Sistemas de Amplificación de Señal IHQ PDF

Sistemas de Amplificación de señal en IHQ. Sensibilidad y Especificidad. Dr. Ronald Pérez L. Tecnólogo Médico. Técnica Inmunohistoquímica Directa 3.-Solución Sustrato - Cromógeno 2.-Anticuerpo primario...

Sistemas de Amplificación de señal en IHQ. Sensibilidad y Especificidad. Dr. Ronald Pérez L. Tecnólogo Médico. Técnica Inmunohistoquímica Directa 3.-Solución Sustrato - Cromógeno 2.-Anticuerpo primario específico conjugado con la enzima 1.-Antígeno que se investiga en tejido o célula Técnica Inmunohistoquímica Indirecta 3.-Solución Sustrato - Cromógeno 3.- Anticuerpo 2° de ratón anti-Conejo. Conjugado a la enzima 2.-Anticuerpo primario específico (conejo) 1.-Antígeno que se investiga en tejido o célula Sistemas de detección mixtos. Son sistemas en los cuales se utiliza una enzima cuya reacción con un sustrato genera un producto fluorescente o un precipitado metálico que se deposita en los sitios adyacentes a los complejos Ag-Ac. Sistema enzimático Sistema enzimático inmunometálico. inmunofluorescente. 1) Sistema Peroxidasa Anti Peroxidasa (PAP) y Fosfatasa Alcalina Anti Fosfatasa Alcalina (APAAP) 5.-Solución Sustrato - Cromógeno 4.-Complejo Anticuerpo Antiperoxidasa – HRP de conejo 3.- Anticuerpo 2° de ratón Anti - conejo 2.-Anticuerpo primario específico de conejo 1.-Antígeno que se investiga en tejido o célula Características de los Sistemas “Anti Enzima” Sistemas Altamente Complejos inmunoenzimáticos dependiente de interacciones con menor estabilidad débiles (Ag-Ac) estructural. Primeros Sistemas en ser Producidos. Dependiendo del tipo de enzima acoplado al sistema de detección, los sustratos deben ser incubados de manera diferencial. 2. Sistemas Dependientes de Biotina Vitamina co-factor enzimático en metabolismo de lípidos, proteínas y Biotina carbohidratos. La biotina es una molécula que tiene afinidad natural por algunas proteínas como la Avidina y Estreptavidina (efecto antimicrobiano en aves, reptiles y anfibios). La Biotina tiene además la capacidad de ser unida covalentemente a proteínas (Anticuerpos o enzimas) 2. Sistemas Dependientes de Biotina Avidina (de la clara de huevo) glicoproteína con pi = 10, por lo que puede unirse inespecíficamente a tejidos con carga negativa a pH 7. Streptavidina (de streptomicis avidinii). proteína con pi = 5 no se une electrostáticamente a los tejidos a pH 7 2. Sistemas Dependientes de Biotina- Streptavidina (Sistemas ABC). 5. Solución Sustrato – Cromógeno 4. Complejo Streptavidina – Biotina. 3. Anticuerpo Secundario Biotinilado 2- Anticuerpo Primario 1. Antígeno en la muestra 2. Sistemas Dependientes de Biotina- Streptavidina (Sistemas ABC). Desventajas de los Sistemas ABC Ventajas de los Sistemas ABC Presencia de Biotina Unión Biotina-Avidina y Biotina- endógena en tejidos à Streptavidina forma un enlace no Falsos positivos. covalente con mayor fuerza que uniones Ag-Ac. Sistema de detección en incubación por dos pasos. Afinidad por la Biotina reduce los tiempos de incubación. 2. Consideraciones de uso de los Sistemas ABC Tejidos Problemáticos con el uso de sistemas de detección dependientes de Biotina. Hígado y Riñón. Marcación Citoplasmática Granular en tejidos de proveniencia renal o hepática. Bloqueo previo con avidina o streptavidina. 3. Señal Catalizada de Amplificación (Sistemas CSA, TSA y CARD. CSA Catalysed Signal Amplification TSA Tyramide Signal Amplification CARD Catalysed Reporter Deposition Nomenclatura comercial diferenciada. Sistemas dependientes de enzimas y sustratos que pueden ser cromógenos o fluorescentes. 3. Señal Catalizada de Amplificación (Sistemas CSA, TSA y CARD. Molécula Central de Sistemas TSA. En presencia de la HRP , el H2O2 oxida a la tiramida (compuesto fenólico). El producto intermediario de esta oxidación es un radical libre, que se une covalentemente a moléculas proteica cercanas (residuos de tirosina). 3. Señal Catalizada de Amplificación (Sistemas CSA, TSA y CARD. Etapa 1. Incubación de Sistema de detección dependiente de HRP. (Requerimiento). Etapa 2. Incubación de Cromógeno o Fluoróforo conjugado covalentemente con Tiramida (Sustrato de HRP). Etapa 3. La oxidación de la tiramida produce un radical libre que se une covalentemente a residuos de aminoácidos de tirosina adyacentes a la zona de formación de los complejos Ag-Ac. 3. Señal Catalizada de Amplificación (Sistemas CSA, TSA y CARD. Etapa 1. Etapa 2. Etapa 3. 3. Señal Catalizada de Amplificación (Sistemas CSA, TSA y CARD. Reacción Química Catalizada por HRP une covalentemente la tiramida oxidada a residuos de Tirosina à Complejos de gran estabilidad estructural. 3. Señal Catalizada de Amplificación (Sistemas CSA, TSA y CARD. Desventajas de los Sistemas Ventajas de los Sistemas CARD CARD Uso limitado por alto costo de la Tiramida conjugada con enzimas, Permite diluir los anticuerpos hasta biotina, cromógenos o fluoróforos. 1000 veces à Reducción de los costos. Alta sensibilidad puede entregar alto fondo de marcaje inespecífico. Se puede utilizar como alternativa sobre muestras cuyo proceso de Recomendada para antígenos poco fijación no haya sido idóneo y haya concentrados en las muestras y/o en habido pérdida de Ag por autólisis. situaciones de impedimento de realizar HIER o PIER. 4. Sistemas de Polímero marcado. Basado en un polímero de dextrano marcado con HRP, al cual están conjugados anticuerpos secundarios y enzimas. Pueden conjugarse hasta 120 moléculas de enzima por cada cadena de dextrano. Estructura química del dextrano: -Alto peso molecular (Sobre 120kDa) -Constituido por monómeros de glucosa. -Polímero ramificado complejo. 4. Sistema de Polímero marcado en dos pasos. Polímero DUAL: reconoce 1° Paso 1. Incubación del Ac 1°. de varias especies. Paso 2. Incubación del polímero marcado conjugado con enzimas y Ac 2° anti Fc del 1° 4. Sistema de Polímero marcado en un paso. EPOS (Enhanced Polymer One-step Staining). Principio idéntico a los sistemas de polímero en dos pasos. Utilizado en biopsias rápidas para diagnóstico Inmunohistoquímico Intraoperatorio. Se puede aplicar en cortes por congelación y en tejido procesado rutinariamente. Puede contener fluoróforos o enzimas, pero con acople de Anticuerpos primarios que reconocen epítopos en un paso. 4. Aplicaciones y limitaciones del EPOS. Desventajas Ventajas Gran tamaño molecular y ramificaciones del polímero hacen Se puede aplicar tanto en cortes en difícil su difusión en cortes gruesos congelación como en muestras FFIP. o antígenos de zonas altamente densas (Crowding celular). Método de inmunotinción ultra Alto costo por conjugar anticuerpos rápido para cortes por congelación primarios monoclonales específicos para búsqueda de metástasis en contra 1 sólo antígeno. ganglio centinela en improntas de ganglios linfáticos durante biopsias Recomendada para antígenos poco rápidas. (1999, Richter y cols.). concentrados en las muestras y/o en situaciones de impedimento de realizar HIER o PIER. 5. Stripping para Inmunohistoquímica en IHQ de doble marcaje con primarios de la misma especie. Paso 1. Incubación de Ac 1°. Paso 3. Revelado con sustrato cromógeno. Paso 2. Incubación de Sistema de detección. Paso 4. Eliminación de Complejos Ag-Ac de 1er marcaje y mantención de producto de reacción insoluble (cromogénico o fluorescente). 5. Formas de realizar Stripping para IHQ en protocolos de doble marcaje con 1° de la misma especie. Objetivo Lograr que el Sistema de detección del 2°marcaje no reconozca a los Ac primarios del primer marcaje. 1. Después del primer marcaje, incubar con una solución de Alta osmolaridad para producir estrés Estrategias osmótico y desestabilizar las uniones entre los Ac 1°y los sistemas de detección, manteniendo el producto insoluble de la 1er marcaje. 2. Después del primer marcaje, incubar 3. Después del primer marcaje, incubar con Fijador químico que denature los con Buffer a alta T°que denature los Ac 1°y los sistemas de detección, pero Ac 1°y los sistemas de detección, pero mantenga el producto insoluble de la mantenga el producto insoluble de la 1er marcaje. 1er marcaje. 5. Resultados del Stripping para IHQ en protocolos de doble marcaje con 1° de la misma especie. Requerimiento à Que los cromógenos y fluoróforos del 1er marcaje, sean distintos a los cromógenos o fluoróforos del 2do marcaje. 6. Sistema de Micropolímero marcado. Características En su estructura no conjuga el Ac 2°completo, sino que sólo el fragmento Fab. efectos 1. Eliminación del Fragmento Fab reduce el tamaño molecular. 1. Reduce el Reconocimiento inespecífico por receptores de Fc en los tejidos. Mayor difusión en zonas de alto crowding. Mayor difusión en cortes por congelación o muestras citológicas. 6. Sistema de Micropolímero marcado en uno y dos pasos. (Ambos para IHQ indirecta). Sistema en un paso Sistema en dos pasos Utiliza un Polímero con Fab anti Fc de 1° Utiliza un anticuerpo linker que reconoce al 1°, y dicho anticuerpo Linker es reconocido por los Fab que conjuga el micropolímero. 7. Sistemas de Amplificación Comerciales Optiview Universal Detection Kit. Ultraview Universal Detection Kit. VENTANA VENTANA Mayor difusión por formación de Unión entre 1°y 2°se produce por HRP multimérica. hapteno que facilita el reconocimiento. à Actúa como sistema universal. 8. ¿Cuánto resuelve la Técnica IHQ? RESOLUCIÓN Marcación Antigénica [Evidencia de la Rx Ag-Ac] “Precisión del detalle en las imágenes de las marcaciones realizadas. Cuanta más señal exista por unidad de área, mayor resolución. En general, los protocolos con ¿De qué depende? más capacidad de resolución producen una 1. Capacidad de Interacción del Ac calidad de imagen mejor, y 1ro con su Ag. una interpretación más 2. Capacidad de generar Señal de certera. Marcaje del Sistema de Detección. 8. Estudio de la Resolución Diagnóstica Medidas de Sensibilidad y ¿Cuánto resuelve una Especificidad Técnica Diagnóstica? 8. Resultados del proceso diagnóstico Verdadero positivo: muestra positiva con examen positivo. Falso positivo: muestra negativa con examen positivo. Verdadero negativo: muestra negativa con examen negativo. Falso negativo: muestra positiva con examen negativo. 9. Sensibilidad y Especificidad Sensibilidad: capacidad de la prueba (protocolo, método, reactivo, anticuerpo, colorante, etc) para detectar la enfermedad (molécula a identificar) en sujetos enfermos (muestras positivas). Proporción de enfermos correctamente identificados. Sensibilidad: 100% - % de Falsos Negativos. Especificidad: capacidad de la prueba para detectar la ausencia de la enfermedad en sujetos sanos. Especificidad: 100% - % de Falsos Positivos. 9. Sensibilidad y Especificidad para un Marcador IHQ 10. Métodos de expresión de la SE de una prueba diagnóstica Curvas ROC: Receiver Operating Characteristics. Area Bajo la Curva: 1 - 0,9: desempeño ideal. 0,9 - 0,8: desempeño aceptable. 0,8 - 0,6: mal desempeño. 0,5 o