) y RNA no codificantes (ncRNA) HOTAIR (HOX Antisense Intergenic RNA) es un RNA largo no codificante (lncRNA) que se transcribe a partir del locus HOXC en el cromosoma 12. Con una longitud de aproximadamente 2.2 kb, HOTAIR contiene dominios estructurales que le permiten interaccionar con diferentes proteínas y moléculas de RNA, facilitando su función reguladora. Regula a distancia la expresión de genes del complejo HOX, permite que los diferentes genes del complejo se expresen diferencialmente en diferentes partes del organismo. HOTAIR es esencial para el desarrollo bilateral en los organismos multicelulares. Su expresión diferencial en fibroblastos está relacionada con perfiles distintos de expresión en los complejos HOXA y HOXD. HOTAIR se asocia a regiones específicas de estos complejos y recluta al complejo PRC2 (Polycomb Repressive Complex 2), lo que conduce a la trimetilación de histonas. Este proceso resulta en la formación de heterocromatina, lo que silencia ciertos loci genéticos, modulando así la expresión de genes críticos para el desarrollo.  Considerando lo visto anteriormente sobre la configuración de la cromatina, si se quiere tener un modelo celular sin la expresión de un lncRNA, ¿que podemos hacer?  dsRNA siRNA microRNA Mirtrons piRNAs RNA de interferencia y pequeños RNA  Se observó que al insertar un transgen con un promotor fuerte del gen que gatillaba la acumulación de Napoli, pigmento en la petunia generaba una Lemieux y flor sin pigmento. Al hacer el Jorgensen antisentido artificial la flor no era blanca solo tenia menos color. Descubrieron un pequeño RNA, lin-4, que al eliminarse inhibe la diferenciación de un linaje celular Ruvkun y (fenotipo homocromico). Es decir, Ambros observaron que pequeños RNA (procesados) regulaban el desarrollo. Descubrieron que el fenómeno de interferencia (silenciamiento sistémico amplificado) se debe a un RNA de doble hebra Fire y complementario al gen de Mello interés. (Estos animales tienen ese mecanismo gracias a una una RNAPpol que usa RNA de molde).  Se observó que al insertar un transgen con un promotor fuerte del gen que gatillaba la acumulación de Napoli, pigmento en la petunia generaba una Lemieux y flor sin pigmento. Al hacer el Jorgensen antisentido artificial la flor no era blanca solo tenia menos color. El gen lin-4 produce RNA que se procesa a un RNA pequeño que regula lin-14 en nematodos. Ruvkun y Al eliminar lin-4 o su Ambros producto, se produce un fenotipo homeocrónico (una célula repite perpetuamente su linaje sin diferenciarse). Descubrieron que el fenómeno de interferencia (silenciamiento sistémico amplificado) se debe a un RNA de doble hebra Fire y complementario al gen de Mello interés. (Estos animales tienen ese mecanismo gracias a una una RNAPpol que usa RNA de molde).  RNA de interferencia (RNAi) Es el silenciamiento de la expresión génica gatillado por la presencia de un dsRNA homologo a una porción del gen, generalmente resulta del corte y degradación del mRNA del gen blanco, pero también puede resultar del bloqueo de la traducción de un mRNA intacto. -> Por lo tanto el efecto neto es que no se produce proteína. Se silencia en el citoplasma. Los RNAi pueden ser endógenos codificados en regiones 3’ UTR o en intrones, o exógenos. La maquinaria puede ser RITS (para modificaciones de la estructura de la cromatina) o RISC (para inhibición de la traducción de mRNA o con 100% de complementariedad degradación de RNA secuencia especifica). RISC detecta un dsRNA de 20 nucleótidos con extremos 3’ overhang, carga una de las hebras, y escanea los mRNA. Si se encuentra una secuencia 100% complementaria entonces el mRNA se cliva. Si se encuentra una secuencia no 100% complementaria, entonces se bloquea la transcripción. - dsRNA (exógenos, “gran” tamaño 1-0.2Kb) - siRNA (endógenos y exógenos, pequeños 21nt) - microRNA (endógenos. Requiere Drosha/Pasha para madurar pri-miRNA, pre- miRNA (~70nt), miRNA 20- 23nt) - Mirtrons (como miRNA pero codificados en intrones y El microRNA corresponde a un fragmento de una cadena que se combina con proteínas no requieren Drosha/Pasha. para formar el complejo RISC que captura un RNAm que si es 100% complementario Usan la maquinaria de gatilla la degradación de RNAm pero si no es así se bloquea el movimiento del ribosoma splicing) a lo largo del RNAm que deteniendo la traducción.  microRNA (miRNA): Definiciones y procesamiento Endógenos. Requiere Drosha/Pasha para madurar pri-miRNA, pre-miRNA (~70nt), miRNA 20-23nt Localización en el genoma Pueden estar en intrones (de regiones codificantes o no), en exones (codificantes o no) Microprocesador: 1er corte: Drosha y Pasha (en el núcleo) Reconocen el interfaz entre el dsRNA y ssRNA, Drosha es la RNAsa III reconocida por Pasha que reconoce el interfaz permitiendo su procesamiento. 2do corte: DICER Reconoce extremo 3’ overhang, la interacción no es secuencia especifica y el corte se guía por el tamaño por lo tanto todos los miRNA miden aproximadamente 23-26 nt. Si las interacciones no son secuencia especifica ya que DICER interactúa con los fosfatos de la hebra ¿Cuál hebra usar?  microRNA (miRNA): Definiciones y procesamiento Si las interacciones no son secuencia especifica ya que DICER Hebra interactúa con los fosfatos de la escaneada hebra ¿Cuál hebra usar? (mRNA) El complejo RISC detecta los extremos 3’ y une a la hebra menos estable termodinámicamente en su extremo 5’ (hebra guía), es decir, la hebra con la menor energía de unión.  microRNA (miRNA): AGO AGO2 es necesario para siRNAs y AGO1 para miRNAs Ambas proteínas se localizan en P-bodies, Proteína argonauta (AGO) en RISC permite la hibridación de la compartimentos citoplasmáticos donde se secuencia semilla (7 u 8 nt) de la hebra guía con un mRNA procesa el RNA. complementario. Argonauta (AGO) genera el silenciamiento, si la complementariedad Constructo que fluorece y es de 100% la hebra se corta si no se queda ahí. se une a miRNA Interacción generalmente en el 3´UTR de RNAm blanco. Esta región al no se codificante se encuentra conservada, por lo que un miRNA puede silenciar a más de un mRNA. miRNA AGO2 No tiene interacción con el AGO2 posee actividad Slicer, es decir, corta el miRNA mRNA diana cuando el siRNA tiene complementariedad perfecta, lo que lleva a su degradación y silenciamiento eficiente del gen. En cambio, AGO1 regula la función de los miRNA, los cuales suelen tener complementariedad parcial con el mRNA.  endo-siRNA Origen del siRNA Endógeno: Se genera por la transcripción convergente (complementariedad perfecta) de elementos repetitivos como transposones o pseudogenes, que producen RNA en direcciones opuestas y dan lugar a RNA de doble hebra (dsRNA). Procesamiento del dsRNA: siRNA exógeno: Un dsRNA exógeno es procesado por AGO1-4 para generar un siRNA exógeno. siRNA endógeno: Un dsRNA endógeno o un hairpin RNA es procesado por DICER, formando siRNA endógenos de ~20 nt que se carga en AGO2. Función del siRNA en la cromatina: Los siRNA, junto con el complejo RITS (RNA-Induced Transcriptional Silencing), inhiben la transcripción en regiones específicas de la cromatina. Facilitan la metilación de la lisina 9 en la histona H3 (H3K9), lo que lleva a la compactación de la cromatina y la formación de heterocromatina, resultando en un silenciamiento génico duradero. Por lo tanto podrían evitar el movimiento de un retrotramposon  piRNA: Los piRNA se producen en la línea germinal y tienen un La región que fue papel fundamental en la cortada se una a Reconoce transcrito eliminación de marcas AGO3 antisentido piRNA epigenéticas durante la gametogénesis. Los piRNA impiden el desplazamiento de transposones en el desarrollo temprano cuando no hay silenciamiento, y se asocian a proteína PIWI de tipo argonauta. Causa corte de RNAm La región que fue Los piRNA poseen una U en tramposon cortada se una a su extremo 5’. PIWI No se conocen por qué hay locus objetivo de piRNA. Aplicaciones experimentales Se pueden cruzar moscas con constructos diseñados para obtener descendencia con un gen silenciado. Un constructo posee un promotor regulado por un enhancer (por ejemplo, UAS regulado por GAL4) y, río abajo, un fragmento de DNA idéntico al gen que se desea silenciar, seguido por una secuencia para un loop y la secuencia complementaria. Esto permite formar un hairpin RNA en la transcripción, lo que induce el silenciamiento del gen específico mediante mecanismos de RNAi. La otra línea de moscas aporta el enhancer (como GAL4) para activar el promotor del primer constructo. Para identificar si un miRNA actúa sobre un gen blanco, se puede insertar la región 3' UTR con la secuencia semilla hipotética del miRNA en un gen reportero, como GFP, junto con el propio miRNA. Si la fluorescencia del GFP disminuye, esto indica que el miRNA actúa sobre la secuencia semilla, bloqueando la traducción del gen reportero. Además, existen pseudogenes con secuencias similares a los genes blanco de algunos miRNA. Cuando estos pseudogenes se sobreexpresan, compiten con los genes funcionales por la unión a la maquinaria del miRNA, desplazando al gen blanco e impidiendo la inhibición de su expresión. Este fenómeno se conoce como RNA endógeno competidor (ceRNA). Ayudantía Clase 16: REGULACIÓN DE LA EXPRESIÓN GÉNICA POSTRANSCRIPCIONAL: IRNA Y RNAS NO CODIFICANTES. Josefa Vallejos Aravena Curso de Biología Molecular 2024 Facultad de Ciencias, Universidad de Chile