3. Hafta Endüstriyel Mikrobiyoloji Ders Notları PDF

ZBEUN ECZACILIK FAKÜLTESİ ENDÜSTRİYEL MİKROBİYOLOJİ 3.Hafta DOÇ. DR. ŞÜKRAN ÖZTÜRK 2023 MİKROORGANİZMALARIN ENDÜSTRİDE KULLANIMI Mikroorganizmaların iyileştirilmesinde kullanılan ilk giriş...

ZBEUN ECZACILIK FAKÜLTESİ ENDÜSTRİYEL MİKROBİYOLOJİ 3.Hafta DOÇ. DR. ŞÜKRAN ÖZTÜRK 2023 MİKROORGANİZMALARIN ENDÜSTRİDE KULLANIMI Mikroorganizmaların iyileştirilmesinde kullanılan ilk girişimler yüzyıllardır devam etmektedir; fakat saf kültür halinde ilk izolasyonları çoğunlukla doğal ortamlardan çok sayıda izolatın rastgele taranması sonucu olmuştur. Bu mikroorganizmalar sonrasında endüstriyel kullanımlarındaki özelliklerin geliştirilmesi amacıyla mutagenez veya üretim programları kullanılarak modifiye edilmişlerdir. Son yıllarda da rekombinant teknolojileri kullanılarak endüstriyel suşların iyileştirme çalışmaları hız kazanmıştır.  Endüstriyel Mikroorganizmalar Bir veya daha fazla ürünü yüksek verimde sentezleyebilen metabolik uzmanlardır. Yüksek metabolik uzmanlık sağlayabilmek için, endüstriyel m.o lar soylarını, mutasyon ve rekombinasyon ile genetik olarak değiştirirler. Bu değişiklikler, üretilebilen ürünün verim artışını sağlamaktadır. Faydalı endüstriyel m.o lar doğadan izole edilip geliştirildikten sonra yüksek verimli soylar endüstrinin mikrobiyoloji laboratuvarlarında muhafaza edilirler. Dünyada buna hizmet eden bazı kuruluşlar; Kültür Koleksiyonları; Amerikan Tip Kültür Koleksiyonu (American Type Culture Collection -ATCC) Alman Mikroorganizma ve Hücre Kültürleri Koleksiyonu (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH- DSMZ) Japonya Mikroorganizmalar Koleksiyonu (Japan Collection of Microorganisms- JCM) Refik Saydam Ulusal Tip Kültür Koleksiyonu(RSKK): Refik Saydam Ulusal Tip Kültür Koleksiyonu (RSKK), 1951 yılında Ulusal Tip Kültür Koleksiyonu olarak Türkiye'de kurulan ilk ve en eski suş koleksiyonudur.  Kültür Koleksiyonları; Dünya Kültür Koleksiyonu Federasyonu (WFCC: World Federation for Culture Collections): Mikrobiyal genetik kaynakların korunması amacıyla 1970 yılında kurulmuştur. Uluslararası Birleşik Biyolojik Bilimler ve Birleşik Mikrobiyoloji Cemiyetleri içinde yer alan çok disiplinli bir yapıdır. Avrupa Kültür Koleksiyonları Birliği (ECCO: European Culture Collection Organisation): Avrupa’daki kültür koleksiyonları arasında işbirliği ve iletişimi sağlamak ve koleksiyonlara danışmanlık yapmak amacı ile 1981 yılında da kurulmuştur. WFCC ve ECCO organizasyonları işbirliği içerisinde çalışmalarını sürdürmekte olup araştırmacılar için gerekli olan aktivite ve faaliyetleri gerçekleştirmektedirler.  Yararlı Bir Endüstriyel Mikroorganizmanın Özellikleri Endüstriyel işlem için uygun olan bir organizmanın, yalnızca ilgilenilen maddeyi üretilebilmesinin yanı sıra başka özellikleri de olmalıdır. 1. Organizma büyük ölçekli kültürde üreme ve ürün oluşturma yeteneğinde olmalıdır. 2.Büyük fermentörlere kolayca inoküle edilebilmesi için, tercihen spor ve diğer bazı üreme hücresi formlarını üretmelidir. 3. Hızlı üremeli ve istenilen ürünü kısa zamanda üretmelidir. 4. Endüstriyel olarak yararlı bir organizma,büyük miktarda temin edilebilen ve pahalı olmayan sıvı kültür ortamında üreyebilme yeteneğinde de olmalıdır.  Pek çok endüstriyel mikrobiyolojik işlem, büyük ölçekli kültür ortamlarında ana veya tamamlayıcı bileşen olarak diğer endüstrilerin atık karbonlarını kullanır. Bunlara, mısır meserasyon sıvısı (mısır yaş öğütme endüstrisinin azot ve üreme faktörlerince zengin olan bir ürünü) ve peynir altı suyu (süt endüstrisinin laktoz ve mineraller içeren atık suyu) dahildir.  Yararlı Bir Endüstriyel Mikroorganizmanın Özellikleri 5. Bir endüstriyel organizma, özellikle insanlara ve ekonomik önemi olan hayvan ve bitkilere patojenik olmamalıdır. 6. Endüstriyel fermentördeki yüksek hücre yoğunlukları ve fermentörün dışındaki çevrenin kontaminasyonunun engellenmesi fiilen imkansız olduğundan, bir patojen potansiyel olarak çok önemli problemler oluşturacaktır. 7. Endüstriyel mikroorganizma genetik manipulasyona uygun olmalıdır. Endüstriyel mikrobiyolojide, artmış verimler çoğu kez genetik olarak mutasyon ve seleksiyon yollarıyla elde edilmiştir. 8. Genetik olarak kararlı olan ve kolayca manipüle edilebilen bir mikroorganizma, bu nedenle açık bir avantajdır.  Endüstriyel Proseslerde Üretim Aşamaları Uygun endüstriyel m.o. nın üretimi yada sağlanması, M.o nın geliştirilmesi yada çoğaltılması, M.o nın en iyi üretim gösterdiği optimum koşulların belirlenmesi ve sağlanması (sıcaklık,pH, karbon ihtiyacı..v.b), İstenilen ürünün hangi zaman aralığında veya büyüme fazında en fazla üretildiğinin saptanması, Uygun besiyeri formülasyonu ve substrat seçimi, Uygun koşullarda biyosentez, Ürünün gelişme ortamından ayrılması ve saflaştırılmasıdır. Mikrobiyal Biyoteknoloji Mikroorganizmalar tarafından pek çoğu doğal olarak üretilmeyen yeni mikrobiyal ürünlerin üretimi için gen manipülasyon yöntemlerini kullanır.  SUŞLARIN İYİLEŞTİRME YÖNTEMLERİ 1)Doğal Rekombinasyon: Bakteriler bazı genetik materyallerini konjikasyon, transdüksiyon ve transformasyan işlemleri ile değiş tokuş edebilirler. a)Konjukasyon; Vericinin alıcıyla cinsiyet pilusu adlı filamentli bir protein aracılığı ile temas sağladığı ve iki hücrenin birbiriyle yakın ilişkiye girebildiği bir hücre-hücre teması içerir. Verici plazmidinin veya kromozol DNA’sının tamamını veya bir kısmını kopyalar pilus aracılığı ile alıcıya geçirir. b)Transdüksiyon; Bakteriyel bir virüs bakteriler arasındaki gen aktarımında bir vektör gibi davranır. c)Transformasyon; Kendini çevreleyen besin ortamındaki çıplak bir DNA parçasının hücresel alınımını kapsar. Plazmidler Plazmidler; kromozomal DNA’dan bağımsız olarak kendi kendine replike olabilen, ekstra- kromozomal DNA molekülleridir. Tipik olarak dairesel ve çift sarmallı kendi kendini eşleyebilen kromozomdan ayrı DNA parçasıdır. Genellikle bakterilerde bulunur. Hücrede tek bir kopyaları bulunabildiği gibi tek bir hücrede aynı plazmidin yüzlerce kopyası da bulunabilir. Boyu 1-400 kilo baz çifti arasında değişir. Çoğu plazmid içinde bulunduğu bakteriye selektif avantaj sağlayan genler veya gen grupları taşır. Genetik mühendisliğinde vektör olarak kullanılırlar. Bakteri kromozomu ile bütünleşirse epizomik hal. Kendi aralarında birleşip rekombinant plazmitler. tra geni taşıyanlar kendi transferini sağlarlar. Plazmidleri Sınıflandırılması Başka bir bakteriye kendini aktarabilme yeteneğine göre : Konjügatif plazmidler; tra-genleri taşırlar, Nonkonjügatif plazmidler; konjügasyonu başlatamazlar, ancak konjügatif plazmidlerin yardımıyla, 'kazara' aktarılabilirler İşlevlerine göre sınıflandırma beş ana başlıkta yapılabilir; 1. Fertilite (F) plazmidleri- tra-genleri taşırlar 2. Direnç –Rezisatns (R) plazmidleri 3. Col-Plazmidler: Diğer bakterileri öldürmek için proteinleri kodlayan genleri kodlar 4. Degredatif plazmidler (Yıkıcı) : Farklı maddeleri parçalama yeteneğinde olan plazmidlerdir 5. Virülans plazmidler: Bakterileri patojen hale getiren plazmidlerdir  Restriksiyon Endonükleazlar Restriksiyon enzimi veya restriksiyon endonükleazı çift zincirli DNA moleküllerindeki belli nükleotit dizilerini tanıyan ve her iki zinciri birlikte kesen bir enzim türüdür. Bu özel enzimler, bakteri ve arkelerde bulunurlar ve virüslere karşı bir savunma mekanizmasına aittirler. 300’un üzerinde farklı DNA dizilimini tanıyan yaklaşık 3000 den fazla RE enziminin varlığından söz edilmektedir. Enzimler orijinlerine göre adlandırılır. Aktivitelerine göre sınıflanır. (Tip I, Tip II, Tip III ve homing endonükleazlar) RE’ların doğal biyolojik fonksiyonu, bakteriyel savunma mekanizmasında oynadıkları roldür. Bakteriye giren yabancı DNA’ları da kesebildikleri için, -İntraselüler bakteriyel patojenleri inaktive edebilmekte, bakteriyi virüslerden ve yabancı DNA’lardan korumaktadırlar. Aynı zamanda, bakterilerde bulunan spesifik metilaz enzimleri de, restriksiyon bölgelerine metil grupları ekleyerek, RE’ların bakterinin kendi DNA’sını kesmesini engellemektedir. 2)Mutagenez Suşların iyileştirilmesinde kullanılan geleneksel bir yöntemdir. Mutasyonlar; DNA dizisinin sayısında, yapısında ve nükleotid dizisindeki değişiklilerdir. Mikroorganizmaların tekrarlanan mutagenez döngülerine maruz kalması sonucu uygun şekilde seleksiyonu ve hayatta kalanların taranması, pek çok mikroorganizmanın iyileştirilmesinde etkili bir yöntem olarak kullanılmaktadır. Son yıllarda, özgün genlerde oluşması istenen mutant tiplerin asgari sıklıkla elde edilebilmesi için, hem mutasyona uğrama hem de mutasyon oranlarındaki artışın iyileştirilmesinde, yeni yöntemler geliştirilmektedir.  Delesyon- (EKSİLME) Bir kromozom segmentinin kırılma sonucunda kaybolmasıdır ve dengesizliğe neden olur. İnsersiyon İnsersiyon veya ensersiyon genetikte bir DNA dizisine bir veya daha çok baz çiftinin eklenmesidir. İnsersiyon mutasyonu olarak da adlandırılır. DNA polimerazın kayma yapması sonucu insersiyonlar sık olarak mikrosatelit bölgelerinde olabilir. İnsersiyonlar, büyüklük olarak tek bir baz çiftinden tüm bir kromozama kadar olabilir. İki kromozomdan birinde iki noktada kırık olurken diğerinde tek bir kırılma olur ve çift kırılma olan kromozomdaki parça, tek kırılma olan diğer kromozoma giderek yapışır. Bu kişilerin çocuklarında segregasyon anomalileri nedeniyle insersiyone olmuş parçanın duplikasyonu yada delesyonu gözlenebilir. Kromozom düzeyinde insersiyon aşaması  Dublikasyon Homolog iki kromozomdan birinde çift kırık sonucunda kopan kromozom parçasının diğer kromozomda tek kırık sonucu oluşan aralığa giderek yapışması sonucunda meydana gelir. Ancak duplikasyon olayı daha çok mayozda meydana gelir ve bir kromozom parçasının çift kopya bulunması durumudur. İnversiyon (TERS DÖNME) Bir kromozomda iki farklı noktada kırık olması ve sonrasında bu arada kalan parçanın kendi etrafında ters dönerek eski yerine yapışması olayıdır. Bir inversiyon genellikle taşıyıcılarda anormal bir fenotipe neden olmaz. Çünkü dengeli bir yeni düzenlenim halindedirler.  Translokasyon (YER DEĞİŞTİRME) Bir kromozomdan kopan parçanın başka bir kromozoma yerleşmesi durumudur. Kırılma gösteren kromozomdan birinin kırılan parçası diğerinin kırılan parçası üzerine yapışır. Gen veya kromozom kopya sayışı 3)Mikroorganizmaların Genetik Mühendisliği Son 20 yıldır kullanılan rekombinant DNA teknolojileri endüstriyel mikroorganizmaların yeteneklerine ilave edilecek tüm yeni özelliklere izin vermektedir. Mikroorganizmalar yeni bileşiklerin üretimine aracılık edebilecek veya daha ucuz karışık substratların kullanımına izin verecek ve artan miktarlardaki enzimlerin sentezi bazen de salgılanması için manipüle edilebilir duruma gelmiştir. Mikroorganizmaların ifade edeceği genlerin kökenlerinde bir kısıtlama olmadığından, bitkisel ve hayvansal proteinlerin üretimi de mümkündür. İnsan büyüme hormonu, insüllin, interferonları da içerin değerli ürünler hali hazırda üretilmektedir. Mikroorganizmaların Genetik Mühendisliği Yeni kombinasyonlar Kontrol edilebilir Özgün Nesli tükenen organizmaların dahi genetik bilgileri 4)Bakterilerde Genetik Mühendisliği Stratejileri: Genetik Mühendisliği hücre dışında DNA’nın manipüle edilmesini içerir. Bu durum, ilgilenilen genin verici organizmanın genomundan başlangıç izolasyonuna ve saflaştırılmasına ihtiyaç duyar. İzole edilen DNA dizileri daha sonra modifiye edilebilir ve uygun konukçuya manipüle edilebilir bir vektör aracılığı ile konak organizmaya aktarılmadan önce, ifadelerinin regülasyonu değiştirilebilir. Eğer yabancı DNA, konak bakteri içerisinde başarıyla ifade edilmişse ve heterolog bir protein üretildiyse proteinle reaksiyona giren özgül bir antikorun kullanılmasıyla, seçim yapılabilir. Alternatif olarak rekombinan protein normalde konak tarafından sentezlenmeyen bir enzim ise enzim aktivitesi ölçülebilir. Bakterilerde Genetik Mühendisliği Stratejileri İnsert DNA Restiriksiyon endonükleaz Vektör Konak