Actividad 8 - Metabolismo de Proteínas PDF

Fisicoquímica aplicada a la fisiología veterinaria – Metabolismo de proteínas DIGESTIÓN Y ABSORCIÓN I Universidad Nacional de La Plata Facultad de Ciencias Veterinarias Curso Fisicoquímica aplicada a la fisiología veterinaria METABO...

Fisicoquímica aplicada a la fisiología veterinaria – Metabolismo de proteínas DIGESTIÓN Y ABSORCIÓN I Universidad Nacional de La Plata Facultad de Ciencias Veterinarias Curso Fisicoquímica aplicada a la fisiología veterinaria METABOLISMO DE PROTEÍNAS 1 Fisicoquímica aplicada a la fisiología veterinaria – Metabolismo de proteínas DIGESTIÓN Y ABSORCIÓN I Metabolismo del nitrógeno El nitrógeno (N) junto con el C, H y O participa en la constitución de las biomoléculas fundamentales de los organismos. El N forma parte de un grupo de compuestos orgánicos de gran importancia biológica como lo son las proteínas y los nucleótidos. El N molecular (N2) atmosférico, es el gas más abundante (78%) pero es inerte debido a su triple enlace que lo estabiliza. Para poder ser incorporado por los animales, el N atmosférico debe ser “fijado” mediante una cadena de reacciones. En primer lugar, el nitrógeno debe ser reducido de N2 a NH3 (amoniaco) por medio de la amonificación, en este proceso los compuestos nitrogenados encontrados en el suelo, productos de la descomposición de materiales orgánicos complejos tales como proteínas, aminoácidos, ácidos nucleicos y nucleótidos son degradados a compuestos simples por bacterias y hongos del suelo. Estos microorganismos liberan el exceso de nitrógeno en forma de amoniaco o ion amonio (NH4+). Posteriormente, el NH3 es oxidado primero a nitritos (NO2-) por el grupo de bacterias llamado bacterias oxidantes de amoniaco o nitrosificantes y luego a nitratos (NO32-) por otro grupo llamado bacterias oxidantes de nitritos o bacterias nitrificantes verdaderas, por un proceso llamado nitrificación. Este proceso es generador de energía, la cual es utilizada por estas bacterias como fuente de energía primaria. Luego las plantas asimilan la mayor parte del nitrato absorbido por sus raíces en compuestos orgánicos nitrogenados (Fig. 1). La primera etapa de este proceso es la reducción de nitrato a nitrito por medio de la enzima nitrato reductasa, dado que el nitrito formado es altamente reactivo y un ion potencialmente tóxico, en los cloroplastos y en los plástidos, la enzima nitrito reductasa reduce el nitrito a amonio y luego este, es incorporado rápidamente a los esqueletos carbonados para formar aminoácidos gracias a la glutamina sintetasa (véase más adelante). De esta forma, los vegetales forman estructuras biológicas (aminoácidos, proteínas y demás compuestos) y esto pasa a formar parte de la cadena alimentaria. 2 Fisicoquímica aplicada a la fisiología veterinaria – Metabolismo de proteínas DIGESTIÓN Y ABSORCIÓN I Figura 1. Ciclo del nitrógeno. El N2 atmosférico se convierte por medios naturales o industriales en amoniaco. En la naturaleza, los microorganismos forman amoniaco, nitritos y nitratos que pueden ser utilizados por las plantas. Balance de Nitrógeno En el animal, la principal fuente de nitrógeno son las proteínas de la dieta. A diferencia de los glúcidos y lípidos, estos compuestos no se almacenan como reserva energética, por lo que las células deben establecer un equilibrio entre anabolismo y catabolismo, es decir un balance entre la síntesis y degradación de las proteínas. Por lo tanto, un animal adulto sano que ingiere una dieta equilibrada en proteínas se encuentra generalmente en situación de “equilibrio nitrogenado”, un estado en que la cantidad de nitrógeno ingerida por día es igual a la cantidad excretada por heces, orina y sudor, sin que se produzca ningún cambio neto en la cantidad de nitrógeno del organismo. Sin embargo, existen ciertas condiciones (fisiológicas o patológicas) que hacen que el organismo se halle en desbalance nitrogenado negativo o positivo. En la situación de balance de nitrógeno negativo se excreta mayor cantidad de nitrógeno del que se ingiere, esto se da en la inanición, la desnutrición proteica y en ciertas enfermedades que cursan con catabolismo un catabolismo aumentado. Durante la inanición prolongada, los esqueletos carbonados de los aminoácidos son utilizados en la gluconeogénesis y el amoniaco liberado de los aminoácidos es excretado en forma de urea y no se reincorpora a las proteínas. También puede darse un equilibrio negativo durante la vejez, la fiebre severa, proteólisis en la diabetes 3 Fisicoquímica aplicada a la fisiología veterinaria – Metabolismo de proteínas DIGESTIÓN Y ABSORCIÓN I no controlada y en las neoplasias, donde el catabolismo se encuentra exacerbado. En el otro extremo, el balance de nitrógeno positivo se da cuando se produce mayor consumo y menos excreción, por lo que hay un aumento en el conjunto total de proteínas del cuerpo. Tal caso se da en crías en crecimiento puesto que están en desarrollo corporal y deben incorporar más aminoácidos para síntesis proteica. También ocurre durante la preñez (Tabla 1). Tabla 1. Balance de nitrógeno Balance de nitrógeno Balance de nitrógeno positivo negativo Inanición Etapa de cría (crecimiento y Desnutrición proteica desarrollo) Senectud Animales gestantes Fiebre severa Hipotiroidismo Diabetes no controlada Neoplasias avanzadas Período post-quirúrgico Hipertiroidismo Traumatismos Quemaduras extensas Sepsis e infecciones Aminoácidos esenciales y no esenciales Los organismos solo pueden sintetizar 11 de los 20 α-L-aminoácidos necesarios para la síntesis de proteínas. Aquellos aminoácidos que no pueden ser sintetizados por el organismo se denominan “esenciales”, ya que deben obtenerse de la dieta (Tabla 2). Tabla 2. Listado de aminoácidos esenciales y no esenciales para el organismo Aminoácidos esenciales Aminoácidos no esenciales Arginina Metionina Alanina Glicina Histidina Fenilalanina Asparagina Hidroxiprolina Isoleucina Treonina Aspartato Hidroxilisina Leucina Triptófano Cisteína Prolina Lisina Valina Glutamato Serina Glutamina Tirosina 4 Fisicoquímica aplicada a la fisiología veterinaria – Metabolismo de proteínas DIGESTIÓN Y ABSORCIÓN I Los aminoácidos arginina, metionina y fenilalanina son considerados esenciales por razones no directamente relacionadas con la carencia de la síntesis. La arginina es sintetizada por las células pero en un rango que es insuficiente para resolver las necesidades de crecimiento del cuerpo y de la mayoría que se sintetiza es procesada para formar la urea, o teniendo en cuenta situaciones donde hay una gran síntesis de proteínas (preñez, crecimiento). La metionina es requerida en grandes cantidades para producir cisteína. De manera similar, la fenilalanina es requerida en grandes cantidades para formar tirosina, si este aminoácido no es adecuadamente provisto en la dieta. Valor biológico de las proteínas El valor biológico de las proteínas de la dieta indica la proporción de aminoácidos esenciales que estas contienen. Las proteínas de origen animal, como las provenientes de huevo, leche y carnes generalmente tienen un mayor valor biológico que las proteínas vegetales, en general las proteínas vegetales son deficientes en lisina, metionina y triptófano y son menos concentradas y digeribles que las proteínas de origen animal. El valor biológico se define como la fracción de nitrógeno absorbido y retenido por el organismo y representa la capacidad máxima de utilización de una proteína. Así mismo, este valor define la calidad de una proteína, por lo tanto, las proteínas de mayor calidad poseen alto valor biológico por ejemplo las proteínas de la soja, que poseen un valor biológico inferior al de la carne roja. Catabolismo de proteínas Constantemente en las células, se produce el recambio de proteínas ya sea realizando degradación o resíntesis de estas. Generalmente las proteínas son muy estables, pero muchas de ellas son de corta duración, en particular aquellas que participan en la regulación metabólica. Por otro lado, las células deben eliminar proteínas dañadas como aquellas defectuosas debido a errores en la traducción o mal plegado, o proteínas que sufrieron daño oxidativo, así como las alteradas con el paso del tiempo. Para distinguir que proteínas deben degradarse de las que no, existe la ubiquitina, una proteína pequeña que se encuentra en todas las células eucariotas y se encarga de marcar las proteínas para su destrucción. Para ello, un residuo de glicina carboxiterminal de ubiquitina se une covalentemente a los grupos amino de varios residuos de lisina en una proteína destinada a degradarse. La energía para la formación de estos enlaces proviene de la hidrólisis del ATP. 5 Fisicoquímica aplicada a la fisiología veterinaria – Metabolismo de proteínas DIGESTIÓN Y ABSORCIÓN I En la unión de ubiquitina a la proteína participan tres enzimas: enzima activadora de ubiquitina, o E1; enzima conjugadora de ubiquitina, o E2; y ubiquitina-proteína ligasa, o E3. Primero, el grupo carboxilato C-terminal de ubiquitina se une a un grupo sulfhidrilo de E1 mediante un enlace tioéster. Esta reacción impulsada por ATP, une al carboxilato C-terminal de ubiquitina con la liberación de pirofosfato, y la ubiquitina se transfiere a un grupo sulfhidrilo de un residuo de cisteína en E1. La ubiquitina activada se transporta luego a un grupo sulfhidrilo de E2, reacción catalizada por la propia E2. Finalmente, E3 cataliza la transferencia de ubiquitina de E2 a un grupo amino en la proteína diana (Fig. 2). Figura 2. Conjugación de la ubiquitina con la proteína blanco. La enzima E1 adenila la ubiquitina (Ub) (1) y la une residuos de cisteína (2). A continuación, la ubiquitina se transfiere a un residuo de cisteína de E2. (3). Finalmente, la E3 transfiere la ubiquitina a un residuo de lisina en la proteína diana (4a y 4b). Lo que determina que una proteína se “ubiquitine” es una secuencia específica de aminoácidos que indican que una proteína debe degradarse. Por ejemplo, una proteína con metionina en su extremo N terminal típicamente tiene una vida media de más de 20 horas, mientras que una con arginina en esta posición tiene una vida media de aproximadamente 2 minutos. Un residuo N-terminal altamente desestabilizador, como la arginina o la leucina, favorece la ubiquitinación rápida, mientras que un residuo estabilizante como la metionina o la prolina no lo hace. Algunas proteínas destinadas a la degradación se marcan añadiendo a sus extremos prolina, glutamato, serina y treonina y posteriormente son identificadas por E3. Posteriormente, el “verdugo” de las proteínas es el complejo proteico llamado proteasoma cuyas subunidades están dispuestas en forma de cuatro anillos de siete subunidades cada uno, que se apilan formando una estructura similar a un barril. La proteólisis se realiza de la siguiente forma: la proteína sustrato debe tener al menos cuatro ubiquitinas unidas para ser reconocida. Las enzimas desubiquitinizantes separan las ubiquitinas y las subunidades con actividad de ATPasa, utilizando la energía del ATP, producen el desplegamiento de la proteína y la van haciendo pasar hacia la cámara interior. A medida que la proteína va atravesando la cámara, se 6 Fisicoquímica aplicada a la fisiología veterinaria – Metabolismo de proteínas DIGESTIÓN Y ABSORCIÓN I produce la hidrólisis de los enlaces peptídicos y los péptidos así formados son liberados. Los péptidos formados tienen una vida media muy corta, pues son atacados rápidamente por proteasas y aminopeptidasas. Cada proteasoma procesa solamente un sustrato a la vez (Fig.3Figura 3). Figura 3. Degradación de proteínas ubiquitinizadas por acción del proteasoma. Aspectos generales de la degradación de aminoácidos Como se mencionó anteriormente, los procesos de síntesis y degradación de proteínas en el organismo animal son simultáneos y se puede considerar que existe un pool de aminoácidos que está en constante renovación (Fig. 4). Estos constituyentes de un fondo común o “pool de aminoácidos” se encuentran en la circulación sanguínea y se forma a partir de los aminoácidos introducidos con la dieta, los liberados por la degradación de proteínas endógenas y los sintetizados de novo. Cuando se debe sintetizar nuevos aminoácidos, proteínas o compuestos nitrogenados, las células recurre a este pool. El destino más importante de los aminoácidos es su incorporación a cadenas polipeptídicas durante la síntesis de proteínas. En segundo lugar, muchos aminoácidos son utilizados para la síntesis de compuestos nitrogenados no proteicos como hormonas, vitaminas, 7 Fisicoquímica aplicada a la fisiología veterinaria – Metabolismo de proteínas DIGESTIÓN Y ABSORCIÓN I catecolaminas, purinas y pirimidinas, etc. Finalmente, los aminoácidos en exceso, como no pueden almacenarse, se utilizan principalmente con fines energéticos. En este caso, sufren primero la pérdida de la función amina, lo cual deja libre el esqueleto carbonado. El grupo nitrogenado que se desprende como amoniaco debe ser eliminado. Las cadenas carbonadas siguen diferentes rutas, pueden transaminarse (reincorporar el grupo amino) para forman nuevamente aminoácidos o pueden dirigirse al ciclo de Krebs para oxidarse completamente hasta CO2 y H2O y producir energía. Alternativamente, dichas cadenas pueden ser derivadas a las vías de gluconeogénesis (aminoácidos glucogénicos) o de síntesis de ácidos grasos o cuerpos cetónicos (aminoácidos cetogénicos). Figura 4. Pool de aminoácidos y opciones metabólicas de los aminoácidos y de los esqueletos carbonados y grupo amino constituyente. Formas moleculares de excreción de restos nitrogenados Los organismos excretan los desechos nitrogenados resultantes del metabolismo de aminoácidos en una de tres formas (Fig. 5). Los organismos acuáticos excretan directamente el amoniaco, al ser esta molécula muy soluble en agua, se difunde con rapidez y se produce una eliminación continua y, por lo tanto no se acumula. Esta difusión se realiza a través de las membranas de las agallas gracias al gran volumen de agua que circula por ellas. Este es el caso de los animales amoniotélicos, por ejemplo, los peces óseos e invertebrados acuáticos. Las bacterias y protozoos también liberan el amoniaco al medio acuoso. Donde el agua es menos abundante, el amoniaco debe transformarse en una molécula menos tóxica, además que su excreción necesita menos agua. Uno de estos productos es la urea, la cual es excretada por la mayoría de los vertebrados terrestres, en este caso los animales son ureotélicos. El ion amonio es un compuesto muy tóxico que debe convertirse en el hígado en urea, en el llamado ciclo de la urea. Esta pasa al torrente sanguíneo y es eliminada por el riñón 8 Fisicoquímica aplicada a la fisiología veterinaria – Metabolismo de proteínas DIGESTIÓN Y ABSORCIÓN I en la orina. La urea es muy soluble en agua, pero la excreción de soluciones con urea podría provocar una gran pérdida de agua y causar deshidratación, para evitar esto, estos animales poseen sistemas excretores que permiten eliminar la urea conservando el agua. El otro producto posible de excreción es el ácido úrico, este es el caso de los animales uricotélicos como las aves y reptiles terrestres. Estos animales tienen disponibilidad de agua limitada, puesto que la excreción de urea por la orina necesita un gran volumen de agua, esta circunstancia haría imposible el vuelo de las aves y provocaría una deshidratación de los reptiles que habitan en hábitats áridos. Para evitar esto, el amoniaco se convierte en ácido úrico, compuesto insoluble que se excreta en forma de masa semisólida de cristales de ácido úrico en las heces. Figura 5. Productos de desechos nitrogenados. Catabolismo de los aminoácidos Antes que suceda la degradación, los aminoácidos se interconvierten entre ellos, transfiriendo el grupo amino de un esqueleto carbonado a otro, por medio de la reacción de transaminación. Luego por la reacción de desaminación, se remueve el grupo α-amino de la cadena carbonada. El grupo amino seguirá un camino distinto del que tomará el resto carbonado e ingresará al ciclo de la urea (Fig. 6). Figura 6. Flujo general de nitrógeno en el catabolismo de aminoácidos. 9 Fisicoquímica aplicada a la fisiología veterinaria – Metabolismo de proteínas DIGESTIÓN Y ABSORCIÓN I Reacción de transaminación La reacción de transaminación implica la transferencia de un grupo α-amino de un aminoácido hacia un α-cetoácido. El aminoácido se convierte en un cetoácido y el cetoácido aceptor del grupo amino se convierte en el aminoácido correspondiente (Fig. 7). Esta transferencia es catalizada por las enzimas aminotransferasas o también llamadas transaminasas. Las transaminaciones son reversibles y pueden ocurrir tanto en el catabolismo como en la síntesis de aminoácidos. Figura 7. Reacción general de transaminación. Todas las aminotransferasas tienen como grupo prostético al fosfato de piridoxal, una coenzima derivada de la piridoxamina (vitamina B6). El fosfato de piridoxal tiene un anillo de piridina (que es ligeramente básica) al que está unido un grupo OH (que es ligeramente ácido). La coenzima forma con el aminoácido un compuesto intermediario, uniéndose a éste por un enlace –CH=N–, denominado Base de Schiff (Fig. 8). Intervienen además interacciones iónicas e hidrófobas para estabilizar el complejo. El piridoxal fosfato actúa como aceptor transitorio y transportador del grupo amina en el proceso de transferencia de la transaminación. Figura 8. El fosfato de piridoxal forma unión de base Schiff con el grupo amino de un residuo de lisina en el sitio activo de la enzima. Al llegar el aminoácido, se forma un nuevo enlace de base de Schiff. La mayoría de los aminoácidos sufren transaminación, excepto lisina, treonina, prolina e hidroxiprolina. Para un determinado par aminoácido/α-cetoácido, cada reacción es catalizada por una enzima específica, cuyo nombre deriva de los compuestos participantes en la transferencia: ejemplos de ello son la glutámico oxaloacético transaminasa (GOT), también llamada aspartato aminotransferasa (AST), forma oxaloacetato y glutamato a partir de aspartato y α-cetoglutarato. La glutámico piruvato transaminasa (GPT) o alanina aminotransferasa (ALT), produce piruvato, utilizando alanina (Fig. 9). 10 Fisicoquímica aplicada a la fisiología veterinaria – Metabolismo de proteínas DIGESTIÓN Y ABSORCIÓN I Figura 9. Reacciones de transaminación mediante GOT o ASAT (arriba) o GPT o ALAT (abajo). Estas dos enzimas, son particularmente abundantes en hígado, músculo y corazón, razón por la cual en ciertos procesos patológicos que afecten a estos órganos, produciendo una injuria tisular, se liberan desde sus compartimentos celulares, produciendo un aumento de sus concentraciones en plasma. Su cuantificación en sangre sirve para diagnóstico y pronóstico. Como ejemplo el aumento de GOT en plasma es señal de injuria hepática severa. Algo similar ocurre con el daño del miocardio, donde se produce un aumento de ambas transaminasas en apenas 6 horas luego de un infarto agudo, permaneciendo elevadas durante varios días. Ciclo glucosa-alanina La mayor parte de la degradación de los aminoácidos tiene lugar en el hígado, sin embargo otros tejidos pueden degradarlos. Es el caso del músculo, que utiliza aminoácidos de cadena ramificada como fuente de combustible durante el ejercicio prolongado y el ayuno. El nitrógeno se procesa igual que en el hígado, primeramente removiendo el nitrógeno del aminoácido, sin embargo, el músculo carece de las enzimas del ciclo de la urea, por lo que el nitrógeno debe liberarse en una forma no tóxica que el hígado pueda absorber y convertir en urea. El piruvato es transaminado a alanina por la alanina transaminasa en el músculo que se libera a la sangre, donde el hígado absorbe la alanina y la convierte en piruvato por transaminación, y así el piruvato puede entonces ser sustrato de la gluconeogénesis y el grupo amino se elimina en el ciclo de la urea. Este proceso es referido como el ciclo de glucosa-alanina (Fig. 10). 11 Fisicoquímica aplicada a la fisiología veterinaria – Metabolismo de proteínas DIGESTIÓN Y ABSORCIÓN I Este mecanismo, recuerda al ciclo de Cori. Sin embargo, a diferencia del ciclo de Cori, el piruvato no se reduce a lactato por el NADH + H+ y, por lo tanto, hay más electrones de alta energía disponibles para la fosforilación oxidativa. Figura 10. Ciclo de la glucosa-alanina. Desaminación oxidativa Una vez formado el L-glutamato por transferencia de los grupos amino de los aminoácidos al α-cetoglutarato mediante transaminación, el grupo nitrogenado de este aminoácido puede ser separado por un proceso denominado desaminación oxidativa. Esta reacción es catalizada por la L-glutamato deshidrogenasa, una enzima presente en todos los mamíferos que utiliza como coenzima NAD+ o NADP+ y forma α-cetoglutarato y amoniaco (NH3), que debido al pH fisiológico del medio, recibe un protón, presentándose casi en su totalidad como ion amonio (NH4+). La reacción procede por deshidrogenación del enlace C-N, formando un intermediario aldimina seguida de hidrólisis (Fig. 11). La reacción es reversible, por lo que el amonio puede volver unirse al α-cetoglutarato para formar glutamato, pero la dirección de la reacción está determinada por las concentraciones de reactivos y productos. Normalmente, la reacción es impulsada por la rápida eliminación del ion amonio. En la reacción inversa, la glutamato deshidrogenasa es importante en la formación de glutamato, un principal donante amino para otros aminoácidos en transaminaciones subsecuentes, lo cual formaría uno de los 20 aminoácidos requeridos para la síntesis de proteínas. Los múltiples papeles del glutamato en el balance del nitrógeno lo convierten en la puerta de acceso” del amoniaco libre a los grupos amino de la mayoría de los aminoácidos; y a la inversa, es la “puerta de salida” del nitrógeno de estos compuestos. 12 Fisicoquímica aplicada a la fisiología veterinaria – Metabolismo de proteínas DIGESTIÓN Y ABSORCIÓN I Sin embargo, se debe reconocer que la reacción de formación de α-cetoglutarato es un proceso crucial anaplerótico que enlaza el metabolismo del aminoácido con la actividad del ciclo de Krebs. Por lo tanto, la glutamato deshidrogenasa proporciona una fuente de carbono oxidable usada para la producción de energía así como un portador de electrones, el NADH + H+. Figura 11. Reacción de desaminación oxidativa catalizada por glutamato deshidrogenasa. Regulación de la glutamato deshidrogenasa La L-glutamato deshidrogenasa localizada en las mitocondrias del hígado, sitio donde tendrán lugar las reacciones iniciales del ciclo de formación de urea, está altamente regulada. La compartimentalización permite que el amonio no se escape, ya que es tóxico. La enzima también participa en la remoción del grupo amino de aquellos aminoácidos que son requeridos para la producción de glucosa cuando se agotan las reservas. Basándose en esto, la L-glutamato deshidrogenasa se regula alostéricamente. Cuando es necesaria la oxidación de aminoácidos para la producción de energía, la actividad en la dirección de la degradación del glutamato es incrementada por el ADP y GDP, que son indicadores de un estado de bajo nivel de energía en la célula. Por el contrario, el GTP, ATP, palmitoil-CoA, son indicativos de un nivel de energía alto, siendo activadores alostéricos en la dirección de la síntesis de glutamato. El aminoácido leucina también es activador alostérico de la enzima (Fig. 12). Figura 12. Regulación de la glutamato deshidrogenasa. 13 Fisicoquímica aplicada a la fisiología veterinaria – Metabolismo de proteínas DIGESTIÓN Y ABSORCIÓN I Desaminación no oxidativa En este tipo de desaminación, se metabolizan aquellos aminoácidos que poseen grupos polares (serina y treonina) proceso catalizado por enzimas deshidratasas, o aminoácidos azufrados (cisteína y metionina) que mediante desulfidrasas eliminan el grupo sulfhidrilo de la cadena lateral de estos aminoácidos. En este tipo de desaminaciones se generan intermediarios que se relacionan con otras vías metabólicas (principalmente piruvato). Toxicidad del amoniaco El amoniaco producido por las bacterias entéricas (absorbido hacia la sangre venosa porta) y el producido por los tejidos, se eliminan con rapidez de la circulación por medio del hígado que lo convierten en urea. Así, en circunstancias fisiológicas únicamente hay cantidades traza (10 a 20 μg/dL) en la sangre periférica. Esto es esencial, debido a que el amoniaco es tóxico para el Sistema Nervioso Central. Como el hígado es el principal órgano encargado de la eliminación del amoniaco, cuando hay un compromiso de la función hepática, la amonemia (nivel de amoniaco/amonio en sangre) asciende y se produce un cuadro de intoxicación, que pude llevar al coma e incluso la muerte. Como se mencionó anteriormente, al pH fisiológico alrededor del 99% del amoniaco se convierte en ion amonio, el cual puede atravesar la barrera hematoencefálica y las membranas celulares. Una vez en el cerebro, es convertido a glutamato por vía de la glutamato deshidrogenasa “drenando” el α-cetoglutarato y disminuyendo el oxaloacetato deteniéndose la actividad del ciclo de Krebs. Esto deprime la fosforilación oxidativa, el descenso de ATP y ocasiona daños celulares irreparables y la muerte de las células nerviosas. Además, el incremento de glutamato conduce a la formación de glutamina. Esto agota las reservas de glutamato del tejido nervioso y puesto que el glutamato es un neurotransmisor y un precursor para la síntesis de γ-aminobutirato (GABA) otro neurotransmisor, las reducciones del glutamato cerebral afectan la actividad neuronal. Por otro lado, la acumulación de glutamina en el cerebro, especialmente en astrocitos, produce efecto osmótico (debido a que la glutamina es un metabolito orgánico con capacidad osmótica), el volumen de líquido dentro de las células gliales aumenta dando por resultado edema cerebral y aumentando la presión intracraneana. 14 Fisicoquímica aplicada a la fisiología veterinaria – Metabolismo de proteínas DIGESTIÓN Y ABSORCIÓN I Transporte de amoniaco Como el amoniaco libre en sangre es tóxico, es transportado preferentemente en forma de grupos amina o amida. La glutamina es el aminoácido encargado de transportar el amonio ya que el grupo amida es un importante donante de nitrógeno. El glutamato y el amoniaco son los sustratos de la glutamina sintetasa. Puesto que la síntesis de enlace amida está acoplada a la hidrólisis de ATP hacia ADP y Pi, la reacción favorece fuertemente la síntesis de glutamina. Por otro lado, la eliminación del grupo amida es catalizada por la glutaminasa (Fig. 13). Al ciclo de la urea Figura 13. Síntesis de glutamina y conversión de glutamina en glutamato. El hígado contiene ambas enzimas situadas en diferentes segmentos de este órgano. Los hepatocitos periportales contienen glutaminasa y las enzimas del ciclo de la urea mientras que los hepatocitos perivenosos contienen glutamina sintetasa, esta localización es importante ya que algunos iones amonios escapan de la conversión a urea y esta enzima los capta formando glutamina, la cual posteriormente se dirige a los hepatocitos periportales entregando el nitrógeno al ciclo de la urea (Fig. 14). 15 Fisicoquímica aplicada a la fisiología veterinaria – Metabolismo de proteínas DIGESTIÓN Y ABSORCIÓN I Figura 14. Ciclo intercelular de la glutamina en el hígado. Una reacción similar a la glutaminasa es catalizada por la asparaginasa, que hidroliza la asparagina a aspartato y amoniaco (Fig. 15). En su formación, el grupo amida de la asparagina proviene de la glutamina y no del amoniaco libre como en la síntesis de la primera. La asparagina es sintetizada en la mayoría de las células por una asparagina sintetasa dependiente de ATP, cuyos sustratos son aspartato y glutamina; y sus productos asparagina y glutamato. La función de la asparagina es igual a la de la glutamina, pero con menor intensidad, más bien es un refuerzo al ciclo intercelular de la glutamina. Un transportador de amoniaco extra lo constituye la alanina, la cual, en su ciclo (ciclo de la alanina) moviliza no solo su esqueleto carbonado hasta el hígado para que este realice gluconeogénesis, sino también su grupo amino para que sea transaminado a glutamato, posteriormente desminado de este aminoácido y sea convertido en urea. Figura 14. Reacción de formación de asparagina. 16 Fisicoquímica aplicada a la fisiología veterinaria – Metabolismo de proteínas DIGESTIÓN Y ABSORCIÓN I En el cerebro, la glutamina tiene la función de retirar el NH3 del lugar mientras que en riñón ejerce un rol importante en las células del tubulares, por medio de la glutaminasa, genera NH3 que es utilizado como un buffer para la estabilización del pH sanguíneo. Así, cuando disminuye el pH (como en la acidosis), las moléculas de NH3 aceptan estos protones y son excretadas en forma de NH4+ hacia la luz tubular (utilizando un intercambiador Na/NH4+) mitigando la acidosis (Fig. 16). Figura 15. Participación de la glutamina en el epitelio tubular distal en el aporte NH 3 mediante su desaminación para la regulación de pH. Ciclo de la urea En los mamíferos terrestres, el ciclo de la urea se lleva a cabo exclusivamente en el hígado. Los dos átomos de nitrógeno de cada molécula de urea provienen de dos fuentes, una de ellas es el amoniaco libre y el otro se corresponde al grupo amino del aminoácido aspartato, y el C=O proviene del HCO3-. El ciclo se inicia y finaliza en el aminoácido ornitina, a diferencia de lo que sucede en el ciclo de Krebs, en donde los carbonos del oxaloacetato al principio son diferentes de los del final, los carbonos de la ornitina final son los mismos que poseía la molécula inicialmente. El ciclo de la urea propuesto por Hans Krebs y Kurt Henseleit en 1932, fue la primera vía metabólica cíclica descubierta (de hecho, fue descubierta antes que ciclo de los ácidos tricarboxílicos). Cinco enzimas participan de la síntesis de urea. El N-acetilglutamato funciona como un activador enzimático mientras que otros aminoácidos funcionan como acarreadores de átomos que se convertirán en urea. La principal función metabólica de la ornitina, la citrulina y el argininosuccinato es la síntesis de urea, tanto la ornitina como la citrulina son aminoácidos no constituyentes de proteínas, por lo que se los consideran aminoácidos no proteicos. La ornitina consumida en la reacción 2 se regenera en la reacción 5 y, de este modo, no hay pérdida o ganancia neta de ornitina, citrulina, argininosuccinato o arginina. Sin embargo, hay consumo de ion amonio, CO2, ATP y aspartato. Algunas reacciones de la síntesis de urea ocurren en la matriz de la mitocondria y otras en el citosol. 17 Fisicoquímica aplicada a la fisiología veterinaria – Metabolismo de proteínas DIGESTIÓN Y ABSORCIÓN I Etapas del ciclo de la urea -Reacción 1: Inicio del ciclo: La síntesis de urea inicia con la condenación de CO2, amoniaco y 2 ATP, para formar carbamoil fosfato, reacción catalizada por la carbamoil fosfato sintetasa I (CPSI). Existen dos formas de CPS: la carbamoil fosfato sintetasa I, de la síntesis de la urea, es una enzima mitocondrial hepática y la carbamoil fosfato sintetasa II (CPSII), una enzima citosólica que emplea glutamina en vez de amoniaco como donante de nitrógeno y participa en la biosíntesis de pirimidinas. La CPSI es la enzima limitante de la velocidad del ciclo de la urea. Esta enzima reguladora es activa sólo en presencia del activador alostérico N-acetilglutamato, cuya unión induce un cambio conformacional que aumenta la afinidad de la sintetasa por el ATP. La reacción consiste en la fosforilación de HCO3- para formar carboxifosfato y luego reacciona con NH3 para formar ácido carbámico. Finalmente, una segunda molécula de ATP fosforila el ácido carbámico para formar carbamoil fosfato. El consumo de dos moléculas de ATP hace que la síntesis de carbamoil fosfato sea irreversible (Fig. 17). Figura 16. Reacción inicial de formación de carbamoil fosfato catalizada por la carbamoil fosfato sintetasa I. -Reacción 2: formación de citrulina: El grupo carbamoil tiene un alto potencial de transferencia debido a su enlace anhídrido. La L-ornitina transcarbamoilasa cataliza la transferencia de la porción carbamoil del carbamoil fosfato al aminoácido ornitina formando citrulina y ortofosfato (Fig. 18). Esta reacción se lleva a cabo en la matriz mitocondrial; la formación del sustrato ornitina y la metabolización subsecuente del producto, citrulina, se lleva a cabo en el citosol. Por tanto, tanto la entrada como la salida de ornitina y citrulina de la mitocondria implica la participación de un sistema de transporte situado en la membrana interna de esta organela, formado por un contratransportador citrulina/ornitina. 18 Fisicoquímica aplicada a la fisiología veterinaria – Metabolismo de proteínas DIGESTIÓN Y ABSORCIÓN I Figura 17. Formación de Citrulina. -Reacción 3: formación de argininosuccinato: La reacción de la argininosuccinato sintetasa une aspartato y citrulina a través del grupo amino del aspartato, y suministra el segundo nitrógeno de la urea. La reacción es impulsada por la escisión de ATP en AMP y pirofosfato (Fig. 19). Figura 18. Reacción de formación de argininosuccinato. -Reacción 4: Formación de arginina y fumarato: La escisión del argininosuccinato, catalizado por la argininosuccinasa, retiene nitrógeno en el producto arginina y libera el esqueleto del aspartato como fumarato (Fig. 20). La adición de agua al fumarato genera malato, y la oxidación de este dependiente de NAD+, forma oxaloacetato. Estas dos reacciones, correspondientes a ciclo de Krebs, se catalizan por la fumarasa y la malato deshidrogenasa citosólicas. La transaminación del oxaloacetato con el glutamato genera nuevamente aspartato. El esqueleto carbonado del aspartato/fumarato, actúa como un transportador para el paso del nitrógeno del glutamato a un precursor de la urea. 19 Fisicoquímica aplicada a la fisiología veterinaria – Metabolismo de proteínas DIGESTIÓN Y ABSORCIÓN I Figura 19. Ruptura de Argininosuccinato en arginina y fumarato. -Reacción 5: formación de ornitina y urea: La reacción final del ciclo de la urea consiste en la ruptura hidrolítica de la arginina catalizada por la arginasa hepática liberando urea. El otro producto, ornitina, reingresa a la mitocondria para ser utilizada nuevamente en el ciclo de la urea (Fig. 21). Cantidades menores de arginasa también se encuentran en los tejidos renal, cerebral, mamario, testicular y en la piel. La ornitina y la lisina son inhibidores potentes de la arginasa y, por tanto, compiten con la arginina. Figura 20. Hidrolisis de arginina para formar urea y ornitina que reingresara al ciclo. Comenzando y terminando con la ornitina, las reacciones del ciclo consumen 3 equivalentes de ATP y un total de 4 enlaces de alta energía. La urea es el único compuesto nuevo generado por el ciclo; todos los otros intermediarios y reactantes son reciclados. La energía consumida en la producción de urea es más que la recuperada por la liberación de la energía formada durante la síntesis de los intermediarios del ciclo de la urea (Fig. 22). El amoniaco liberado durante la reacción de la glutamato deshidrogenasa esta acoplado a la formación del NADH + H+. En adición, cuando el fumarato se convierte de nuevo a aspartato, la reacción de la malato deshidrogenasa usada para convertir el malato a oxaloacetato genera un mol de NADH + H+. Estos dos moles de NADH + H+, así, son oxidadas en la mitocondria produciendo 6 moles de ATP. 20 Fisicoquímica aplicada a la fisiología veterinaria – Metabolismo de proteínas DIGESTIÓN Y ABSORCIÓN I Figura 21. Reacciones e intermediarios de la síntesis de la urea. Los grupos que contienen nitrógeno que contribuyen a la formación de urea están sombreados en celeste. Las reacciones 1 y 2 ocurren en la matriz de las mitocondrias hepáticas, y las reacciones 3, 4 y 5 en el citosol hepático. Regulación del ciclo de la urea La regulación de la formación de urea se lleva a cabo en dos niveles, en la carbamoil fosfato sintetasa I y por inducción enzimática. La CPSI necesita de forma obligada el activador alostérico N-acetilglutamato. Este compuesto es sintetizado a partir de glutamato y acetil-CoA por la N-Acetilglutamato sintetasa, que es activada por la arginina. Como el acetil-CoA, el glutamato y la arginina suministran intermediarios al ciclo de Krebs, la presencia de N- Acetilglutamato indica que todos ellos están disponibles y en abundancia. La inducción enzimática del ciclo de la urea tiene lugar cuando aumenta el suministro de amoniaco o aminoácidos al hígado. La concentración de los intermediarios del ciclo también desempeña un papel en su regulación a través de la ley de acción de masa. Una dieta rica en proteínas (exceso de aminoácidos) o la inanición (exceso de amoniaco por utilización de cadenas carbonadas de aminoácidos para obtener energía), tienen como resultado la inducción de las enzimas del ciclo de la urea. 21 Fisicoquímica aplicada a la fisiología veterinaria – Metabolismo de proteínas DIGESTIÓN Y ABSORCIÓN I Destino de la urea La urea esta es transportada por la circulación sanguínea hasta el riñón para su excreción posterior. Un animal adulto con una dieta balanceada elimina de manera fisiológica un 90% del nitrógeno total excretado por esta vía. La urea es una sustancia soluble, fácilmente difusible a través de las membranas celulares y completamente atóxica. Se encuentra en sangre circulante en una concentración de 20 a 40 mg/dL o 0,4 mM. En caso de insuficiencia renal, este valor aumenta. Interacción el ciclo de la urea con el ciclo de Krebs El ciclo de Krebs y de la urea se relacionan por medio del fumarato, producto de la reacción de la argininosuccinasa, este metabolito puede ingresar a la mitocondria e incorporarse al ciclo de Krebs llegando a la formación de oxaloacetato, el cual puede seguir tres vías (Fig. 23): 1. Oxidarse en el ciclo para generar equivalentes reductores que luego se dirigirán a la cadena respiratoria para la generación de ATP por fosforilación oxidativa. 2. Generar glucosa por medio de gluconeogénesis. 3. Transaminarse con glutamato y dar α-cetoglutarato y aspartato; este último es sustrato en el citosol de la argininosuccinato sintetasa, aportando uno de los dos grupos nitrogenados para la formación de urea. Figura 22. Relación metabólica entre el ciclo de Krebs y de la Urea. Destino de los esqueletos carbonados de los aminoácidos Todos los tejidos del organismo tienen cierta capacidad para la síntesis de los aminoácidos no esenciales, remodelación de aminoácidos, y conversión de los esqueletos de carbono, que no son de aminoácidos, en aminoácidos y en otros derivados que contienen nitrógeno. Sin embargo, el hígado es el sitio principal de metabolismo del nitrógeno en el cuerpo. En etapas de exceso dietético de proteínas, el nitrógeno de los aminoácidos es eliminado vía transaminación, desaminación, y formación de urea; los esqueletos de carbono se conservan 22 Fisicoquímica aplicada a la fisiología veterinaria – Metabolismo de proteínas DIGESTIÓN Y ABSORCIÓN I generalmente como glúcidos vía gluconeogénesis, o como ácidos grasos vía síntesis mediante la ácido graso sintasa. Según esto, los aminoácidos pueden dividirse en tres categorías: glucogénicos, cetogénicos, o glucogénicos y cetogénicos (Fig. 24). Los aminoácidos glucogénicos son los que dan lugar a una producción neta de piruvato o intermediarios del ciclo de Krebs, tales como α-cetoglutarato u oxaloacetato, que son precursores de la glucosa vía gluconeogénesis. Todos los aminoácidos excepto la lisina y la leucina son al menos en parte glucogénicos, la lisina y la leucina son los únicos aminoácidos que son solamente cetogénicos, dando lugar solamente a acetil-CoA o acetoacetil-CoA, ninguno de los cuales puede generar glucosa. Un grupo pequeño de aminoácidos comprendidos por isoleucina, fenilalanina, treonina, triptófano, y tirosina dan lugar a precursores de la glucosa y de ácidos grasos y así son glucogénicos y cetogénicos. Finalmente, debe ser reconocido que los aminoácidos tienen un tercer posible destino, durante etapas inanición los esqueletos de carbono reducidos se utilizan para la producción energética, con el resultado que se oxida a CO2 y H2O. Los aminoácidos además de constituir proteínas son precursores de moléculas sumamente importantes para el organismo. Las porfirinas que se forman a partir de la glicina son la base estructural del grupo hemo de la hemoglobina y la mioglobina las cuales transportan oxígeno en el sistema circulatorio y el tejido muscular respectivamente, y de los citocromos de la fosforilación oxidativa los cuales trasportan electrones para generar el gradiente electroquímico que impulsa la síntesis de ATP. A partir de glicina y arginina se sintetiza fosfocreatina la cual es una forma de almacenamiento de energía en los músculos en la etapa inicial de la contracción muscular, ya que restaura rápidamente el ATP que se desfosforila durante la contracción. La histamina se origina de la histidina, es un mediador de la inflamación aguda, desencadena vasodilatación, vasoconstricción a nivel de las vénulas del sistema circulatorio y movilización de leucocitos al tejido conectivo donde ocurre el fenómeno inflamatorio. La tirosina es el precursor de la melanina, las catecolaminas y las hormonas de la glándula tiroides. La melanina es un pigmento de la piel y el pelo, que protege de los rayos ultravioletas. Las catecolaminas son un grupo de compuestos como la dopamina, neurotransmisor cerebral relacionado con las funciones motrices; la adrenalina, hormona secretada en situaciones de alerta que promueve el catabolismo de glúcidos y lípidos, el ritmo cardiaco y la presión arterial; y la noradrenalina que desempeña funciones similares a la adrenalina pero con mayor eficacia. Las hormonas tiroxina y triyodotironina estimulan el metabolismo basal de los glúcidos, lípidos y aminoácidos. La serotonina y la melatonina se sintetizan a partir del triptófano. La serotonina es un neurotransmisor, induce el sueño, controla el apetito, inhibe la secreción gástrica, aumenta el peristaltismo, estimula la secreción de hormonas de la hipófisis, produce vasoconstricción, 23 Fisicoquímica aplicada a la fisiología veterinaria – Metabolismo de proteínas DIGESTIÓN Y ABSORCIÓN I disminuye la contracción del corazón, aumenta la agregación plaquetaria y es broncoconstrictor. La melatonina al igual que la serotonina modula el sueño, además controla los ciclos reproductivos de acuerdo al fotoperíodo. El glutatión forma parte de un sistema antioxidante que protege a las células contra el daño de los radicales libres a nivel de las membranas celulares; el glutamato, la cisteína y la glicina son sus precursores. Figura 23. Intermediarios anfibólicos formados a partir de los esqueletos de carbono de aminoácidos. Ciclo de la urea en vacas lactantes En el caso particular de vacas lactantes alimentadas con dietas cuya base forrajera tiene contenidos relativamente altos en proteína degradable en rumen y nitrógeno no proteico, como lo es el pasto altamente fertilizado que es pastoreado a edades tempranas, se incrementa la actividad hepática conducente a detoxificar el amonio proveniente del rumen, a través del ciclo de la urea. Los rumiantes absorben el N principalmente como amonio por la pared ruminal y aminoácidos y péptidos a nivel duodenal. Las vacas lactantes de alta producción que pastorean forrajes con alto contenido de proteína degradable y nitrógeno no proteico a menudo presentan una tasa muy alta de transformación del amonio ruminal en urea. El hígado remueve y detoxifica el amonio absorbido desde el tracto digestivo, transformándolo principalmente en urea, la cual posteriormente es reciclada por saliva, o eliminada por orina y leche. Como el ciclo de la urea se encuentra estrechamente ligado a la gluconeogénesis a través del ciclo de Krebs, es un aspecto crítico para el metabolismo de los rumiantes dado que la absorción de glucosa es muy baja a nivel intestinal en tanto que el requerimiento por este metabolito es alto, particularmente al inicio de la lactancia a nivel de la glándula mamaria para la síntesis de lactosa que es el principal soluto que determina el volumen 24 Fisicoquímica aplicada a la fisiología veterinaria – Metabolismo de proteínas DIGESTIÓN Y ABSORCIÓN I de leche producida. La glucosa también es fundamental en la síntesis de ácidos grasos y de triacilgliceroles en glándula mamaria aportando glicerol, NADPH + H+ en la vía de las pentosas fosfato y ATP. Así mismo, participa en la síntesis de proteínas lácteas aportando esqueletos carbonados para la biosíntesis de aminoácidos no esenciales y ATP. Como los rumiantes se consideran animales eminentemente gluconeogénicos, el incremento en gluconeogénesis a partir de aminoácidos conduce a un incremento en la síntesis de urea. 25 Fisicoquímica aplicada a la fisiología veterinaria – Metabolismo de proteínas DIGESTIÓN Y ABSORCIÓN I Bibliografía Augustyn A. Zeidan A. Zelasko A y cols. (2020). Nitrogen fixation. Environment Section. Encyclopaedia Britannica. Brandan N. Aispuro G. (2005). Metabolismo de compuestos nitrogenados. Facultad de Medicina. Universidad Nacional del Nordeste. Disponible en https://med.unne.edu.ar/sitio/multimedia/imagenes/ckfinder/files/files/Carrera- Medicina/BIOQUIMICA/nitro.pdf Correa HJ. Cuéllar AE. (2004) Aspectos clave del ciclo de la urea con relación al metabolismo energético y proteico en vacas lactantes. Rev Col Cienc Pec 17:(1) 29-38. Devlin, Thomas M (2000). Bioquímica. Libro de texto con aplicaciones clínicas. 3ra edición. Editorial Reverté. 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