Screening e High-Throughput Screening (HTS) in Chimica Farmaceutica PDF

Hit Discovery HTS screening Hit: una molecola organica iniziale capostipite di una nuova classe di prodotti in un programma di ricerca – Attività micromolare verso il target biologico – Basso peso molecolare (es: MW 150-250) – Assenza di gruppi funzionali indesiderati – Trattabilità chimica ed espan...

Hit Discovery HTS screening Hit: una molecola organica iniziale capostipite di una nuova classe di prodotti in un programma di ricerca – Attività micromolare verso il target biologico – Basso peso molecolare (es: MW 150-250) – Assenza di gruppi funzionali indesiderati – Trattabilità chimica ed espandibilità – Spazio brevettuale sufficiente Lead: una molecola organica già parzialmente sviluppata (nel corso dell’hit-to-lead process) che abbia la potenzialità di essere testata in vivo – Attività submicromolare verso il target biologico – Attività in sistemi cellulari e possibilmente in modelli in vivo – Proprietà chimico-fisiche predittive di buon comportamento in vivo (drug-likeness) – Alcune proprietà ancora da ottimizzare per farne un prodotto di uso clinico (es. Solubilità, legame alle proteine del plasma (PPB), stabilità metabolica, etc.) Screening e highthroughput screening (HTS) Per HTS si intende un processo tramite il quale un numero elevato di molecole può essere esaminato, in modo automatizzato, per l’identificazione di un’attività farmacologica Cos’è un saggio? ! Un Sistema artificiale per determinare e quantificare l’attività biologica di un composto ! Esempi: ! ! Inibizione enzimatica ! Agonismo/antagonismo recettoriale ! Proliferazione cellulare/inibizione della crescita ! Blocco/attivazione di un canale ionico Screening biologico: ! HTS: screening biologico applicato ai grandi numeri 104-105 composti al giorno E’ richiesto un elevato grado di automazione L’uso di un saggio per identificare e caratterizzare composti con un’attività biologica. ! ! Questa tecnologia presuppone un elevato livello di automazione in molte sue compenenti: ! Pesata, diluizione e prelievo delle molecole da saggiare ! Preparazione del saggio biologico (reazione enzimatica o saggio di binding) ! Cattura dei risultati di binding o di inibizione del target Elementi necessari per condurre un HTS ! ! ! ! Una collezione di molecole da studiare: libreria molecolare Un saggio biologico adattato all’esecuzione automatizzata (BIOWARE) Una piattaforma robotizzata (HARDWARE) Un sistema computerizzato per la valutazione dei risultati (SOFTWARE) Collezione di composti per lo screening ! Una collezione e’ un insieme di composti, di diversa origine, che possono essere utilizzati per lo screening. ! Questi composti possono derivare da: - Composti proprietari sintetizzati nel corso degli anni per diversi progetti - Composti commerciali acquistati da vari fornitori Collezione di composti ! Collezioni derivanti da progetti di chimica farmaceutica: ! ! ! ! Composti naturali, prodotti di fermentazione, estratti ! ! ! ! ! I composti tendono ad essere correlati (analoghi per le SAR) Ben caratterizzati (spesso drug-like) La “storia” insegna che hits per nuovi targets spesso derivano da altri composti target Complessita’ delle miscele Riproducibilita’ nell’ottenimento dei campioni o nel far crescere gli organismi Forniscono farmaci molto importanti (antitumorali, malattie infettive) Ingegnerizzazione di microrganismi per la sintesi dei composti naturali (biologia combinatoriale) Composti derivanti dalla chimica combinatoriale ! ! Vantaggi: le collezioni possono essere progettate e possono essere anche molto numerose La grandi collezioni di composti delle grandi Svantaggi: problemi della qualita’ della libreria industrie farmaceutiche sono state costruite in questa maniera Costruzione della collezione di composti per lo screening ! Una collezione di composti viene “filtrata” prima dello screening ! Lo screening della collezione dovrebbe fornire buoni composti di partenza (hit) per lo sviluppo/ottimizzazione successivi Evitare falsi positivi Evitare composti che possono presentare problemi di varia natura (proprieta’ chimico-fisiche sfavorevoli, tossicita’ etc) Complessita’ molecolare Peso molecolare Lipofilia ! Gruppi funzionali che conferiscono reattivita’ o tossicita’ Ad es. ! ! Dopo la selezione di un bersaglio, viene definita una strategia di generazione di lead. ! Elaborazione HTS di un saggio primario ! Saggi secondari per la conferma e la validazione degli hit. L'obiettivo generale è ! la generazione di un gran numero di hit validati con una vasta diversità chimica ! l'identificazione di diverse serie di lead con relazioni ben definite tra struttura e attività. Questi composti entrano poi in un processo di ottimizzazione del lead. Target dei saggi Recettori accoppiati a proteine G ! Binding assays detect compounds that are ligands of the receptor ! Functional assays probe the signaling of the receptor within the cell. ! Direct measurement of G-protein activation using the non-hydrolyzable GTP analogue 35S-GTPgS. ! Fluorescent GTP analogues that show an enhancement of their emission upon binding to the Ga subunit. ! Determination of the concentration change of secondary messengers upon receptor activation due to the action of the effector proteins AC and PLC ! cAMP: detection of the cAMP produced by the cell in a competition assay with a labeled cAMP analogue (tracer) and a mono- or polyclonal cAMP antibody ! Ca2+: cell-based fluorimetric assays Operazioni da effettuare per un saggio convenzionale Assay ! Per effettuare un saggio di binding con ligando radiomarcato, sono necessarie diverse operazioni: ! Preparazione dei campioni: Si preparano campioni contenenti il recettore di interesse, ad esempio proteine o tessuti cellulari, in un ambiente appropriato per il saggio. ! Aggiunta del ligando marcato + ligando da testare a varie concentrazioni e incubazione dei campioni: I campioni contenenti il recettore vengono incubati con il ligando radiomarcato. Questo permette al ligando di legarsi al recettore, se presente, formando il complesso ligando-recettore. Se è presente un composto che compete con il ligando radiomarcato si osserverà una diminuzione della radioattività ! Separazione del complesso ligando-recettore non legato: Dopo un periodo di incubazione, si procede alla separazione del complesso ligando-recettore legato dal ligando non legato. Questo può essere fatto tramite diverse tecniche, come la centrifugazione o la filtrazione. ! Misurazione della radioattività: La quantità di ligando radiomarcato legato al recettore viene misurata utilizzando un contatore di radioattività. Questa misura fornisce informazioni sulla quantità di legame tra il ligando e il recettore, consentendo l'analisi del saggio. Questi sistemi permettono di quantificare la funzione biologica Come si misura l’attività? ! Both cell-free and cell-based assays can be performed in a heterogeneous or homogeneous format. ! Heterogeneous assays are multistep assays that can involve multiple additions, incubations, washings, transfer, filtration, and reading of the signal. ! ! The homogeneous assays, also called “mix-and-measure assays” ! ! These assays are labor-intensive, generally more difficult to automate, and in most cases only medium-throughput assays. All components of the assays are added in a stepwise manner, or ideally as mixtures, and the signal is ultimately read by a plate reader. Molti formati differenti, comprendenti: ! ! ! Tracers radioattivi Sistemi fluorescenti, luminescenti e colorimetrici Sistemi cellulari che possono includere metabolismo, potenziali di membrana e misure di sistemi reporter accoppiati alla trascrizione Metodi di lettura in HTS ! Metodi radioattivi ! Prodotti o ligandi radiomarcati devono essere separati dal substrato radioattivo o dal radioligando libero per filtrazione, precipitazione o adsorbimento ! Altamente sensibili e quindi possono essere miniaturizzati ! Fasi di separazione e/o lavaggio possono essere laboriosi ! La preparazione di traccianti marcati puo’ essere difficoltosa ! ! Scintillation Proximity Assays sono metodi di seconda generazione Si dividono in saggi di binding e saggi funzionali (es. Misurazione dell’attivazione della proteina G usando l’analogo non idrolizzabile del GTP, 35S-GTPgS) Scintillation Proximity Assay (SPA) ! Un agente di scintillazione viene incorporato su una microsfera e il target di interesse viene immobilizzato sulla sfera. ! 3H e 125I (emettono particelle b a bassa energia) ! No 14C, 35S o 33P (la radiazione b-arriva a distanze troppo elevate) ! Le microsfere sono fatte di yttrio silicato coperto con ioni di cerio come agente di scintillazione SPA bead SPA bead Low energy radioisotopes (3H and 125I) as labels due to their short range electron emission When bound close to a solid scintillator surface during the binding reaction, electron energy is transferred to the scintillator and the resulting photons can be captured by scintillation counting Electrons emitted from labeled molecules not close to the surface dissipate their energy and are not detected. Binding assays can take advantage of this technology and avoid the usual filtration or washing procedures. Saggi di binding recettoriali: recettori immobilizzati e ligandi radiomarcati SPA bead Aumento del segnale (Sintetasi): substrato accettore biotinilato, substrato donatore radiomarcato SPA bead Diminuzione del segnale (enzimi idrolitici): substrato radiomarcato legato via biotina a microsfere ricoperte di avidina P SPA bead SPA bead L’azione di enzimi come polimerasi, trasferasi e kinasi causano il trasferimento della radiomarcatura sul substrato biotinilato. Dopo la reazione il prodotto radiomarcato viene catturato dalla streptavidina che riveste la perla, causando una aumento del segnale Cattura del prodotto: prodotto radiomarcato catturato via anticorpo Nucleasi, proteasi, esterasi, fosfolipasi Peptidi fosforilati dall’azione delle kinasi FlashPlates - SPA senza microsfere Legame del recettore o del target sulla piastra Tracciante radiomarcato Solo il tracciante legato viene misurato UV With an appropriate substrate it is possible to measure the activity directly by recording the color change in the well that originates from the differences in the absorbance spectra between the educt and the product of the reaction. In cases where the educt and product are colorless, a further chemical reaction is carried out to produce a colored final product. Metodi di lettura in HTS Metodi colorimetrici I metodi colorimetrici usano la densita’ ottica della soluzione nel pozzetto o il suo cambiamento come parametro di lettura Saggi di assorbanza: Il NADH assorbe a 340 nm, NAD+ non assorbe….misurazione dell’attivita’ delle deidrogenasi Saggi cromogenici: un substrato contenente un cromoforo modificato durante una reazione ! Bassa sensibilita’ rispetto ai saggi fluorimetrici o radioattivi Interferenza da parte di composti colorati della libreria Sensibilita’ della lunghezza del cammino ottico e cambiamento del menisco per aggiunta del composto al pozzetto Metodi di lettura in HTS ! Metodi fluorimetrici Altamente sensibili – adatti alla miniaturizzazione ! Fluorescence polarization (FP) ! Fluorescence Resonance Energy Transfer La fluorescenza e’ un processo ciclico di assorbimento ed emissione di fotoni da parte di un fluoroforo L’assorbimento di un fotone da una sorgente luminosa (lampada a incandescenza o laser) determina l’eccitazione del fluoroforo Passaggio da So a S1 Dopo pochi nanoseondi (parte dell’energia e’ dissipata come calore o con altri processi che dimunuiscono la probabilita’ che avvenga l’emissione di fluorescenza) il fluoroforo torna allo stato di riposo emettendo un fotone (ad una lunghezza d’onda diversa da quella di assorbimento ! Metodi fluorimetrici Fluorescenza ! I fluorofori sono generalmente rigidi, planari ed estesamente coniugati attraverso sistemi p. ! Grandezza e PM ! Solubilita’ in soluzione acquosa (evitare lo stacking) ! Differenza tra lunghezze d’onda di emissione e assorbimento ! Coefficiente di estinzione (probabilita’ di assorbimento) ! Efficienza quantica (probabilita’ di emissione) ! Tempo di vita dello stato eccitato …..con proprieta’ ottimizzate la sensibilita’ dei metodi fluorimetrici e’ da 100 a 1000 volte superiore rispetto ai saggi colorimetrici Saggi ad intensita’ di fluorescenza ! Viene letto un aumento o diminuzione dell’intensita’ di emissione Saggi fluorogenici: il reagente non e’ fluorescente e il prodotto e’ un fluoroforo o viceversa (reazioni enzimatiche) Quenching della fluorescenza: il cambiamento di fluorescenza origina dall’interazione fisica del fluoroforo con un un ambiente locale o con un marker non fluorescente ! quenching dinamico ! quenching statico The peptide substrate is labeled at the amino terminus with EDANS as a donor fluorophore and at the carboxyl terminus with DABCYL. In the intact peptide, fluorescence resonance energy transfer (FRET) from EDANS to DABCYL results in quenching of the EDANS fluorescence. On cleavage of the peptide by HIV protease, the fluorescence of EDANS is restored. Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) ! ! ! ! Il FRET e’ il trasferimento non-radiante di energia tra una molecola donatrice e una accettrice Sovrapposizione tra l’emissione del donatore e l’assorbimento dell’accettore Il trasferimento di energia dipende dalla distanza tra accettore e donatore Le distanze coinvolte sono quelle rilevanti in biologia FRET ! The FRET donor is a coumarin dye, which is covalently linked to a phospholipid. ! The acceptor is a highly fluorescent, membrane-soluble anionic oxonol dye. ! When the cell membrane is loaded with the dyes, the phospholipid anchors the coumarin donor to the outside of the cell, whereas the oxonol dye is accumulated in the cell membrane. ! The distribution of the anionic oxonol in the membrane depends on the polarity of the membrane potential: if the oxonol dye is located on the extracellular side of the membrane in close proximity to the coumarin donor, FRET occurs and the emission is mostly at 580 nm. ! If the polarity changes, the oxonol rapidly translocates to the intracellular side of the membrane, too far from the coumarin donor for FRET, and the emission is mostly at 460 nm. Fluorescence polarization (FP) ! La tecnica FP usa una luce polarizzata di eccitazione per rilevare cambiamenti nella mobilita’ rotazionale di un fluoroforo. ! In seguito a illuminazione con una luce linearmente polarizzata il fluoroforo in soluzione ha la massima possibilita’ di assorbire un fotone quando ha una orientazione parallela al vettore della luce incidente ! Se la molecola fosse ferma l’emissione sarebbe anch’essa fortemente polarizzata ! In realta’ durante l’eccitazione il fluoroforo puo’ ruotare: diffusione rotazionale ! rho: Tempo di correlazione rotazionale ! (T, viscosita’ e volume molecolare) ! tau: tempo di vita dello stato eccitato ! Se rho > tau emissione polarizzata ! Se rho < tau emissione non polarizzata Tipi di saggi ! Aumento della grandezza: saggi di competizione ligando-recettore ! Diminuzione della grandezza: una molecola fluorescente grande viene degradata ad una piu’ piccola (proteasi etc) ! Saggi indiretti: saggio competitivo in cui un prodotto non marcato di una reazione enzimatica compete con un tracciante fluorescente per il legame ad un anticorpo specifico Chemioluminescenza e bioluminescenza Processi in cui la luce viene generata durante reazioni chimiche o biologiche (reazioni esotermiche in cui una parte dell’energia di reazione viene convertita in fotoni) ! Chemioluminescenza: la molecola e’ convertita in un prodotto finale stabile dopo decadimento di un intermedio instabile Luminol ! Bioluminescenza: include reazioni di fotoproteine come aequorin ed enzimi come le luciferasi - Flash luminescence: reazione veloce che produce un segnale luminoso molto intenso ma di breve durata - Glow luminescence: la reazione e’ piu’ lenta e il segnale luminoso ha una maggiore durata. Ca2+-triggered coelenterazine-binding protein (CBP) is a natural form of the luciferase substrate involved in the Renilla bioluminescence reaction. It is a stable complex of coelenterazine and apoprotein that, unlike coelenterazine, is soluble and stable in an aquatic environment and yields a significantly higher bioluminescent signal. The AequoScreenTM system developed by Euroscreen utilizes this bioluminescent Ca2+-indicator in cell-based assays. Bioluminescence resonance energy transfer (BRET) ! Metodo per valutare interazioni proteina-proteina ! Una luciferasi bioluminescente viene fusa ad una proteina candidato ! Una green fluorescent protein (GFP) viene fusa all’altra proteina di interesse ! La reazione della luciferasi genera bioluminescenza blu ! Se le due proteine sono vicine si ha un trasferimento di energia alla GFP ! Il colore della luce di emissione cambia dalla bioluminescenza blu alla biofluorescenza eccitata verde Identificazione degli Hits ! Processo - Il risultato dello screening di un grande numero di composti e’ solitamente una tabella che riporta la % di inibizione di ogni composto - Da questa lista occorre selezionare quali composti inviare alla riconferma, che consiste nella determinazione del valore di IC50 - La selezione puo’ anche essere basata su una percentuale soglia (cut off) di inibizione Active hydrazones Compounds to be tested -Modifications at Ar Compounds to be tested -Modifications at the linker Binding Site Analysis NDM-1, 249 ų VIM-2, 320 ų IMP-18, 319 ų The AA involved in metal coordination: Zn1: His-His-His Zn2: His-Asp-Cys IMP-1 (PDB ID: 1DD6) was used to model IMP-18; sequence identity 83%. Homology modeling was performed in Prime by using a single template based alignment and default settings due to the high degree of identity. The binding site was analyzed by means of SiteMap (Schrödinger). High-Throughput Docking 16 compounds selected for testing: 2 hits active on VIM-2 7 hits active on NDM-1 4 hits active on IMP-18 Our library: 5-, 6-, 7-membered heterocycles bicyclic and tricyclic structures chiral compounds peptides and peptidomimetics …. 1 hit active on both VIM2and NDM-1: Cpd 1 2 hits active on both NDM-1 and IMP-18 1st selection: ChemScores (> 40), visual inspection & unique cluster solution 2nd selection: predicted logP & logS, MW, and chemical tractability Hydrazonelinker Heterocyclic core Zinc-binding group La collezione perfetta di composti per HTS ! ! Composti lead-like e ottimizzabili: ! MW 150-400 ! # anelli: 1-4 ! HBA 8 & HBD 5 ! Gruppi funzionali selezionati ! Rimozione degli analoghi con similarità >85% Saggi effettuati in presenza di detergenti (es. 0.01% di Triton X-100) …forse rimane qualche problema ! Tempo sprecato nella ottimizzazione di hit ! In alcuni casi le proteine vengono marcate* o l’attività scompare** risintetizzando o purificando il composto ! SAR piatte o non interpretabili ! Composti simili appaiono in numerosi screening Hit compound ricorrenti ! Composti hit che appaiono in diverse campagne di screening sono indicatori di promiscuità, quindi vanno identificati ed eliminati dalle librerie ! Osservazione: alcune classi erano ricorrenti, non i composti individuali ! Necessità: in quanti screening diversi una classe di composti deve fornire hit compounds per essere considerata non-specifica (e quindi problematica)? La differenza tra classi di composti “clean” e “dirty” ! Sottostrutture “clean” contengono 8-16% di composti attivi in 2-6 screening ! Sottostrutture “dirty” contengono >40% di composti attivi in 2-6 screening PAINS: Pan-assay interference compounds ! Falsi positivi - Possibili meccanismi ! Formazione di aggregati ! Assorbimento o emissione a lunghezze d’onda rilevanti ! Impurezze metalliche derivanti dal processo di sintesi ! Chelazione di ioni metallici importanti per il funzionamento della proteina ! Reattività con con ossigeno singoletto ! Redox cyclers: produzione di acqua ossigenata che inattiva il target proteico ! Composti “appiccicosi” che si possono legare a numerosi siti delle proteine Rodanine ! Quali sono le ragioni della promiscuità? ! Non può essere solo l’interferenza con il segnale, altrimenti avremmo 6 positivi su 6 Rodanine ! Quali sono le ragioni della promiscuità? ! Non può essere solo l’interferenza con il segnale, altrimenti avremmo 6 positivi su 6 ! Reazione covalente irreversibile con proteine indotta dalla luce ! ! Formazione di legami covalenti-reversibili con le proteine ! ! (TNF-a - Voss et al BMCL 13 (2003) 533, Carter et al, PNAS 98 (2001) 11879) Hepatitis C virus RNA- dependent RNA polymerases - Powers et al, JMC 49 (2006) 1034; Lee et al JMB 357 (2006) 1051 Chelazione dello zinco del sito attivo ! (anthraxlethalfactor-Forinoetal. Proc.NatlAcad.Sci USA 2005, 102, 9499-9504) Meccanismi molteplici di interferenza con i saggi ! ! Se una classe di composti è coniugata, redox-attiva, chelante e reattiva nei confronti delle proteine ! può interferire con il sistema di lettura del saggio quasi a tutti i livelli ! dal target alla cellula senza alcun meccanismo comune Un PAINS alchilidenico a struttura rodaninica ! Molto citato in letteratura e utilizzato come strumento farmacologico (citotossicità mediata da Bcl-2) ! E’ stato dimostrato successivamente che la citotossicità osservata non era in relazione al meccanismo proposto Aralchilpirroli ! L’attività scompare per purificazione ! Degradazione? ! Possono formare polimeri Triaging of hits must always be done with an awareness of the target class and the specific goals of the project in mind. For example, cysteine protease inhibitors require a reactive functional group, although those may be undesirable for other targets. The AIDS drug AZT (also known as zidovudine or ZDV) contains an azide functional group The anti-cancer drug ixabepilone contains an epoxide function both are reactive functionalities that would be eliminated by some filters. There is also a growing appreciation that careful installation of reactive functionalities in certain cancer drugs can lead to very effective enzyme inhibitors. By some estimates, approximately 25% of known drugs would be eliminated by these filters. Lo screening identifica composti attivi Quale strategia di screening? Gli aspetti da considerare ! Considerazioni tecniche ! ! ! ! Formato del saggio Approvvigionamento di reattivi, cellule e tessuti Costi Considerazioni biologiche/mediche ! ! ! ! ! ! Validazione dei biomarker per la predizione dell’efficacia clinica Il meccanismo è stato completamente elucidato? Validazione del target Fornitori e proprietà delle molecole da sottoporre a screening First in class vs classi già validate Differenza rispetto ad altri medicinali Saggio biochimico o cellulare? ! Saggio biochimico ! Target purificato (enzima, intereazione proteina/proteina, recettori (solubili o di membrana) ! Specificità ! SAR precisa Espressione e purificazione del target HTS: formato del saggio Volumi: 3-15 uL Capacità delle piastre: 96 vs 384 vs 1536 ! Saggio cellulare ! Molti target contemporaneamente ! Promiscuità SAR influenzata da altre proprietà del composto Compatibilità delle cellule con il saggio Lo screening fornisce dati di IC50 o EC50 Even using radioligand at a concentration equal to nine times its Kd will only lead to its binding to 90% of the receptors La curva dose-risposta dipende dal tipo di saggio Effetti di competizione possono spostare la curva dose-risposta in condizioni di equilibrio Slow Binding Kinetics can Limit Competition in Non-equilibrium Systems Il meccanismo di azione molecolare (MMOA) ! MMOA: meccanismo biochimico attraverso il quale le interazioni strutturali tra il farmaco e il suo target determinano una risposta funzionale ! ! include aspetti cinetici e i cambiamenti conformazioni che forniscono scpecificamente una risposta terapeuticamente utile E’ diverso dal meccanismo di azione: Definizione del sistema in cui i farmaci agiscono ! antiinfiammatorio ! antiistaminico ! antivirale MMOA-pharmacological hot spot Aspirina e ibuprofene: due medicinali, un target, differenti meccanismi molecolari, utilizzi diversi ! L’acido acetilsalicilico ha attività antipiastrinica mentre gli altri FANS non ce l’hanno ! ! ! efficace nella prevenzione delle malattie atero-trombotiche Entrambi si legano al sito attivo delle cicloossigenasi 1 e 2 ! L’acido acetilsalicilico causa una inattivazione irreversibile per acetilazione della Ser530 ! L’ibuprofene e altri FANS sono reversibili L’azione irreversibile dell’aspirina nelle piastrine determina effetti anti-trombotici a lungo termine ! le piastine non hanno la capacità di risintetizzare nuova proteina Modulatori del recettore per gli estrogeni: un target, meccanismi molecolari diversi, utilizzi diversi ! Il ligando induce cambiamenti conformazionali che reclutano coattivatori e corepressori in maniera contesto-specifico ! Il differente utilizzo terapeutico dipende sulle conformazioni uniche e specifiche indotte dal ligando Estradiolo: agonista ! ! ! Tamoxifene SERM (modulatore selettivo del recettore degli estrogeni) ! ! deficienza ormonale post-menopausa cancro al seno Raloxifene SERM ! osteoporosi Il paradosso del meccanismo ! Il MMOA definisce l’utilità dei medicinali collegando ! le interazioni molecolari con la fisiologia ! collegando il genotipo al fenotipo ….ma il MMOA è difficile da prevedere a priori Screening target-based o fenotipico? ! Definizioni ! ! ! Screening fenotipico: qualunque screening in cui il MMOA che fornisce un indice terapeutico accettabile non è noto o prevedibile In questo contesto lo screening fenotipico è sinonimo di empirico Utilizzando questa definizione molto ampia lo screening fenotipico include qualunque saggio che non sia targetbased Il valore di un saggio fenotipico è quello di scoprire nuovi MMOA che sono difficili da predire a priori L’identificazione di un MMOA (hot spot farmacologico) fornisce informazioni per la strategia di screening Approccio target-based ! Punti di forza ! Punti deboli ! Fornisce un approccio razionale ! Identificazione e validazione del target ! Allinea il genotipo con il fenotipo Da informazioni sulla selezione dei pazienti nei trials clinici ! Composti attivi sul target potrebbero non funzionare nei saggi fenotipici ! ! Usa approcci di progettazione razionale per l’ottimizzazione ! Stabilisce le dosi cliniche sulla base dell’occupazione del target ! Fornisce una valutazione del rischio Screening fenotipico ! Punti di forza ! Saggi fisiologicamente rilevanti ! Minori assunzioni sul meccanismo ! Valutazione precoce della sicurezza ! Punti deboli ! ! ! ! Sviluppo di saggi fenotipici che siano predittivi della patologia* Identificazione di marker fenotipici validati* Meccanismo di azione non noto Non si possono applicare approcci di design razionale per l’ottimizzazione ! Problemi nella selezione dei pazienti nei trial clinici ! Determinazione della dose Letture di approfondimento ! ! Nature Reviews Drug Discovery volume 13, pages588–602 (2014) Phenotypic screening in cancer drug discovery — past, present and future ! Case study ! Nature volume 519, pages102–105 (2015) ! Axitinib effectively inhibits BCRABL1(T315I) with a distinct binding conformation Target-based or phenotypic workflows Key tropical parasitic diseases Target product profile (TPP) Post-kala-azar dermal leishmaniasis (PKDL) Drug discovery pipeline Target vs phenotypic hit discovery Pros and cons of target vs phenotypic Target-based drug discovery – Target selection criteria Target-based drug discovery – target selection....is the target protein druggable? Target selection – ideal profile Phenotypic screening & cell-based assays Whole-cell signal High-content Pros & Cons Key requirements for cell-based assays Leishmani donovani in vitro cascade Storia della scoperta degli anticorpi contro la tossina difterica ! La storia della scoperta degli anticorpi contro la difterite è un importante capitolo nella storia della medicina e dell'immunologia. La difterite è una malattia causata dal batterio Corynebacterium diphtheriae, che produce una tossina dannosa per il corpo umano. Questa malattia era particolarmente temuta prima dell'avvento dei vaccini. ! La ricerca sugli anticorpi contro la difterite è stata guidata principalmente da due scienziati, Emile Roux e Alexandre Yersin, che lavoravano nell'ambito dell'Institut Pasteur a Parigi. Nel 1888, il batteriologo tedesco Emil von Behring e il fisiologo giapponese Shibasaburo Kitasato, che lavoravano nell'ambito dell'Istituto di Igiene di Berlino, scoprirono che il siero di cavalli precedentemente infettati con il batterio C. diphtheriae poteva proteggere altri animali dalla malattia. ! Behring e Kitasato scoprirono che il siero sottratto da questi cavalli conteneva una sostanza che poteva neutralizzare la tossina difterica. Questa sostanza, che ora sappiamo essere gli anticorpi, è stata chiamata "antitossina difterica". Questa scoperta segnò l'inizio della terapia con siero antitossina difterica, un precursore dell'immunizzazione moderna. ! Emile Roux, lavorando all'Institut Pasteur, svolse ulteriori ricerche sull'antitossina difterica, dimostrando la sua efficacia nel trattamento della malattia. Questi studi sono stati fondamentali per stabilire l'efficacia dell'antitossina nel trattamento della difterite. ! La scoperta dell'antitossina difterica e il suo successivo utilizzo come trattamento rappresentarono un grande passo avanti nella lotta contro la difterite e contribuirono in modo significativo allo sviluppo della medicina moderna e della vaccinazione Classi di proteine terapeutiche Anticorpi Fattori di coagulazione Prodotti dalle cellule B linfocitarie in risposta a patogeni. Proteine essenziali nel processo di coagulazione del sangue. Legano antigeni specifici sulle superfici dei patogeni. Usati per bloccare vie di segnalazione specifiche o indurre la morte cellulare. Usati per trattare emofilia A e B e altre condizioni legate alle emorragie. Ormoni proteici Possono veicolare farmaci citotossici alle cellule tumorali. Secernuti dalle ghiandole endocrine. Gli anticorpi monoclonali sono il tipo più comune. Agiscono come messaggeri chimici per innescare risposte fisiologiche. Esempi includono insulina, eritropoietina e gonadotropina. Enzimi Catalizzano reazioni biochimiche nel corpo umano. Usati nella terapia di sostituzione enzimatica o per modificare bersagli terapeutici. Esempi includono PEG-asparaginasi, sacrosidasi, pegvaliase e laronidasi. Citochine Proteine che mediano la comunicazione cellula-cellula durante le risposte immunitarie. Usate come immunomodulatori per trattare condizioni come la sclerosi multipla e la leucemia a cellule pilifere. Timeline ! Tappe significative nello sviluppo delle proteine terapeutiche ! Storia della produzione dell’insulina ricombinante Timeline ! Tappe significative nello sviluppo delle proteine terapeutiche ! Storia della produzione dell’insulina ricombinante 1982 la tecnologia del DNA ricombinante è stata utilizzata per produrre insulina in un ospite batterico L'uso so della tecnologia del DNA ricombinante ha contribuito a superare le sfide legate sia alla scala di produzione che all'immunogenicità delle proteine derivate dagli animali. Considerando che, in linea di principio, si potrebbe esprimere qualsiasi proteina per la quale sia conosciuto il gene associato, era effettivamente emerso un concorrente valido al lavoro principale della medicina dell'epoca - le piccolo molecole Caratteristiche ottimali per le proteine terapeutiche ! Stabilità ! Aggregazione ! Degradazione (demidazione/ossidazione in vitro; proteolisi in vivo) Denaturazione ! ! ! Sensibilità a variazioni di temperature Adsorbimento sulla superficie dei contenitori PEGilazione Mutazioni sito-specifiche Caratteristiche ottimali per le proteine terapeutiche ! Farmacocinetica ! ! Tempo di eliminazione Farmacodinamica ! Interfernza con funzioni naturali ! Risposte immunitarie indesiderate PEGilazione Glicosilazione Lipidazione Fusione proteica Caratteristiche ottimali per le proteine terapeutiche ! Direzionamento al target ! Capacità di indirizzare i farmaci a tessuti specifici o organi (riduzione effetti collaterali) ! Molte protein sono. Sequestrate in fegato, reni e milza Coniugati farmaco-anticorpo Introduzione di molecole capaci di direzionare al di fuori di questi organi e.g. proteine lgate covalentemente all’aptamero della trasferrina si accumulano nel SNC Caratteristiche ottimali per le proteine terapeutiche ! Rilascio intracellulare ! Le dimensioni relativamente grandi rispetto ai farmaci a piccole molecole e le cariche superficiali eterogenee rendono la maggior parte delle proteine impermeabili alla membrana cellulare. Coniugazione con cell-penetrating peptides «Supercharging» Dense DNA grafting