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Virus e cellule procariotiche ed eucariotiche Virus e cellule procariote ed eucariotiche VIRUS Dal latino ‘veleno’, fanno ‘una sorta di vita in prestito’, a metà fra sostanze chimiche ed esseri viventi. Unità semplici, fatte da acidi nucleici raccolti in un involucro di proteine. Studi sui virus →...

Virus e cellule procariotiche ed eucariotiche Virus e cellule procariote ed eucariotiche VIRUS Dal latino ‘veleno’, fanno ‘una sorta di vita in prestito’, a metà fra sostanze chimiche ed esseri viventi. Unità semplici, fatte da acidi nucleici raccolti in un involucro di proteine. Studi sui virus → biologia molecolare: i geni sono fatti da DNA, replicazione del DNA, trascrizione, traduzione, manipolazione genetica. Biotecnologia: uso dei virus come vettori per inserire DNA in cellule animali durante la terapia genica. Il primo virus fu scoperto studiando il mosaico del tabacco (TMV): - 1883, Mayer: la malattia si trasmette con la linfa, da un ‘batterio piccolissimo’. - 1893, Ivanowsky: il ‘batterio’ è in grado di passare filtri che trattengono batteri comuni, ‘batterio piccolissimo’ o tossina? - Beijerinck: l’agente patogeno non è una tossina: si riproduce, pero non in terreni o piastre per batteri… Prima volta che si definisce un virus. - 1935, Stanley: cristallizzazione del TMV. - Poi si è visto anche al microscopio elettronico Virus e cellule procariote ed eucariotiche Struttura dei virus Acido nucleico (DNA or RNA) al interno di una capside proteica, a volte involti da una membrana (pericapside), da 20 a qualche centinaia di nm. TMV Adenovirus Virus influenza Batteriofago T4 Elicoidale Icosaedrico Batteriofagi o faggi Virus e cellule procariote ed eucariotiche Genomi virali: DNA o RNA, doppio o singolo filamento, in genere un filamento lineare o circolare, a volte più di uno. Da quattro a circa un migliaio di geni (batterio: da 200 ad alcune migliaia di geni). La scatola: capside, fatta da monomeri proteici, i capsomeri, da uno a pochi tipi per virus. Alcuni virus sono avvolti in una membrana procedente della cellula ospite (pericapside), contenente fosfolipidi e proteine cellulari ma anche proteine virali. In alcuni casi, ci sono degli enzimi virali al interno della capside. Virus del papilloma … da non confondere con altri virus! Virus e cellule procariote ed eucariotiche Ciclo riproduttivo virale I virus si possono riprodurre soltanto all’interno de cellule ospiti: gamma d’ospite. Alcuni sono molto specifici (morbillo – umani), alcuni meno (encefalite equina: zanzare, uccelli, cavalli, umani). In genere tessuto-specifici: raffreddore → epitelio respiratorio. Ingresso: - ospite procariote: per iniezione del genoma virale - ospite eucariote: per endocitosi, per fusione della pericapside. Riproduzione: Uso del macchinario cellulare per fare molte copie del genoma e delle proteine virali. Fuoriuscita: Uscita dei nuovi virus: morte cellulare -> malattia. Virus e cellule procariote ed eucariotiche La vita dei fagi Il ciclo litico di un fago virulento (T4) Virus e cellule procariote ed eucariotiche Cicli litico e lisogeno di un fago temperato (fago lambda) Grazie a enzimi fagici, diventa un profago silente Virus e cellule procariote ed eucariotiche Per ché i fagi non distruggono tutti i batteri? - I batteri cambiano le loro proteine di superficie per non essere riconosciuti: evoluzione patogeno - ospite. - I batteri possiedono enzimi di restrizione per distruggere il DNA fagico, ma non quello proprio che è protetto da modifiche specifiche (metilazione). - Tanti fagi preferiscono il ciclo lisogeno, anche se possono passare a litici sotto diverse condizioni ambientali (chimiche, energetiche). Durante il ciclo lisogeno, il profago esprime proteine che bloccano la espressione delle proteine necessarie per il ciclo litico, e a volte altre proteine quali tossine che rendono i batteri pericolosi per l’uomo: E. coli enteroemorragico 0157:H7 ha un profago che produce una tossina -> intossicazione alimentare. Virus e cellule procariote ed eucariotiche Virus animali Pericapside virale: comune, si usa per entrare nelle cellule ospite. Tipi di genoma: dsDNA ssDNA dsRNA ssRNA, usato come mRNA ssRNA, usato come stampo per mRNA e per nuovo ssRNA genomico (RNA pol propria) ssRNA, usato come stampo per DNA: retrovirus, portano la loro trascrittasi inversa. Il DNA si integra nei cromosomi ospiti, e da lì si esprime come mRNA per la sintesi proteica e di nuovi genomi virali HIV, causante di AIDS Virus e cellule procariote ed eucariotiche I virus causano malattie agli animali e al uomo. Difese: - prima della infezione: vaccini (vaiolo, poliomielite, morbillo…) - dopo della infezione: sistema immune; agenti antivirali: molecole in grado di colpire specificamente gli enzimi virali. Virus emergenti: nuovi tipi di virus: AIDS (acquired immune deficiency syndrome), Ebola, SARS (severe acute respiratory syndrome)… SARS-CoV-2!!! Da dove vengono? - Mutazioni spontanee (epidemie di raffreddore) - Diffusione massiva (epidemie, pandemie) - Trasmissione fra specie (SARS-CoV-2) Virus e cellule procariote ed eucariotiche E per le piante! Si conoscono oltre 2000 malattie virali delle piante, che causano gravi perdite economiche. Virus e cellule procariote ed eucariotiche Virus e cellule procariote ed eucariotiche Tutti gli organismi viventi sono fatti da cellule: teoria cellulare. - Robert Hooke (1665): vede le ‘cellule’ del sughero. - Leeuwenhoek (1674): descrive dei microorganismi (batteri, protozoi) - Dutrochet (1824): le cellule sono enti individuali, l’unità fondamentale della organizzazione degli esseri viventi. - Schleiden (1838) e Schwann (1839): le cellule sono le unità che fanno tutti gli organismi vegetali e animali Teoria cellulare: tutte le cellule procedono d’altre cellule, non esiste la generazione spontanea: Louis Pasteur (1860) Ci sono tantissimi tipi di cellule, ma tutte hanno la stesa chimica di base e seguono il dogma (principio) centrale della biologia Virus e cellule procariote ed eucariotiche Tutte le cellule di un organismo hanno lo stesso DNA, ma lo esprimono in maniere diverse (sono differenziate), il che determina la loro forma e funzione specifiche. Tutte le cellule esistenti derivano da una cellula ancestrale comune, esistente 3.5-3.8 miliardi di anni fa… Grazie alle mutazioni e alla evoluzione. Al confronto con le cellule, i virus sono dei zombi! Virus e cellule procariote ed eucariotiche La biologia cellulare o citologia (dal greco kytos = "contenitore" e logos = "studio"), è la scienza biologica che studia la cellula dal punto di vista morfologico e funzionale. Scala di misura: 1 m = 1000 millimetri 1 mm = 1000 micrometri 1 µm = 1000 nanometri 1 nm = 1000 picometri 100 pm = 1 Angstrom Virus e cellule procariote ed eucariotiche Cellule: procariote (‘prima del nucleo’) eucariote (‘vero nucleo’) Virus e cellule procariote ed eucariotiche CELLULE PROCARIOTICHE - In genere sono cellule isolate - Dimensioni ridotte, normalmente 0.5-5 µm - Non hanno nucleo, hanno organuli batterici ma non come nelle cellule eucariotiche - Per lo più hanno una parete cellulare - Si riproducono velocemente (da poche ore a 20 minuti) per scissione binaria - Possono scambiare materiale genetico - Evolvono velocissimamente - Biomassa complessiva: 10 volte in più di tutti gli eucarioti insieme!!! - Massima biodiversità: alcuni possono sopravvivere con alta salinità (˜30% ), a 3 milioni di rad (3000 volte la dosi mortale per l’uomo), a pH 0.03 (che può dissolvere metalli) o a più di 3 km di profondità… Altri vivono nel acqua, nelle piante, nei animali, nelle pozzanghere… in ogni parte! Due domini, così diversi tra di loro quanto dagli eucarioti: - Bacteria (batteri), o Eubacteria (eubatteri). - Archaea (archea), o archeobatteri, adatti a vivere in ambienti estremi, forse i primi esseri viventi sulla Terra primitiva. Virus e cellule procariote ed eucariotiche Strutture esterne - Parete cellulare: protezione; forma: sferica (cocchi), a bastoncino (bacilli) o spirale. Nei batteri, fatta da peptidoglicano. Alcuni hanno pure: - Capsula esterna, protezione addizionale e adesione. - Ciglia: adesione. - Flagelli: per il movimento; orientato: tassia (chemiotassi positiva o negativa). Ad esempio E. coli ha chemiotassi positiva fra individui per fare colonie. - Pili sessuali: per lo scambio di DNA fra coppie di batteri. Virus e cellule procariote ed eucariotiche Organizzazione interna - Citoplasma. - Ripiegamenti della membrana cellulare: in alcuni batteri, per certe funzioni metaboliche (respirazione, fotosintesi), formano organelli batterici. - Organizzazione genomica: in genere un unico cromosoma circolare, localizzato nella regione nucleoide, e alcuni anelli piccoli di DNA: plasmidi. Virus e cellule procariote ed eucariotiche Virus e cellule procariote ed eucariotiche Riproduzione Per scissione binaria, riproduzione asessuata, produce in poche ore due cellule con patrimonio genetico identico alla cellula originaria. Limitata dalle condizioni ambientali. Formazione di endospore: incapsulamento del cromosoma senza acqua → arresto metabolico. Possono sopravvivere per secoli. La diversità genetica nei procarioti è promossa da: - mutazioni spontanee (rare ma le popolazioni sono grandi); - alta velocità di riproduzione e grandezza delle popolazioni (alta tassa di mutazioni); - e ricombinazione genetica: mescolamento del DNA di individui diversi. Virus e cellule procariote ed eucariotiche Plasmidi R: plasmidi contenenti geni di resistenza agli antibiotici: geni che tramite mutazione danno al batterio la capacità di sopravvivere agli antibiotici. Vengono selezionati positivamente dal uso di antibiotici. Contengono pure geni per i pili sessuali: si possono trasmettere ad altri batteri. Così gli antibiotici perdono la loro utilità. Strategia: ridurre l’uso di antibiotici. Se possibile, usa il tuo sistema immune! Virus e cellule procariote ed eucariotiche Alcuni procarioti cooperano metabolicamente e vivono en colonie dove diversi individui hanno ruoli diversi. A volte formano biofilm, rivestimenti di batteri che vivono insieme, alcuni creano problemi di salute, ai denti e anche economici (rovinano attrezzature, inquinano superfici, etc). Su fibre Su superfici Sui denti (placca) Su un cateter Virus e cellule procariote ed eucariotiche I procarioti svolgono ruoli molto importanti per tutta la vita sulla Terra: - Alcuni incorporano nutrienti nella catena alimentare: carbonio (dal CO 2 e altre fonti), N (dal N2) e altri, anche se possono pure sequestrarli - Alcuni producono O2 - I decompositori riciclano la materia organica e la rendono di nuovo disponibile Ma sono pure causanti di tante malattie gravi… … e hanno pure tante applicazioni nella ricerca e nella industria: - Produzione di formaggio e yogurt - Applicazioni biotecnologiche: Escherichia coli è indispensabile per la biologia molecolare, Agrobacterium tumefaciens per produrre piante transgeniche - Uso dei batteri per produzione di sostanze utili (vitamine, antibiotici, ormoni…) - Biorecupero: per pulire il acqua, l’aria o il suolo - Produzione di plastica biodegradabile - Produzione di biofuel - Addirittura si cerca di fare batteri completamente nuovi (producendo un cromosoma batterico artificiale) che possano fare quello che vogliamo noi! Virus e cellule procariote ed eucariotiche Il microbiota: insieme di microorganismi simbionti che convivono con l 'organismo umano senza danneggiarlo (intestino, pelle). Nell’organismo umano, ci sono un 10% di cellule umane e un 90% di batteri! Virus e cellule procariote ed eucariotiche Virus e cellule procariote ed eucariotiche Uno sguardo alla sistematica molecolare: i tre domini della vita Virus e cellule procariote ed eucariotiche I sei regni della vita procarioti eucarioti sia autotrofi eterotrofi che autotrofi eterotrofi eterotrofi vivono in Protozoi e condizioni alghe estreme fotosintetiche Virus e cellule procariote ed eucariotiche EUCARIOTI Organismi unicellulari (protisti) o pluricellulari (funghi, piante, animali). Hanno un nucleo… e molti altri organuli! Virus e cellule procariote ed eucariotiche LIEVITI Eucariote unicellulare più semplice (regno dei funghi) Possiede una parete robusta, ha mitocondri ma non cloroplasti Saccharomyces cerevisiae Virus e cellule procariote ed eucariotiche PROTISTI: organismi unicellulari eucarioti molto variegati euglenoide dinoflagellato ciliati ciliati ciliati ciliati ameba ciliati eliozoo Virus e cellule procariote ed eucariotiche Organismi pluricellulari: formati da tante cellule che si organizzano per dividere il lavoro. Funghi Piante Animali Virus e cellule procariote ed eucariotiche La cellula animale La cellula vegetale Virus e cellule procariote ed eucariotiche Strutture delle cellule eucariotiche Il nucleo: dove si raccoglie il DNA con le istruzioni genetiche Virus e cellule procariote ed eucariotiche I mitocondri: dove si produce l’energia per la cellula Virus e cellule procariote ed eucariotiche I cloroplasti: dove H2O e CO2 si combinano con l’energia della luce per produrre glucosio mediante la fotosintesi Virus e cellule procariote ed eucariotiche Organuli membranosi: reticolo endoplasmatico e apparato di Golgi: la fabbrica della cellula Virus e cellule procariote ed eucariotiche Organuli membranosi: reticolo endoplasmatico e apparato di Golgi: la fabbrica della cellula Virus e cellule procariote ed eucariotiche Organuli membranosi: vescicole di trasporto, endosomi e altri: i trasportatori cellulari Virus e cellule procariote ed eucariotiche Lisosomi e perossisomi: compiti speciali di metabolismo cellulare Virus e cellule procariote ed eucariotiche Il citosol: il medio gelatinoso che circonda tutto, e dove tante cose accadono Virus e cellule procariote ed eucariotiche Il citoscheletro: lo scheletro della cellula Filamenti di actina Microtubuli Filamenti intermedi Virus e cellule procariote ed eucariotiche Il citoplasma: tutto ciò che si trova tra la membrana plasmatica (esterna) e il nucleo E il tutto è in movimento! Virus e cellule procariote ed eucariotiche Per formare gli organismi pluricellulari, le cellule si organizzano in gruppi strutturati e funzionali: i tessuti. Tecniche di studio della cellula MICROSCOPIA I primi microscopi sono del secolo XVII. Robert Hooke, 1665: ‘cellule’ del sughero visto al microscopio: erano pareti cellulari, ma il nome è rimasto. Da questo momento in poi, l’uso del microscopio permette lo studio delle cellule vegetali e animali, e la nascita della Biologia Cellulare (secolo XIX). 1860: gli esperimenti di Louis Pasteur convincono agli scienziati della teoria cellulare: non esiste la generazione spontanea. Fino ad oggi, ogni progresso tecnologico del microscopio ha portato al progresso della conoscenza in biologia cellulare. Tecniche di studio della cellula Una tipica cellula animale ha un diametro di 5-20m Limite di risoluzione occhio umano 0.2 mm Limite di risoluzione microscopio ottico 0.2 m Tecniche di studio della cellula Come è fatto un microscopio Tecniche di studio della cellula MICROSCOPIO ‘DRITTO’ MICROSCOPIO INVERTITO Obbiettivo sopra il preparato Obbiettivo sotto il preparato Tecniche di studio della cellula Le cellule sono trasparenti: come ottenere contrasto in microscopia ottica A) Trattare campione con colorante che assorbe certe lunghezza d’onda nello spettro del visibile. Le lunghezze d’onda che non sono assorbite sono trasmesse all’occhio facendo in modo che l’oggetto appaia colorato. B) Regioni a composizione diversa presentano indice di rifrazione diversa. Gli organelli intracellulari differiscono nell’indice di rifrazione. Tecniche di studio della cellula Microscopia a campo chiaro: illuminazione con luce visibile, senza colorazione. Campo chiaro Queste due sono tecniche Contrasto di ottiche che permettono fase vedere meglio campioni non colorati sfruttando la variazione sofferta per la luce al passare attraverso zone con Contrasto di diverso indice di refrazione. interferenza Molto utili per osservare (Nomarski) cellule vive (in coltura). Fibroblasto in coltura Tecniche di studio della cellula Sezioni istologiche: preparazione e colorazione Per visualizzare meglio i campioni. Richiede diversi passi: - Fissazione: per immobilizzare i componenti cellulari nei loro posti. Alcol, aldeidi. - Disidratazione: eliminazione dell’acqua dei tessuti, usando alcol a gradazione crescente: 70, 90, 100, e poi xilene (solvente organico). - Inclusione: i tessuti vengono inseriti in un materiale più consistente per fare sezioni sottili da colorare, in paraffina (ottico) o in resine (elettronico). - Sezionamento: taglio a fettine per la colorazione e osservazione. Al microtomo: per microscopio ottico: 20 µm, per elettronico: 0.1 µm. Tecniche di studio della cellula - Reidratazione: eliminazione della paraffina (xilene) e reidratazione usando alcol a gradazione decrescente (100, 90, 70), per arrivare a soluzioni acquose. - Colorazione istologica: - coloranti acidi come eosina (colora il citoplasma in rosa) - coloranti basici come ematossilina (colora il nucleo in blu/viola) Tecniche di studio della cellula ANTICORPI Proteine prodotte dal sistema immunitario dei vertebrati come difesa contro le infezioni. Sono prodotte in miliardi di forme diverse ognuna con un sito di legame diverso che riconosce una molecola bersaglio specifica (antigene). L’alta specificità degli anticorpi li rende strumenti potenti per essere usati in biologia cellulare. Tecniche di studio della cellula Immunocitochimica o immunoistochimica: uso di anticorpi per rilevare proteine specifiche nei tessuti. Gli anticorpi sono marcati con enzimi che producono un colore di localizzazione, o con molecole fluorescenti. Organo sottocommessurale di ratto Tecniche di studio della cellula Microscopia a campo chiaro: cell live imaging (developing_egg_cells) Tecniche di studio della cellula Microscopia a fluorescenza: illuminazione con luce fluorescente Tecniche di studio della cellula La GFP (green fluorescent protein) Il fluoroforo (il gruppo chimico che produce la fluorescenza) è protetto all’interno di una struttura a forma di barile. Un’estesa mutagenesi sito-diretta (cambiamento di specifici aminoacidi) è stata eseguita sulla sequenza originale della GFP per migliorare l’efficienza di fluorescenza e per generare varianti con spettri di emissione alterati nella gamma blu-verde-giallo, fra le quali le varietà BFP (blu), YFP (giallo) e CFP (ciano). Tecniche di studio della cellula Tecniche di studio della cellula PROTEINE DI FUSIONE CON GFP Tecniche di studio della cellula Tecniche di studio della cellula Tecniche di studio della cellula Microscopio ottico confocale: è in grado di fare una sezione ottica (per scansione con il laser) e dare un’immagine molto più nitida. Embrione d’insetto, immunocitochimica per l’actina (in verde) Tecniche di studio della cellula Microscopia elettronica a trasmissione: illuminazione con elettroni; lenti: anelli magnetici. Campione nel vuoto. Si ‘colora’ (contrasta) il campione con metalli pesanti che bloccano gli elettroni. Tecniche di studio della cellula Filamento di DNA Una cellula Tecniche di studio della cellula Si possono usare anticorpi legati a particelle d’oro per trovare una proteina dentro la cellula per microscopia elettronica a trasmissione. Tecniche di studio della cellula Microscopia elettronica a scansione: illuminazione con elettroni; lenti: anelli magnetici. Campione nel vuoto, ‘colorato’ con una lamina di metallo, si vede la superficie. Stereociglia nel udito interno Granuli di polline Testa di mosca Tecniche di studio della cellula Le immagini di microscopia elettronica a scansione si possono colorare al computer. Stereociglia nel udito interno Granuli di polline Superficie della lingua Cellula nervosa Tecniche di studio della cellula cell_compartments Tecniche di studio della cellula COLTURE CELLULARI - Colture di cellule primarie: presse dal animale o dal uomo, crescono per tempo limitato. - Colture di linee cellulari: cellule trasformate procedenti di tumori o modificate in laboratorio. Si lavora in cappa sterile, con terreni di coltura contenenti siero bovino (fattori per la nutrizione, sopravvivenza e crescita cellulari) o chimicamente definiti, usando materiale sterile in plastica (monouso) o vetro. Tecniche di studio della cellula La prima linea cellulare umana: HeLa (Henrietta Lacks), creata al Johns Hopskins Hospital di Baltimora (USA), nel 1951 In divisione In apoptosi Tecniche di studio della cellula Citometria a flusso: per analizzare e separare cellule diverse contenute in un campione.