Immunologie - Notes de Cours - PDF

GIORDANO Léonie ROURE Ines OZENNE Tristan TODESCHINI Aline INTRODUCTION Pourquoi l’immunologie est importante ? Réponse en 2 exemples : - La vaccination qui a permis d’éradiquer la variole (smallpox en anglais) en 1979...

GIORDANO Léonie ROURE Ines OZENNE Tristan TODESCHINI Aline INTRODUCTION Pourquoi l’immunologie est importante ? Réponse en 2 exemples : - La vaccination qui a permis d’éradiquer la variole (smallpox en anglais) en 1979 - Les anticorps monoclonaux thérapeutiques qui permettent le traitement de cancer comme les mélanomes avancée ou les anticorps ciblent les PD-1 Objectifs du cours : comprendre et connaitre le système immunitaire pour nous permettre d’apporter un soutien pour décrire le mécanisme d’action des médicaments ciblant ce système (inflammation, vaccination, anticorps monoclonaux thérapeutiques, cytokines recombinantes). Exam : écrit avec Q. ouvertes et QCM ➔ 50% microbiologie ➔ 50% immunologie Les organismes multicellulaires (plantes; animaux: invertébrés, vertébrés) vivent dans un environnement peuplés de microorganismes, dont certains sont pathogènes. L’immunité : défense contre une infection I. LES MICRO-ORGANISMES (MO) : Il existe plusieurs types de MO : - Virus Intracellulaire - Bactéries - Champignons (fungi) - Protozoaires Extracellulaire - Helminthes - Prions ? MO ou pas on ne sait pas ➔ La différence entre ces MO est la taille. La réponse immunitaire sera différente suivant le MO. Il faut savoir que pas forcément tous les MO sont pathogène. Par exemple : - le microbiome intestinal possède autant de cellules humaines que de bactéries. Cela confère à des hôtes humains des attributs physiologiques qu'ils n'ont pas développé eux-mêmes - les probiotique : MO vivants qui, ingérés en quantités suffisantes, exercent des effets positifs pour la santé (définition de l’OMS) Le système immunitaire ne permet pas seulement la défense contre les infections. Il peut agir dans ces différents cas : → immunopathologie GIORDANO Léonie ROURE Ines OZENNE Tristan TODESCHINI Aline Immunophatologie : pathologie provoquée par une réponse immune inadéquate. Le système doit trouver un équilibre entre une activation sous optimale et une suractivation du système immunitaire : A. II. LA VACCINATION B. La variole Aspect historique : PAS SAVOIR LES CHIFFRES : La variole est provoquée par un virus et a provoquée plus de 3 millions de morts dans le monde au 19ème siècle. 10ème siècle : les Turcs inoculent des extraits de pustules de patients ayant la variole à des enfants (= variolation) 1718 : Lady Montague introduit la variolation en Angleterre 1796 : Edward Jenner : à ce moment-là, E. Jenner a remarqué qu’il y a l’absence de la maladie chez des fermières ayant été infectées par le virus de la variole de la vache. Sans réellement savoir le fonctionnement de cela, il a donc inoculé (= introduire dans l’organisme) des extraits de pustules causées par le virus de la vache afin de protéger contre une infection par la variole humaine 1879: Louis Pasteur Louis pasteur a fait des cultures fraiches avec des bactéries du choléra. Il s’est rendu compte que lorsqu’on fait une seule injection de ces cultures fraiches à des poules → mort Si on fait une culture vieillit et qu’on l’injecte : les poules ne meurent pas à la 1ère injection Si plus tard on injecte la culture fraiche dans les mêmes poules : les poules survivent Conclusion : il y a une perte de virulence des bactéries isolées des cultures « vieillissantes ». L’injection de ces bactéries confère une protection. Suite à cela, on utilisera donc le même principe pour d’autres vaccins (dont la rage), grâce notamment à l’atténuation par traitement « chimique » (ou par chaleur). GIORDANO Léonie ROURE Ines OZENNE Tristan TODESCHINI Aline Par la suite, un vaccin contre la tuberculose a été développé : BCG : Bacille Calmette-Guerin (les noms des 2 scientifiques qui ont déveleppés ce vaccin). Celui-ci se base sur l’atténuation d’une souche de Mycobacterium bovis (bovine) par culture sur milieux artificiel (extraits de pommes de terre, bile de bœuf, … ) afin d’obtenir une souche ayant perdu la virulence. ➔ Concept basé sur l’atténuation par culture sur « hôte inhabituel » Pour la variole, le vaccin a été développé avant la découverte du pathogène. C’est ensuite le système inverse qui s’est passé pour les autres vaccins. La variole causée par un virus d’ADN double brin était très présente en 1965 puis a été totalement éradiquée dans les années 1980. C. La poliomyélite La poliomyélite est causée par le virus à l’ARN de la famille des Picornaviridae qui cause de grave problèmes au niveau pulmonaire. 2 différents vaccins existent : - Vaccin inactivé - Vaccin vivant (atténué) Ces vaccins ont permis de réellement diminuer le nombre de polio mais pas de l’éradiquer. En 1988 on avait 125 pays touché par la polio puis en 2013 plus que 3 pays. La vaccination est l'une des interventions médicales les plus efficaces jamais développées. Voici quelques chiffres pour illustrer cela : (PAS SAVOIR LES CHIFFRES) ➔ Ici on voit bien la diminution énorme au niveau des chiffres entre avant et après la vaccination. En ce qui concerne la rougeole, après la vaccination le nombre de cas était vraiment plus bas. Puis plus récemment le nombre de cas augmente GIORDANO Léonie ROURE Ines OZENNE Tristan TODESCHINI Aline Concernant la vaccination, on a le concept de « herd immunity » (= immunité de groupe) : protection des sujets non vaccinés par vaccination de masse. Les images ci-dessous permettent d’illustrer ce concept : En bleu : susceptible à l’infection Vert : vacciné Rouge : personne infectée Dans le cas 1, de nombreuses personnes sont vaccinées mais, pas assez pour qu’une personne infecté ne puisse pas rependre la maladie de manière exponentielle. Dans le cas 2, quasi toute la population est vaccinée. La personne infecté ne va donc pas ou beaucoup moins être en contact avec des personnes non vaccinées susceptible d’être contaminée. La maladie sera beaucoup moins répandue. Les causes de mortalité : elles ont totalement changé au cours du temps du a des changements au niveau de l’hygiène par exemple. En 1900 on mourrait plutôt d’infections alors que maintenant c’est plutôt dû aux cancers, … III. LES ANTICORPS MONOCLONAUX THERAPEUTIQUES Anticorps : liaison très spécifique normalement contre toutes les molécules. On peut donc en principe développer des anticorps contre n’importe quelle cible comme pour le traitement de : - Cancer - Transplantation d’organe solide - Traitement anti-inflammatoire Exemple d’un médicament contenant des anticorps : Nivolumab, pembrolizumab. Ceux-ci ciblent : PD-1 et permettent le traitement du mélanome et le cancer du poumon dit « non à petites cellules ». Il y a quelques années, les scientifiques ont découvert les molécules PB1 puis ont ensuite trouver des anticorps ciblant ce PB1. Ici on voit par exemple l’évolution du mélanome avancé avant et après traitement : GIORDANO Léonie ROURE Ines OZENNE Tristan TODESCHINI Aline IV. LE SYSTEME IMMUNITAIRE Le système immunitaire possède 2 phases : - Phase de reconnaissance : détection de microorganismes / antigènes - Phase effectrice : élimination (destruction et /ou expulsion et /ou inhibition de la croissance) des microorganismes ou « adaptation » de l’hôte (ignorance / tolérance) Ces 2 phases doivent se passer sans provoquer de dommages aux tissus sains. A. Notion d’antigène - A l’origine ils s’appelaient « antibody generation » : parce qu'ils peuvent stimuler la génération d'anticorps - Aujourd'hui, le terme antigène se réfère à toute substance reconnue par le système immunitaire adaptatif - Généralement, les antigènes sont des protéines, des glycoprotéines et des polysaccharides de pathogènes courants, mais ils peuvent inclure une gamme beaucoup plus large de structures chimiques. Le système immunitaire possède plusieurs lignes de défense : - La réponse immunitaire innée avec : La barrière anatomique (= physique) : la peau, les muqueuses, … Puis la présence de sécrétions « anti-microbiennes » Puis le présence des cellules immunitaires innées : macrophages, granulocytes, … - Le système immunitaire adaptatif : lymphocytes T et B → Il existe des interactions entre ces différentes lignes B. La réponse immunitaire innée La réponse immunitaire innée est : - La 1ère ligne de défense qui a un effet immédiat - Toujours présente → large spectre d’action (spécificité) - Stéréotypée : toujours la même activité → pas ou peu de mémoire - Effecteurs : de nombreux types cellulaires (presque toutes les cellules) - Origine évolutive très ancienne (phagocytose) Exemple avec la phagocytose : forme d’endocytose : GIORDANO Léonie ROURE Ines OZENNE Tristan TODESCHINI Aline Mécanismes d’évasion de la réponse immune innée : pour échapper à la réponse immunitaire innée, la bactérie va mettre en place un mécanisme d’action : Sur l’image ci-contre, on voit le phagosome avec la bactérie dedans (petites flèches noires). Si la membrane est cassée, la bactérie peut aller dans le cytoplasme (« phagosome escape ») de la cellule où elle peut ensuite proliférer. C. Réponse immunitaire adaptative Réponse immunitaire adaptative : c’est une propriété seulement présente dans toutes les espèces de vertébrés. Cette réponse est : - inductible : Cinétique lente : plusieurs jours Phénomène de mémoire : principe de la vaccination - Spécifique : par exemple un anticorps A (anti-A) ne reconnait pas le B, C ou D - Diversifié : on a une possibilité d’induire l’anticorps A (anti-A), anti-B, … → diversité > 1012 ! Cela pose un problème : comment produire 1012 protéines différentes à partir de 20 000 gènes ? on verra la réponse dans le cour 3 Il existe 2 types de réponse immunitaires adaptatives : - réponse immunitaire humorale : qui peut être transmise par le transfert d’« humeurs » d’un patient a l’autre (ou d’un animal expérimental à l’autre) : anticorps, complément - réponse immunitaire cellulaire : qui ne peut être transmise par le transfert de sérum mais nécessite le transfert de cellules Résumé : le système immunitaire peut faire des réponses immunes non exclusivement dirigées contre les agents infectieux. Il doit donc posséder une propriété essentielle : la tolérance (non-réponse). On a par exemple : - réponse immune « stérile » : la réponse inflammatoire - la réponse immune non contrôlée peut provoquer des « dommage collatéraux » aux tissus sains - la réponse contre des agents non-infectieux : l’allergie/l’auto-immunité - la réponses immune anti-tumorale GIORDANO Léonie ROURE Ines OZENNE Tristan TODESCHINI Aline Vue d’ensemble des principaux mécanismes de l’immunité innée et adaptive : Organes lymphoïdes primaires : développement et maturation des lymphocytes Organes lymphoïdes périphériques : interactions avec antigènes étranges OZENNE Tristan, ROURE Inès, TODESCHINI Aline et GIORDANO Léonie CHAPITRE I : IMMUNITE INNEE I. PLUSIEURS NIVEAUX DE PROTECTION La couche épithéliale est la barrière initiale contre les infections. Tous les pathogènes doivent développer un moyen de traverser l'épithélium. Ils le font donc : - Via les voies aériennes - Via le tractus gastro-intestinal - Via le tractus génito-urinaire - Via des coupures dans la peau (ou des brûlures) : morsures de moustiques, coupures,… Voici les différentes barrières physiques : - La peau : qui a un rôle de barrière physique et chimique - Les jonctions serrées : qui se situent entre les cellules épithéliales de l’intestin par exemple. Cela permet de rendre quasiment impossible le passage des pathogènes. - Les cils : dans les poumons, les cellules épithéliales possèdent des cils à leur surface qui propulsent le mucus vers l’extérieur et aide à prévenir la colonisation des voies respiratoires par les bactéries. La couche épithéliale est une barrière : - Physique - Chimique : on a l’exemple de l’effet de la défensine qui est un peptide antimicrobien qui peut s’insérer dans la membrane microbienne puis ils vont former des pores dans la bactérie. Cela va permettre la lyse des bactéries : è Cela permet d’inhiber la prolifération des agents pathogènes. - Microbiologique : les symbiotes (microbiote normal) peuvent inhiber la colonisation / prolifération des agents pathogènes 1 OZENNE Tristan, ROURE Inès, TODESCHINI Aline et GIORDANO Léonie Exemples de quelques barrières physiques, chimiques et microbiologiques : II. LA PHAGOCYTOSE La phagocytose est une ancienne forme de réponse immunitaire. On a une vue d’ensemble qui nous montre les différentes étapes de la phagocytose : Chimiotaxie et adhérence du microbe au phagocyte. Ingestion de microbe par phagocyte Formation d'un phagosome Fusion du phagosome avec un lysosome pour former un phagolysosome Digestion du microbe par des enzymes Formation de corps résiduel contenant des matières non digestibles Décharge de déchets A. Cellules du système immunitaire Dans le sang, on produit plus de 100 x 109 cellules/jour. Le sang est constitué : è Du plasma : la partie qui contient ne pas de cellules è Des éléments cellulaires avec les globules rouges, les globules blancs et les plaquettes. 2 OZENNE Tristan, ROURE Inès, TODESCHINI Aline et GIORDANO Léonie Les globules blancs se divisent en granulocytes : regroupant les neutrophiles, éosinophiles, basophiles et en agranulocytes : regroupant les lymphocytes et les monocytes. 1. Quelle est l’origine ? Pas connaitre tous les détails. Dans la moelle osseuse, on a une cellule souche hématopoïétique qui est capable de fournir toutes les cellules de notre système immunitaire. On peut après avoir des progéniteurs comme le CLP qui va pouvoir se différencier en lymphocytes mais pas les monocytes. Ceux qui peuvent faire la phagocytose sont surtout les neutrophiles mais aussi les éosinophiles et les monocytes. On peut voir les différents globules blancs : - Les neutrophiles ont un noyau avec différents lobules. - Les éosinophiles contiennent beaucoup de granulations. - Les basophiles ont un noyau bilobé - Les lymphocytes T et B ont un noyau imposant qui prend presque toute la place. - Les monocytes Si on regarde le nombre normal de cellules sanguines : La grande majorité de leucocytes qu’on retrouve dans le sang sont les neutrophiles (environ 4000/µL). Ils représentent donc 50-70% des leucocytes. Les lymphocytes représentent 20-40% des leucocytes. Les monocytes, éosinophiles et basophiles sont les cellules en plus petit nombre mais ça ne veut pas dire qu’ils ne sont pas importants. 3 OZENNE Tristan, ROURE Inès, TODESCHINI Aline et GIORDANO Léonie 2. Les macrophages résidents (tissus) et monocytes En plus des cellules qu’on trouve dans le sang, on a aussi des macrophages résidents qui se trouvent dans les tissus. Ces macrophages fixes ont la capacité de faire la phagocytose et ont des noms spécifiques en fonction de leur emplacement : - Cellules Kupffer (foie) - Les macrophages alvéolaires (poumons) - Cellules microgliales (cerveau) - Ostéoclastes (os) Ces macrophages résidents ont principalement une origine embryonnaire : Au cours du développement précoce, on a des cellules souches hématopoïétiques dans le foie du fœtus et dans la moelle osseuse principalement qui vont former les précurseurs des macrophages tissulaires. Via le sang, ils vont se différencier dans les tissus. è Certains macrophages résidents sont formés lors du développement et vont rester dans les tissus après la naissance. Les monocytes quant à eux sont dans le sang et sont très mobiles. Ils proviennent des cellules souches hématopoïétiques qu’on retrouve dans la moelle osseuse et qui vont former les précurseurs des monocytes qui se différencieront dans le sang. Cependant, pendant la réaction d’inflammation, les monocytes sanguins peuvent se différencier en macrophages tissulaires. 3. Les neutrophiles Les neutrophiles sont les premiers à réagir mais meurent rapidement à ils ne sont pas une défense prolongée. Ils peuvent se rendent dans les tissus infectés et y pénétrer, où ils engloutissent et tuent les bactéries. Ils meurent donc dans les tissus et sont engloutis et dégradés par les macrophages. 4 OZENNE Tristan, ROURE Inès, TODESCHINI Aline et GIORDANO Léonie B. Mécanisme de la phagocytose : Nous allons voir ce qu’il se passe dans le phagosome lors de la phagocytose par ces neutrophiles : Les microbes peuvent se lier aux récepteurs des phagocytes et la membrane va donc les enrober afin de les ingérer dans le phagosome. Le phagosome va ensuite entrer en fusion avec un lysosome pour former le phagolysosome. Dans le phagolysosome, on a donc les lysozymes qui peuvent tuer les microbes. Mais il y a d’autres mécanismes qui sont impliqués dans la dégradation des microbes : è La formation de NO formée par iNOS, une synthase inductible de l’oxyde nitrique qui est toxique pour les microbes. è La formation de ROS, des dérivés réactifs de l’oxygène. Ils sont formés par une oxydase à la NADPH oxydase qu’on retrouve dans la membrane des phagocytes. En plus de tous ces mécanismes, il y a : è Une acidification du pH du milieu. è Des peptides antimicrobiens sont retrouvés comme les défensines. Ce sont des enzymes comme les lysozymes qui peuvent digérer les parois des bactéries. Est-ce que la phagocytose est indiscriminée ? Les phagocytes peuvent englober des billes ! Mais la phagocytose des bactéries est plus efficace : on peut donc se demander s’il y reconnaissance des pathogènes ? III. RECONNAISSANCE DES MOTIFS PAR LA RÉPONSE IMMUNITAIRE INNÉE Un antigène est une molécule qui peut être reconnue par le système immunitaire adaptatif, par exemple par les BCR ou les anticorps ou les TCR. ATTENTION : ici ce ne sont donc pas des antigènes. Les Tolls ont été découverts chez la drosophile pour son rôle dans la différenciation embryonnaire. Mais plus tard, ils sont révélés être essentiel à la protection de ces insectes contre les infections. è Quand il y a une mutation, on a une présence de fungi. Plus tard, on a découvert plusieurs récepteurs similaires chez l’homme à ces Tolls : les Toll like receptors TLR 5 OZENNE Tristan, ROURE Inès, TODESCHINI Aline et GIORDANO Léonie A. Récepteurs de type Toll : TLR Ils sont constitués : - D’une partie extracellulaire impliquée dans la reconnaissance. - D’une partie intracellulaire impliquée dans la signalisation. Pas connaitre tous les détails de l’image 1. Mécanismes de reconnaissance de l'immunité innée Les molécules reconnues par les TLR sont les PAMPs : pathogen-associated molecular patterns (‘motif moléculaire associé aux pathogènes’). Elles sont produites en général uniquement par des agents pathogènes microbiens, et non par des hôtes. è Ce sont des structures essentielles pour la survie des microbes è Elles sont habituellement des structures invariantes partagées par une classe de pathogènes (p.ex. bactéries Gram négatives, rétrovirus) On peut dire que la paroi cellulaire des bactéries suit le modèle PAMP : Elle est constituée de LPS (lipopolysaccharide) et de peptidoglycanes. Nous allons nous concentrer sur le LPS : Pas connaitre la structure des différents lipides A Les lipopolysaccharides sont composés d’un lipide A et de polysaccharides (différents types de sucres). è Dans différents types de bactéries on a différents types de lipide A. 6 OZENNE Tristan, ROURE Inès, TODESCHINI Aline et GIORDANO Léonie Comment se passe la reconnaissance de LPS par le TLR4 ? QUESTION EXAM C’est le TLR4 qui est impliqué dans la reconnaissance du LPS. Le LPS est lié par une « LPS-binding protein" (LBP) dans le sérum, passé à CD14, puis transféré à MD-2 et finalement lié par TLR4. La liaison à LPS induit la dimérisation de TLR4 et de signalisation intracellulaire. TLR3 quant à lui va reconnaitre l’ARN double brin. C’est un dimère. 2. Les différents TLRs Le TLR3 ne se trouve pas au même endroit que le TLR4. è TLR4 est dans la membrane plasmique è TLR3 est dans l’endosome Chaque TLR a des spécificités PAMP distinctes et une localisation distincte. À savoir : - TLR3 reconnait l’ARN double brin qui peut être produit par des virus - TLR4 reconnait le LPS des bactéries Gram – et les acides lipotéichoïques des Gram + - TLR9 reconnait l’ADN CpG à avec des sites CpG non méthylés chez les bactéries et le virus de l’herpès. B. Les PRRs : Pattern Recognition Receptors Les PRRs sont donc les récepteurs de l’immunité innés. Ils sont : è Associé aux membranes plasmiques è Dans les endosomes è Dans le cytoplasme Ce sont donc : 7 OZENNE Tristan, ROURE Inès, TODESCHINI Aline et GIORDANO Léonie 1. Les CLRs : Les CLRs (C-type lectin receptors) sont des récepteurs de l’immunité innée associé aux membranes plasmiques. Il existe différents types (type I, type II) mais il ne faut pas les connaitre. Les CLRs sont les lectines qui profitent de la glycosylation différentielle entre la levure et nos propres cellules pour détecter un événement infectieux. On voit que les motifs de glycosylation entre les levures et les vertébrés sont différents. 2. Les peptidoglycanes : Attention : c’est un modèle de PAMP et pas un PRR. La biosynthèse des peptidoglycanes est complexe et peut seulement se produire dans les bactéries. Ils sont constitués d’une partie glucidique (polysaccharide) et d’une partie peptidique. è Les lysozymes auront pour cible les acides aminés è La pénicilline aura pour cible la transpeptidation Ils sont reconnus par les NODs qui sont des PRRs. Ce sont des récepteurs de l’immunité innée du cytoplasme. è Le NOD1 va reconnaitre D-glutamyl-meso-DAP dipeptide è Le NOD2 va reconnaitre le muramyl dipeptide 8 OZENNE Tristan, ROURE Inès, TODESCHINI Aline et GIORDANO Léonie 3. Détection de l’ADN cytoplasmique : S’il y a de l’ADN dans le cytoplasme, c’est souvent lié à une infection virale. On a donc des PRR qui vont les reconnaitre : les cGAS = cyclic GAMP synthase. è Ils peuvent également reconnaitre des dinucléotides bactériens. Après avoir capté de l’ADN cytoplasmique ou des dinucléotides, cGAS va produire du cGAMP (cyclic GMP-AMP) qui va se lier avec STING (simulator of interferon gènes). è On va stimuler la production d’interférons. Plusieurs voies sont impliquées avec plusieurs facteurs de transcription : IRF3 et NF-kB. Mécanisme de reconnaissance : Attention : il y a une différence entre les virus et les bactéries. Les bactéries ont la capacité de produire directement cGAMP. Interféron = cytokine Membrane ER = membrane du réticulum endoplasmique 9 OZENNE Tristan, ROURE Inès, TODESCHINI Aline et GIORDANO Léonie IV. LE SYSTÈME DU COMPLÉMENT Le système du complément est une collection de protéines solubles présentes dans le sang (et autres liquides du corps). è C’est une substance (sensible à la chaleur) présent dans plasma ‘normale’ qui pouvait ‘complémenter’ l’activité antibactérienne de plasma ‘immune’ → un des mécanisme effecteur des anticorps. è Maintenant on sait que ce système du complément est actif même sans anticorps Il y a deux étapes : A. Rôle central de C3 : Il y a trois voies d'activation majeures et trois fonctions principales du système du complément : - La voie classique est la première découverte : elle est dépendante des anticorps - La voie alternative agit directement sur la surface des pathogènes sans avoir besoin des anticorps - La voie des lectines est dépendante des lectines. On va surtout se focaliser sur les trois fonctions principales. 10 OZENNE Tristan, ROURE Inès, TODESCHINI Aline et GIORDANO Léonie 1. Opsonisation et phagocytose : C3b (système du complément) se lie à la surface du microbe à c’est l’opsonisation. Il sera reconnu par CR1 qui se trouve sur des phagocytes à ça va stimuler la phagocytose donc la destruction du microbe. 2. Cytolyse : Ne pas connaitre tous les chiffres On a plusieurs protéines du système du complément qui sont impliqués qui vont former un MAC : membrane attack complex (entre 10 et 16 molécules de C9). On forme donc des pores dans la membrane des microbes. 3. Stimulation des réactions inflammatoires : Des protéines du système du complément (C3a et C5a) peuvent augmenter la perméabilité vasculaire à la paroi des vaisseaux va donc laisser passer des anticorps et des cellules vers les tissus. è On va stimuler la réaction inflammatoire afin de détruire les microbes par les leucocytes. 11 OZENNE Tristan, ROURE Inès, TODESCHINI Aline et GIORDANO Léonie B. Reconnaissance des pathogènes par plusieurs PRR : è Chaque pathogène porte plusieurs ‘PAMPs’ è Reconnaissance de ligand « promisqueuse » : un récepteur peut réagir à de multiples ligands V. LES CONSÉQUENCES FONCTIONNELLES DE LA RECONNAISSANCE DES AGENTS PATHOGÈNES La reconnaissance des PAMPs peut mener à : - Une phagocytose "améliorée" - Ou à une "signalisation" menant à une nouvelle transcription des gènes è Dépend des PRRs 12 OZENNE Tristan, ROURE Inès, TODESCHINI Aline et GIORDANO Léonie On va se concentrer sur la signalisation menant à une nouvelle transcription de gènes : Après la reconnaissance de peptidoglycanes et de LPS par les TLRs, on a le recrutement d’adaptateurs cytoplasmiques qui vont se lier en intracellulaire avec TLR à ça va mener à l’activation de facteurs de transcription comme NF-kB ou IRFs : - NF-kB mène à l’expression de gènes antiinflammatoires comme les cytokines, les chimiokines. On aura donc l’induction d’inflammation et la stimulation de l’immunité adaptative. - IRF induit des interférons de type 1 qui ont une action antivirale. A. La voie NF-kB : C’est le facteur de transcription pro-inflammatoire canonique. Il va induire la transcription de gènes codant pour : - Des peptides antimicrobiens comme les défensines - Des chimiokines - Des cytokines Les chimiokines sont des petites protéines sécrétées (8-14 kda), causant la chimiotaxie : - Par exemple, les leucocytes se déplacent vers un site d'infection par un processus appelé « chimiotaxie » è Il s'agit donc d'un processus dirigé dans lequel les cellules se déplacent vers une concentration de chimioattractants (chimiokines) ou de produits bactériens tels que des peptides N-formylés. 13 OZENNE Tristan, ROURE Inès, TODESCHINI Aline et GIORDANO Léonie Les cytokines sont des protéines sécrétées, régulateurs immunitaires. Elles suivent la voie de signalisation "paracrine" prototypique (signalisation à courte distance) : Un stimulus va produire les cytokines et les sécréter. Elles peuvent se fixer sur un récepteur d’une cellule cible qui va amener vers une signalisation qui peut activer des gènes. Elles auront donc des fonctions biologiques multiples : è Induction de la prolifération è Inhibition de la prolifération è Différenciation è Activation métabolique è Induction de l’apoptose B. La réponse à l’interféron Après une infection virale, la détection des PAMPs viraux induit une sécrétion d'IFN de type I via des facteurs de transcription IRF. IFN ira se lier à un récepteur sur une cellule cible, donc des signaux vont activer des gènes et on aura la production de protéines antivirales. è Cette cellule cible pourra se protéger du virus. Si le virus rentre dans la cellule, les protéines pourront bloquer la réplication du virus ou alors dégrader ses acides nucléiques. VI. LA RÉPONSE INFLAMMATOIRE Suite à une blessure, on peut avoir des rougeurs, chaleurs, gonflement et douleur. On a une reconnaissance de PAMPs puis la sécrétion de médiateurs solubles qui vont induire : - Une augmentation du débit sanguin capillaire et de la perméabilité - Chimiotaxie (recrutement) - Signalisation (cytokines, activation cellulaire) - Protéines antimicrobiennes / phagocytose Enfin, il faudra arrêter l’inflammation puis réparer les tissus, les vaisseaux … 14  OZENNE Tristan, ROURE Inès, TODESCHINI Aline et GIORDANO Léonie Après une blessure, on va avoir l’invasion de bactérie dans les tissus. Les cellules du système immunitaire résidentes vont arriver et vont synthétiser des cytokines et chimiokines. La vasodilatation et l’augmentation de la perméabilité des vaisseaux ainsi que la chimiotaxie permet aux globules blancs de migrer dans les tissus. Enfin on aura des rougeurs, chaleurs … è Un exemples des cytokines ‘pro-inflammatoires’ sont TNF-α, IL-1β, IL-6 Connaitre le nom des cytokines A. Migration des leucocytes La migration des leucocytes implique : - Le roulement médié par des sélectines, - L’activation médié par les chimiokines, - L’adhérence médié par les intégrines - Et la migration à travers l’endothélium médié par les chimiokines. SANG TISSUS 15 OZENNE Tristan, ROURE Inès, TODESCHINI Aline et GIORDANO Léonie Dans les tissus, on a les macrophages résidents qui sont stimulés par des microbes. Ils vont produire des cytokines pro-inflammatoire comme TNF qui vont agir sur les cellules endothéliales. Ces cytokines vont induire l’expression de sélectines et de ligands d’intégrines par les cellules endothéliales. Les macrophages produisent aussi des chimiokines. Les sélectines vont se lier faiblement aux leucocytes sanguins grâce à leurs ligands présents sur leur membrane plasmique. Ils vont donc rouler sur la surface endothéliale grâce à l’interaction entre les sélectines et leurs ligands. Ils vont rouler jusqu’à ce qu’une chimiokine se lie à son récepteur sur le leucocyte. Ça va activer les intégrines présentes sur les leucocytes permettent à ces cellules de se lier de manière plus forte à la surface endothéliale grâce à leurs ligands. C’est la phase d’activation et d’adhésion. Les chimiokines vont enfin induire la migration des leucocytes à travers l’endothélium vers le site d’infection. C’est la diapédèse. L’inflammation, une réponse stéréotypée : 1. Sécrétion des médiateurs solubles 2. Recrutement (chimiotaxie, augmentation de le perméabilité, diapedesis (migration à travers l’endohelium) 3. Phagocytose B. Échappement des microbes à l’immunité innée : Listeria échappe aux phagosomes et accède au cytoplasme pour infecter d'autres cellules. 16 OZENNE Tristan, ROURE Inès, TODESCHINI Aline et GIORDANO Léonie Voici différents mécanismes d’échappement à l’immunité innée : VII. CONCLUSION : On a plusieurs niveaux de protection : le système immunitaire en tant que système multicouches / défenses innées (barrières) La phagocytose : se produit dans le compartiment vésiculeux / pas une propriété d'un seul type de cellule / diversité d'effecteurs. Il y a une reconnaissance des motifs (‘patterns’) par la réponse immunitaire innée : PAMP et PRR dans tous les compartiments cellulaires: principe de reconnaissance innée des agents pathogènes Les conséquences fonctionnelles de la reconnaissance des agents pathogènes : l'induction de l'expression des gènes La réponse inflammatoire permet le recrutement et la différenciation in situ des cellules immunitaires sur le site de l'infection: chimiotaxie. 17 GIORDANO Léonie, ROURE Inès, TODESCHINI Aline et OZENNE Tristan CHAPITRE II : LES ANTICORPS Le système immunitaire adaptif commence plus tard (plusieurs jours). Les anticorps sont produits par des lymphocytes B. I. MECANISME CREANT LA DIVERSITE DES ANTICORPS A. Activité neutralisante dans le sérum d'individus immunisés Ici on voit les morphologies des cellules HeLa infectées par un virus. Après 24h les cellules meurent. Là on voit un essai de neutralisation (avec sérum) utilisant des monocouches de cellules infectées par un virus. Taches blanches : plaques lytiques causées par l’infection par le virus Cellules vivantes colorées au bleu après l'analyse. Il y a que 2 puis où les cellules sont vivantes, c’est ceux où il y a le sérum (positifs). Ce sérum possède donc une activité neutralisante. C’est quoi un serum ? la partie de sang sans les cellules (presque égale au plasma) : - Sang coagulé : plasma (ajout d’anticoagulant) - Sang avec caillot : sérum (pas d‘anticoagulant) Les anticorps se trouvent dans le plasma et le sérum. On peut titrer cette activité neutralisante : Colonne + : on peut voir que pour certaines dilutions l’activité neutralisante marche mais pour d’autre un peu moins (moins bleu foncé) Colonne - : pas d’activité neutralisante (bleu clair) 1 GIORDANO Léonie, ROURE Inès, TODESCHINI Aline et OZENNE Tristan Sur la figure ci-dessous, on voit le niveau d’anticorps dans le sérum en fonction du temps : Lorsqu’on a des antigènes A, on développe des anticorps anti-A → c’est la réponse primaire Si on a des antigènes B en plus des A → on a une réponse contre le A qui sera plus grande et plus rapide que pour le B. L’activité neutralisante est sensible aux protéases car les anticorps sont des protéines. On peut faire l’électrophorèse des protéines du sang : les anticorps se trouvent dans la fraction à faible migration (gamma-globulines) Sur cette électrophorèse, on a 3 types d’échantillons : - Cas n°3 : patient normal : les gamma globulines ont des bandes diffuses car les immunoglobulines (anticorps) dans le sérum contiennent de multiples espèces moléculaires (= différentes tailles). Elles apparaissent comme un ‘smear’ (‘frottis’) dans les gels d'électrophorèse - Cas n°2 il n’y a pas de gamma globuline car le patient est agammaglobulinemia et est donc incapable de produire des anticorps - Cas n°1 : il a un cancer des lymphocytes B (= patient myeloma) et on peut observer une bande au bout dû à la protéine myéloma. 2 GIORDANO Léonie, ROURE Inès, TODESCHINI Aline et OZENNE Tristan B. L’histoire et structure des anticorps Au début on pensait à la théorie instructive : les anticorps (en rouge) étaient considérés comme des molécules «flexibles» pouvant être formées par l'antigène en molécules complémentaires. On pensait qu’avec 1 seule protéine on pouvait créer plusieurs anticorps ➔ THEORIE PAS CORRECTE Plus tard : Théorie sélective : la structure tertiaire est déterminée par la séquence primaire : avec 1 protéine on peut former 1 anticorps Maintenant, on connait la structure des anticorps. On voit qu’il y a 2 chaines formant un « Y » : - La chaine lourde = Heavy chain (vert foncé ou bleu) : 440 aa - La chaine légère = Light chain (vert clair ou jaune) : 220 aa Autre manière de visualiser cette structure : il y a des régions : - constante : C ➔ les 2 peuvent être H (lourde) ou L (légère) - variables : V - Fab : se fixe sur les antigènes : antigène binding - Fc : (c pour cristal) : se fixe sur le récepteur Fc - Charnière : région flexible Dû à la structure « Y », il y a 2 sites actifs sur l’anticorps pour se fixer à l’antigène : ceux-ci sont spécifiques à 1 antigène. 3 GIORDANO Léonie, ROURE Inès, TODESCHINI Aline et OZENNE Tristan Il y a plusieurs types de forces non covalentes qui sont impliquées dans ces interactions : - Force électrostatique - Liaison H - Van der Waals - Force hydrophobe ➔ Pas savoir la définition des forces juste savoir le nom des forces Les anticorps se lient à une gamma structure. Ils peuvent fixer : - A : des poches : petites molécules - B : des sillons : acides nucléiques - C : des surfaces étendues : protéines C. Notion d’antigène et épitopes La partie de l’antigène qui se lie avec l’anticorps est appelée l’épitope. 1 antigène peut avoir plusieurs épitopes. Il existe des épitopes : - Linéaire : les aa de l’épitope sont côte à côte - Discontinu/conformationnel : les aa de l’épitope sont à plusieurs endroits de l’antigène. Une distance les séparent. 4 GIORDANO Léonie, ROURE Inès, TODESCHINI Aline et OZENNE Tristan Si on dénature les protéines : - l’anticorps ne reconnait plus l’épitope conformationnel car les pont disulfures sont brisés et les aa ne se retrouvent plus à cotés - Pour ceux linéaires, la dénaturation ne change rien. En revanche d’autres épitopes peuvent devenir accessible aux anticorps. Pourquoi cette forme « Y » ? car cela permet la formation de complexes immuns = complexes antigènes-anticorps. La taille des complexes immuns peut être extrêmement variable. Les complexes immuns activent les mécanismes effecteurs de l'immunité humorale comme : - la voie classique du complément - les phagocytes par leurs récepteurs de Fc La charnière permet à l’anticorps de se fixer à 2 antigènes très proches ou éloignés car elle est très flexible. D. Affinité et avidité des anticorps L'affinité : mesure la force d'interaction entre un épitope et un site de liaison d'antigène d'un anticorps. Il est défini par les mêmes principes thermodynamiques de base qui régissent toute interaction biomoléculaire réversible L'avidité : donne une mesure de la force globale d'un complexe anticorps-antigène. Il dépend de 3 paramètres majeurs : - Affinité de l'anticorps pour l'épitope - La validité de l'anticorps et de l'antigène - Disposition structurelle des parties qui interagissent (on ne le verra pas en détail) 5 GIORDANO Léonie, ROURE Inès, TODESCHINI Aline et OZENNE Tristan E. Réactivité croisée des anticorps 1 anticorps peut réagir avec un autre antigène. On peut avoir des épitopes : - « partagés » : épitopes identiques sur différents antigènes - à réaction croisée : épitopes de structure similaire Explication : Ag A peut se fixer sur anti-A, B ou C. L’épitope de l’Ag A est le même que celui de Ag B. C’est pour cela qu’on l’appelle épitope partagé. En revanche Ag C à la même forme que le A mais pas la même taille : ils sont donc similaires. Dans ce cas les épitopes sont à réaction croisée. F. Utilisation d’haptènes Pour définir la spécificité des anticorps on peut utiliser des haptènes : petits épitopes chimiquement définis. Par exemple sur la figure ci-dessous, les structures chimiques sont assez similaires. Si on injecte cet haptène chez les animaux, on voit que si on immunise 1 animal avec le aminobenzène, celui-ci développe des anticorps contre l’aminobenzène mais cet anticorps ne fonctionnera pas pour les autres structures qui lui ressemble. Cela démontre la spécificité du système immunitaire même pour de petites variations structurelles sur les haptènes. Cela démontre aussi l’énorme diversité d’épitopes que le système immunitaire est capable de reconnaitre. G. La diversité des anticorps Comme on l’a déjà dit il y a des chaines légères et lourdes variables ou constantes. Dans les régions variables on a des régions hypervariables (CDR ou HPV). Ici on a la variabilité en fonction du nombre d’aa à une position donnée. Il y a 3 régions dans lesquelles la variabilité est vraiment haute et la variation est alors appelée « hypervariable » : CDR 1, 2 et 3. 6 GIORDANO Léonie, ROURE Inès, TODESCHINI Aline et OZENNE Tristan Ce sont ces CDR qui se fixent vraiment aux épitopes : H. Naissance de l’immunologie « Southern blotting » : pour cela, on clive l’ADN avec des enzymes de restrictions puis on le met sur un gel d’électrophorèse puis afin d’avoir la possibilité d‘hybrider la sonde d’ADN dans une manière efficace, on transfère (« blot ») les fragments d’ADN vers une membrane, comme une membrane en nitrocellulose. La sonde nous permet de sélectionner la séquence d’ADN voulue car celle-ci deviendra radioactive. Expérience de Tonegawa : il a pris des cellules lymphocytes B tumorales (produisent des anticorps avec la même spécificité). Il a aussi pris des cellules de foie autre que les lymphcoyte B. Il a isolé l’ADN génomique puis a fait le « southern blotting » et il y a utilisé une sonde dérivée de la chaine lourde de myélome (anticorps). Il a vu que si on prend l’ADN génomique dérivé du lymphocyte B : il y a seulement 1 bande. Mais si on fait ça avec d’autres cellules on voit 2 bandes (foie). Pourquoi ? Dans le foie, les régions V et C sont très éloignées l’une de l’autre. L’enzyme de restriction peut couper (petite flèche noire) entre V et C. Pour le lymphocyte B, V et C sont collées. L’enzyme ne peut pas couper au milieu : la région contenant le site reconnu par l’enzyme de restriction de l’ADN n’existe pas. Pour le foie : on va donc avoir une bande pour V et 1 pour C Pour le lymphocyte B : on aura qu’une seule bande reconnu par la sonde. Conclusion : il y a donc une modification d’ADN génomique dans le lymphocyte. Si on regarde le locus de la CHAINE LEGERE : elles sont codées par 3 gènes : - V : variable - J : joining - C : constant Il y a beaucoup de distance entre les différents V, …. Aucune transcription d'ARNm est possible sur une telle distance ! On a donc une recombinaison de l’ADN somatique. 7 GIORDANO Léonie, ROURE Inès, TODESCHINI Aline et OZENNE Tristan Ici par exemple on voit une recombinaison entre V2 et J4. La partie entre V2 et J4 est enlevée et est perdue. ATTENTION : ne pas mélanger avec les exemples des introns qui se trouvent dans ARN et ici c’est ADN Après cette recombinaison, on a la transcription où se passera l’épissage puis la traduction et la formation de la chaine légère. RESUME : Si on regarde le locus de la CHAINE LOURDE : celle-ci possède les gènes : V, J et C et D (= diversity) Il y a 2 évènements de recombinaison requis : - au début : D et J se combinent - après : DJ se recombine avec V Après cela on aura la transcription,... 8 GIORDANO Léonie, ROURE Inès, TODESCHINI Aline et OZENNE Tristan Comparaison entre chaine légère et lourde : Pour la chaine légère il y en a 2 types : lambda (l) et kappa (k). Chez l’homme, on a 45 différents gènes V pour les chaines lourdes ou légères (k ou l). La règle 23/12 : permet d’éviter les événements de recombinaison somatique inappropriés : pourquoi toujours V avec J ? Si on regarde a coté de la région V (l), on a une région RSS (= recombination signal sequence) : - A côté du V on a la région contenant 7/23/9 nucléotides - A côté de J on a : 7/12/9 La jonction de segments de gènes implique presque toujours un RSS de 23 pb et un RSS de 12 pb : c’est la règle de 23/12. 9 GIORDANO Léonie, ROURE Inès, TODESCHINI Aline et OZENNE Tristan Plusieurs enzymes sont impliquées dans ce système de recombinaison. C’est notamment le cas de la protéine RAG qui se fixe sur les RSS de V et va couper l’ADN. RAG se fixe ensuite sur J et on aura la formation d’épingle à cheveux puis ouverture de celle-ci et jonction en V et J grâce à l’ADN ligase Les personnes sont ont des problèmes au niveau de cette protéine ne sont pas capable de produire des anticorps : maladie SCID : Severe Combined Immunodeficiency Après, on peut avoir l’ajout de nucléotides de manière aléatoire par l’enzyme TdT ou l’enlèvement de nucléotides dans cette jonction. Cet ajout de nucléotides permet une diversité jonctionnelle. Comme dit précédemment, c’est possible grâce à la TdT qui peut ajouter des nucléotides de manière : - P : palindromic : jonction « imprécise » des 2 segments (flexibilité) - N : Addition des nucléotides dans une manière aléatoire via Terminal deoxynucleotidyl Transferase (TdT) On voit dans le cas A qu’il y a une coupure de chaque côté puis qu’une enzyme vient ajouter les nucléotides complémentaires pour finir le brin. Dans le cas B, on voit qu’il se passe comme le cas A mais que le TdT a ensuite ajouté les nucléotides « AGT » de manière aléatoire puis qu’une enzyme est venue compléter la séquence. On peut aussi avoir le cas de délétion : par exemple ci-dessous, il y a 1, 2 ou 3 C qui sont enlevés. On produit donc différentes séquences à la fin. 10 GIORDANO Léonie, ROURE Inès, TODESCHINI Aline et OZENNE Tristan Petit exercice récapitulatif des mécanismes de la diversité jonctionnelle : ➔ Séquence de base ➔ Ajout de CGA ➔ Délétion de GT G ➔ Ajout de ACT venant du fait qu’il y a eu une coupure (flèche noire) et que « ACT » est venue se fixer Ici on voit donc bien la différence entre N et P : N est fait de manière aléatoire tandis que P ne l’est pas. On peut également avoir une hypermutation somatique qui introduit des mutations dans les régions V réarrangées : L’hypermutation somatique est impliquée dans l’augmentation de l’affinité des anticorps. Dans le cas d’une réponse tertiaire, elle s’effectue surtout sur le CDR1, CDR2 et CDR3 afin d’introduire plus d’affinité aux anticorps. Le rôle de l’enzyme AID (= Activation-included cytidine deaminase) est très important pour l’hypermutation somatique. 11 GIORDANO Léonie, ROURE Inès, TODESCHINI Aline et OZENNE Tristan En effet, après la production d’une région variable d’ADN simple brin par la transcription, l’enzyme AID d’une cellule B (qui produit les anticorps) attaque une cytidine afin d’introduire une uridine sur la région d’ADN simple brin. C’est à la suite de cet unique évènement que l’hypermutation somatique peut avoir lieu. Conclusion : Parmi les sources de variation de séquences qui se trouvent dans les gènes variables de l'immunoglobuline, on peut avoir : - La flexibilité jonctionnelle → sur CDR3 - L’addition du nucléotide P → sur CDR3 - L’addition du nucléotide N → sur CDR3 - L’hypermutation somatique → sur CDR1, CDR2 et CDR3 Remarque : On n’a donc pas d’addition de nucléotide sur le CDR1 et le CDR2. Ainsi, les sources de la diversité des anticorps sont : - L’assortiment de chaînes lourdes et légères. - Plusieurs éléments V, D et J qui vont donner la possibilité de diversité combinatoire. - La diversité jonctionnelle (flexibilité, nucléotides N et P, délétion) - L’hypermutation somatique L’ensemble des combinaisons de mécanismes donnent la possibilité d’avoir, avec seulement 3 loci (