2 parte.pdf

trasformata in una forma dissociata. È il caso del NH3 (deriva dalla deaminazione degli AA nel citoplasma delle cellule epiteliali dei tubuli renali) che viene protonata a NH4+. Lo ione ammonio non è più diffusibile perciò non può diffondere nell’ambiente da cui è partita. Questo succede per esempio...

trasformata in una forma dissociata. È il caso del NH3 (deriva dalla deaminazione degli AA nel citoplasma delle cellule epiteliali dei tubuli renali) che viene protonata a NH4+. Lo ione ammonio non è più diffusibile perciò non può diffondere nell’ambiente da cui è partita. Questo succede per esempio a livello del tubulo renale In una particolare zona chiamata dotto collettore, l'NH3 prodotta dalla degradazione di AA, consente di eliminare le sostanze di rifiuto e legare gli H+ rilasciati nel tubulo renale. A sx della figura abbiamo il lume tubulare (è un epitelio, sopra avremo altre cellule con le loro giunzioni). Qui abbiamo la possibilità per l'NH3 di essere rilasciata a livello basolaterale (in vicinanza negli epiteli abbiamo la lamina basale e nelle vicinanze, al fine di espletare la funzione degli epiteli ovvero di assorbire sostanze utili o rilasciare prodotti di scarto, devono esserci I CAPILLARI (DX DELLA FIGURA). NH3 trasportata dal sangue, attraverso una semplice diffusione passiva come sostanza che passa secondo la legge di fick, se passa vuol dire che normalmente non c'è un'elevata concentrazione di ammoniaca. Mentre una volta arrivata nel lume tubulare, ( a livello di questo distretto renale contiene una quantità notevole di H+ con un pH di 5 potrà) legarsi con H+ e formare NH4+. Quest'ultimo non potrà tornare indietro. È uhn meccanismo detto di diffusione non ionica permette lo spostamento di molecole da un lato all'altro. Diffusione che interessa anche l'aspetto farmacologico. È un meccanismo importante per l'assorbimento di alcuni farmaci come l'acido salicilico e i suoi derivati come l'aspirina (acidi deboli) che essendo liposolubili al basso pH del lume dello stomaco che trasforma in una forma che non è dissociata, cioè che può attraversare il doppio strato fosfolipidico (assorbita dalla membrana e dall'epitelio) poi giungere nel torrente ematico. Qui il pH è meno acido, potranno nuovamente dissociarsi e formare la forma anionica, così non diffondono in direzione retrograda. I processi diffusivi avvengono nei liquidi e nelle membrane, si passa da: plasma -al liquido extracellulare- alla membrana- al liquido intracellulare. Anche il capillare ha una membrana con un epitelio bucato, cioè fenestrato per consentire maggior velocità dei flussi. La capacità della molecola X di diffondere e raggiungere le cellule a cui poi deve portare il nutrimento è strettamente dipendente dalla distanza secondo questa legge. Se la distanza è breve possiamo avere processi diffusivi in un tempo tollerabile, utile ed efficiente. Se la distanza è elevata, proprio perchè il tempo necessario alla diffusione aumenta con il quadrato della distanza, addirittura per fare 10 cm ci metterebbe 11 anni. La rete di capillari in tutti i distretti è fatta in modo tale che sangue e cellule siano ad una DISTANZA MASSIMA DI 100 µ. Facciamo un esempio numerico: distanza di diffusione di 1 micron, quella X molecola per il suo coefficiente di diffusione richiede 0,5 millisecondi. Se aumentiamo la distanza a 10µ, il tempo richiesto aumenterà di 100, avremo bisogno di 50 ms. Ad una distanza di 100 µ abbiamo bisogno di 5 secondi, in un processo diffusivo che deve innescare una serie di processi a cascata, siamo ai limiti della normalità. 1 mm ha bisogno di 8,3 minuti. I processi diffusivi avverranno con un’efficienza utile alle nostre esigenze fisiologiche in prossimità di regione in cui i capillari e cellule sono in stretta in connessione. Questo discorso è particolarmente importante durante gli scambi tra capillari e cellule. I capillari sono formati in modo tale da consentire alla molecola che diffonde il minor spazio di diffusione da attraversare. Come ottengo ciò? 1) il CAPILLARY WALL (epitelio del capillare) che classicamente è definito ENDOTELIO ha uno spessore di circa 1 micron, molto sottile perché e formato da un epitelio squamoso e da una membrana basale  I capillari sono anche stretti e consentono ai globuli rossi di passare in singola fila. In questo modo possono essere esposti ai liquidi extracellulari in modo ottimale. Non ci saranno globuli rossi al centro di un cumulo poiché non raggiungerebbero la regione extracellulare 3) Prossimità della cellula, in genere ogni cellula è a 0.01 cm dal capillare (allenati con le conversioni cm in micron)  4) Total surface area, la diffusione dipende dall'area della diffusione, i capillari sono fatti in modo tale da aumentare in modo abnorme la superficie rispetto alle grandi arterie o vene. La maggior parte delle molecole di interesse sono cariche, chiamate elettroliti La diffusione semplice, quindi, riguarda poche sostanze come acqua, molecole liposolubili, debolmente polari come NH3; sfruttano un passaggio per diffusione semplice. Tutte le altre hanno bisogno di trasporti mediati. I microtrasporti riguardano singole molecole, i macrotrasporti riguardano insieme di molecole. I primi sono distinti, in base all'energia impiegata nel trasporto stesso, in ATTIVI e PASSIVI. I trasporti attivi sono SEMPRE FACILITATI, cioè sempre mediati, e si distinguono in primari e secondari. I trasporti passivi semplici li abbiamo definiti e riguardano molecole lipofiliche nella matrice fosfolipidica. Sono trasporti passivi perché non necessitano energia e sono anche definiti trasporti in forma libera, cioè non c'è nessuna interazione fisica della molecola che diffonde, c'è solo una brevissima interazione con il bilayer fosfolipidico. La migrazione attraverso canali membranali, è un trasporto mediato da una molecola proteica rientra nei trasporti passivi cioè equlibranti. IMPORTANTE!! Da un punto di vista energetico è passivo, dunque equilibrante, cioè non va mai contro gradiente. È un trasporto mediato perché prevede una certa interazione dello ione/ molecola (in caso di H2O o GLICEROLO) trasportato/a con il canale. I trasporti mediati sono: primari, secondari e diffusione attraverso carrier (cioè facilitata). Possibile domanda: QUANTI TIPI DI TRASPORTATORI CONOSCI? FUNZIONI E CARATTERISTICHE, SI SALTA DA UN TESSUTO, ORGANO ALL'ALTRO PER CAPIRE L'EFFETTO FISIOLOGICO DEL TRASPORTO. La molecola passa attraverso un poro. A chi assomiglia e cosa ha di diverso il grafico? È il grafico del flusso È il grafico del flusso, descrivibile in modo analogo a quanto fatto per le molecole liposolubili però P (coefficiente di permabilità) -trattandosi di ioni di certo non avremo il coefficiente di ripartizione ma il coefficiente di permabilità- mi darà l'informazione della velocità con cui, lo ione, passa attraverso il canale. A differenza di quanto visto nella diffusione attraverso la membrana lipidica di molecole liposolubili, arriva un certo punto [benché ci sia un lungo tratto di diretta proporzionalità tra il flusso e la concentrazione dello ione ai due lati della membrana], esiste questa deviazione cioè tendenza ad una saturazione. Perchè? Le dimensioni della membrana sembrano essere infinite rispetto alla quantità di molecole lipofiliche che la attraversano. In questo caso (del grafico nella slide) i canali presenti sono in numero finito rispetto all'ingente numero di fosfolipidi che formano la membrana. Ad un certo punto potrebbe accadere (fisiologicamente con i canali non accade quasi mai) che il flusso degli ioni, attraverso questi canali, è tale che non esistono più canali disponibili per il passaggio dello ione. Si tratta più di un espediente didattico piuttosto che di una situazione reale per consentire la differenziazione del flusso di molecole liposolubili attraverso la membrana e il flusso attraverso i canali. (se vi chiedo di disegnare un grafico che metta in relazione il flusso con la concentrazione di una sostanza trasportata e vi chiedo se c'è un livello di saturazione ad elevatissime concentrazioni di substrato siamo davanti al caso dei canali). J J ∆C ∆C bisogna sapere che i due grafici sono diversi e perché sono diversi. Quali sono le caratteristiche dei canali?  Consentono il passaggio di acqua (esistono canali specifici che sono le acquaporine), ioni e piccole molecole come glicerolo Consentono una comunicazione "diretta" tra l’ambiente intracellulare ed extracellulare Velocità dell'ordine di milioni di molecole al secondo. I canali sono usati per far avvenire tutti i processi che richiedono tempi brevi, tipo eccitabilità, comunicazione intercellulare tra neuroni; dopo che tocco una superficie bollente l'azione di allontanare il dito da questa superficie è un segnale che passa attraverso delle cellule sensoriali afferenti che arrivano al SNC attraverso un arco semplice e determinano la contrazione del muscolo del braccio e il rilassamento del muscolo opposto in modo da allontanare il braccio dalla superficie. Tutto ciò deve essere fatto in tempi brevi. Esempio: gli ormoni peptidici devono essere velocissimi grazie alla trasduzione del segnale e canali. I carrier piuttosto che i trasportatori attivi hanno la funzione di trasportare ioni e creare gradienti. Regola aurea della fisiologia: i trasportatori attivi (che vedremo tra poco) sono proteine che usano energia di ATP per fare un lavoro, trasportano ioni contro gradiente che loro stessi hanno contribuito a mantenere. Creano e mantengono disequilibri a cavallo delle membrane. La pompa Na-K è responsabile del mantenimento del disequilibrio ionico di Na e K cioè distribuiti inegualmente nel liquido extracellulare ed intracellulare e non è un caso che sia così. È proprio grazie al disequilibrio ionico, se la cellula vuole fare qualcosa in modo veloce apre i canali (in risposta a determinati stimoli) e questi ioni passano velocemente. La selettività dei canali è variabile e dipende dal canale specifico. Si basa sulla dimensione dello ione idratato e dalla facilità della disidratazione, dal tipo e dalla forza della carica In riferimento a questo ultimo punto si parla di filtro di selettività, il più famoso è il canale per il Na voltaggio dipendente fino a poco tempo fa si sapeva fosse una catena polipeptidica con 4 unità ripetute (primi quattro cilindri in figura) quindi abbiamo 4 regioni ripetute ciascuna delle quali costituita da 6 eliche transmembrana e delle regioni delle anse (filamento tra i due cilindri gialli). Sin da questo punto della storia della scienza di questo canale si sapeva che tra le eliche 5 e 6 esisteva un dominio che sembrava essere importante per la selettività per formare il poro del canale. Adesso però si è compreso che esistono siti per la regolazione della funzione di questo canale, siti di glicosilazione (ci riagganciamo a quanto detto nelle prime lezione cioè l'esistenza di questi residui di carboidrati che servono per regolare la funzione di una serie di proteine tra cui proteine di membrana come questo canale). Se dovessero esserci problemi nella glicosilazione delle proteine, che poi andranno in membrana, potremmo avere problemi nella corretta espressione, riconoscimento e funzione della proteina. Abbiamo scoperto che questo sito, i dettagli sull'ansa extracellulare che si ripiega (attenzione la parte importante è la parte che si ripiega all'interno del bilayer fosfolipidico perché questo canale sarà formato da ripiegamento di queste unità ripetute su se stesse.) c'è la possibilità da parte di proteine intracellulari di modificare alcuni residui amminoacidici, è importante per la regolazione dei diversi tipi di canali. Un tempo si riteneva che la selettività di questo canale, del Na voltaggio dipendente, fosse dovuto alla dimensione di uno ione idratato, in realtà le conoscenze si sono approfondite. Quello che adesso si sa è che le molecole di acqua si dispongono intorno allo ione in base alla forza della carica, tanto è più piccola la molecola tanto maggiore è la carica esercitata per unità di superficie e quindi vengono attratti e si formano diversi anelli di solvatazione. Per superare il filtro di selettività, che decide se questo canale è permeabile solo al Na o solo al K, o entrambi; nel caso di un canale particolarmente selettivo, si ritiene che la selettività derivi dal fatto che il canale spoglia lo ione dai dipoli di acqua orientati secondo la sua carica, lo spoglia e questa deve corrispondere ad una interazione con residui carbonilici degli AA che formano il poro opportuni. Questo spiegherebbe il motivo per cui nel canale del potassio, il K vien ad essere selettivamente scelto rispetto al Na perché nello svestimento il K interagisce con 4 gruppi carbonilici dei residui amminoacidici nella porzione più alta del poro. Se lo fa il Na , data la sua dimensione e del suo anello di solvatazione rimane legato a due molecole di acqua impedendo il passaggio dello ione. Questo per dire che il filtro di selettività può essere determinato dalle interazioni molecolari fra gruppi carbonilici nel caso di ioni positivi dell'ambiente del poro. La delucidazione di queste interazioni che bene o male avvengono tra ione che passa e la struttura della proteina ( residui amminoacidici dei carbonili sono della proteina) ha fatto cambiare la classificazione dei canali da processo di DIFFUSIONE LIBERA a processo di DIFFUSIONE MEDIATA, perché c'è un'interazione dello ione con la proteina sebbene sia la forza dell'interazione che la durata di questa non sia paragonabile all'interazione che avviene nel caso di carrier, ciononostante la maggior parte del tempo lo ione lo passa libero. C'è un filtro di selettività e l'interazione è veloce ma molto debole, ecco per cui i canali trasportano gli ioni ad una velocità superiore alla stragrande maggioranza dei trasportatori. In questo caso vediamo una classica rappresentazione di una struttura di un canale con delle regioni transmembrana, dove genericamente tra le regioni transmembrana 5 e 6 hanno quest'ansa che si approfonda nella membrana e determina quando siano presenti 4 subunità (nel caso del canale voltaggio dipendente del Na: una sola catena polipeptidica con 4 catene) ma la struttura è la stessa. Queste strutture si ripiegano e determinano la costituzione di un poro. Le regioni P, cioè 5 e 6 sono all'interno del poro. La regione P è quella che è formata da quest'ansa fra i segmenti transmembranali 5 e 6, ed è quella che costituisce il filtro di selettività del canale. È imposrtante anche dal punto di vista fisiopatologico, è stato dimostrato che mutazioni anche puntiformi (variazioni della sequenza codificante ) nelle regioni P, sono responsabili di un'alterazione di una funzionalità e/o patologie. È la regione più delicata e specifica di una sequenza amminoacidica, della corrispondente sequenza nucleotidica del DNA che codifichi per i canali. Questi tratti del DNA che codificano per le regioni P rappresentano l'impronta digitale di ogni famiglia di canali. CANALI IONICI, CLASSIFICAZIONE IN BASE ALLE MODALITA' DI APERTURA: Capacità del nostro organismo di regolare il loro stato di apertura. Proteine canali--CANALI APERTI →CANALI A CANCELLO O REGOLATI I primi non sono dotati di porte (porzione del canale che può occludere il poro cioè il passaggio di ioni). Solo in seguito a determinato stimolo(acetilcolina) si apre oppure può determinare l'apertura della porta situata da un lato (intracellulare o extracellulare). NON SONO REGOLABILI. Il più comune e famoso è Di leakage che è responsabile della creazione e del mantenimento del potenziale di membrana a riposo. Esistono diversi tipi come: canali a porta chimica e canali a porta potenziale. I canali sono localizzati sulle membrane degli organuli intracellulari; nella contrazione del muscolo il potenziale d'azione arriva al tubulo T. Esempio: i recettori per le DIIDROPIRIDINE (dhpr) è QUELLO CHE STA attaccato alla membrana muscolare, strettamente connesso. Quando arriva il potenziale d'azione poiché è voltaggio dipendente, questo è un canale a porta potenziale, la cui funzione però nel muscolo scheletrico è per lo più meccanica. Quando arriva il potenziale d'azione questo cambia conformazione e fa cambiare conformazione anche al reticolo sarcoplasmatico, il recettore per la RIANODINA che è un canale per il Ca. Questo canale è localizzato sulla membrana del reticolo sarcoplasmatico e si apre in risposta all'arrivo di un potenziale che attiva dhpr, che a sua volta, con un accoppiamento meccanico fa aprire questo che è un canale per il Ca che farà uscire il Ca dal reticolo verso il citoplasma. Sappiamo che il Ca è fondamentale per la contrazione. Il reticolo endoplasmatico liscio così come il reticolo sarcoplasmatico sono dei depositi di Ca. un altro ione di cui bisogna tener presente della concentrazione per comprendere il tutto è il Ca, oltre K e Na. La concentrazione del Ca extracellulare è 1-2 mM (millimolare) cioè 10^(−3) M. Nel citosol invece è 100 (nM)nano molare cioè 10^(−7) M. È 10000 volte meno concentrato nel citosol ecco per cui il Calcio grazie all'apertura dei canali a cavallo della membrana o a cavallo delle membrane dei reticoli endoplasmatico e del reticolo sarcoplasmatico funge da messaggero e fa innescare delle cascate di trasduzione del segnale. I CANALI A CANCELLO O REGOLATI non passano la loro maggior parte nello stato aperto, ma possono essere chiusi o aperti a piacimento. Nel caso di quelli a porta potenziale vedremo, sono aperti per variazioni del potenziale di membrana (se misuriamo con un microelettrodo il potenziale di una membrana plasmatica di una cellula viva, questa avrà un valore rispetto all'esterno di -70/-50 second millivolt, con il lato negativo verso l'interno; a seconda del tipo cellula vedremo come funziona. In seguito all'inversione o modifica del potenziale tipo da -70 a -50, si aprono. I CANALI A PORTA CHIMICA si aprono per interazione con un ligando generico che ne determina la variazione di conformazione e la loro apertura. Altri esempi di canali regolati sono: Canali regolati da ligando: Canali voltaggio dipendenti  Canali con apertura regolata da fosforilazione (importante per l'acetilcolina nel modificare la forza di contrazione dei miociti). Con fosforilazione di residui amminoacidici sono aperti oppure con defosforilazione sono lo stesso aperti. Canali regolati da stiramento o pressione, presenti nella percezione tattile. Attraverso i residui amminoacidici sono connessi al citoscheletro, per cui una modificazione meccanica della dentatura della pelle, come stiramento o avvallamento determinerà meccanicamente l'apertura di questi canali Canali attivati dalla luce, caratteristici degli organismi autotrofi C: dipendente da modificazioni piuttosto che da interazioni intracellulari Avrei tanti nomi diversi, tuttavia sono accumunati dal fatto che siano attivati dall'interno per interazione con ligandi intracellulari piuttosto che con proteine D meccanosensibile, perché sono per esempio a livello con porte che si aprono con spostamento di una porzione attaccata alla membrana a livello dei recettori sensoriali acustici. Canali aperti quando sono tirate delle porzioni che si aprono come una porta Termorecettori per variazione di temperatura esterna ed interna Attivazione dei canali attraverso l'apertura delle porte di attivazione o essere inattivati da altre porte. Tipo il canale per il Na, esiste in tre stati: -chiuso ed è apribile. Dopo depolarizzazione è aperto, in seguito ad altri eventi legati al potenziale di membrana viene inattivato perchè esiste un'altra porzione amminoacidica (pallina rosa e corda verde) determinati valori di voltaggio va ad otturare il poro. Inattivo vuol dire che non si può aprire neanche con depolarizzazione fino a che non succede qualcosa. I canali aperti o di leakage sono importanti per il potenziale membrana a riposo, si riteneva fossero costituiti in modo tale da consentire il passaggio in unica fila, in parte è vero ma ad oggi sappiamo che i canali aperti o diffusione sono formati da dimeri derivanti da diversi tipi di geni tipo k(w) o k-ir. Questi canali sono importanti per la creazione del potenziale di riposo delle cellule e in questo caso troviamo le anse responsabili della costituzione del poro. Una singola subunità costituita da 4 singole eliche transmembrana, In queste regioni avrò il poro (segni rossi nella zona celeste), l'altra subunità darà gli altri due segmenti P, così si costituirà il poro in cui passerà il K. Il K passerà meglio del Na perché l'anello di solvatazione è fatto in modo tale, la sua dimensione è tale da consentire a lui di interagire con i residui localizzati nella porzione P e quindi di essere selezionato. Si chiamano canali 2P perché hanno due regioni P. Nel caso b della figura ho un’organizzazione diversa, è sempre un canale per il trasporto del K, sempre formato da due subunità solo che ha più eliche transmembrana ma alla fine a formare il poro sono sempre 4+4, le altre si dispongono lateralmente. SESTA LEZIONE FISIOLOGIA 5/03/21 Tutto ciò che è essenziale per la fisiologia della cellula è essenziale anche per la patologia. Ci sono patologie correlate a modificazioni di geni che codificano per canali, che nell’insieme sono definite canalopatie. Non è strano vedere tra le canalopatie problemi che hanno a che fare con il canale del Na voltaggio dipendente in cui esistono varie isoforme indicate con pedici e numeri (NAv 1.1) che sono diffuse in un tessuto piuttosto che un altro. Le patologie sono correlate alle funzioni, il canale del Na voltaggio dipendente è coinvolto nella prima fase del potenziale d’azione e troviamo problematiche con questo canale che sono legate a DIFETTI DI IPERECCITABILITA’, dando luogo ad epilessia o paramiotonia (nel muscolo). Altre patologie diffuse che riguardano il canale del K, a livello del cuore come aritmie cardiache. Nel caso dei canali del Cl, il più famoso e importante è il CFTR (leggilo in inglese) che è responsabile del trasporto transepiteliale del cloro e la patologia associata è la fibrosi cistica. Il difetto nel trasporto del cloro, attraverso questo canale regolato, provoca delle problematiche serie sia a livello dell’apparato respiratorio che intestinale, provocando un muco più denso del normale; poiché al trasporto di NaCl segue l’acqua, non essendo trasportato il Cl- il muco diventa più denso. Questo causa un aumento di sensibilità ai patogeni, perchè a livello bronchiale il muco è la prima difesa, se questo è troppo denso, le ciglia dell’epitelio respiratorio non riescono più a spostarlo e a determinarne l’espettorazione e batteri possono proliferare dando luogo a infezioni ricorrenti. Un’altra testimonianza dell’importanza dei canali è data dal fatto che sono usati in campo terapeutico, alcuni farmaci sono responsabili del blocco di questi canali, tipo verapamil, diltiazem, nifedipina. Possono essere usati per l’ipertensione, riducendo la quantità di Ca++ all’interno delle cellule muscolari lisce e cardiache, nel caso di aritmie, possiamo correggere queste problematiche. Altro canale rilevante è stato identificato di recente, le acquaporine. Scoperte da allora circa 200 membri diffuse in tutti i tessuti umani. Alcune molto importanti nei batteri. Le principali acquaporine sono descritte nella seguente tabella Le acquaporine sono responsabili del trasporto di acqua attraverso le membrane, i membri più noti meglio studiati vanno da 1 a 5. Si differenziano lievemente per il numero di AA e per la selettività perché l’acquaporina 3 è responsabile del trasporto oltre che dell’acqua anche dell’urea e del glicerolo. Se guardate dove sono espresse vediamo che sono espresse molto diffusamente nel rene (generalmente la 1 2 3) ma hanno un ruolo anche importante nel cervello tipo la 4, coinvolta nei processi che determinano edema cellulare e anche negli epiteli ghiandolari. Come è stato evidenziato il loro ruolo nel trasporto d’acqua? Grazie alle metodiche di biologia molecolare, trasfettando gli oociti di Xenopus, che è una specie di rana, usati per verificare una serie di processi a livello osmotico. Che si fa? si isola la proteina, o meglio la sequenza codificante la proteina, introdotta nel plasmide, si trasfetta lo Xenoplus e si osserva che quando si esprime la proteina si ottiene un aumento notevolissimo della permeabilità all’acqua. Quando si fanno studi su proteine o canali, per verificare il loro coinvolgimento in un processo, oltre che avere un metodo per leggere l’aspetto funzionale, in questo caso il trasporto di acqua, si deve avere la possibilità di inibire in modo selettivo quel tipo di proteina e la sua funzione. Non basta vedere che vi è una variazione in seguito all’introduzione di quella proteina nell’oocita ma bisogna essere in grado di bloccarlo con mercuriali, che hanno azione solitamente nell’uomo diuretica. Che c’entra l’azione diuretica con le acquaporine? Queste ultime sono fondamentali nella produzione di urina concentrata, quando le blocchiamo produciamo urina diluita. Vediamo come sono costituite: Abbiamo due porzioni di quest’unica catena che vengono chiamate M1 e M2, sia la porzione N-terminale che la porzione C-terminale sono dal lato citoplasmatico. Possiamo notare che le due porzioni si riarrangiano in modo tale che la struttura, che è un motivo amminoacidico essenziale tanto è vero che è molto conservato (lo studio della conservazione del DNA dà un’idea dell’importanza di quel pezzo di proteina, se conservato nell’albero filogenetico vuol dire che la sua funzione è rilevante). Questo è uno dei motivi asparagina-prolina-alanina più conservati perché è responsabile della costituzione del poro. Anche se ognuna di queste molecole con il suo ripiegamento delle molecole M1 e M2, riesce a costituire un poro funzionale sembra che nella realtà le molecole di acquaporine si riarrangino a formare dei tetrameri, come se ci fossero quattro pori uno vicino all’altro. Questo ha una funzione importante in alcuni tessuti come nell’occhio, in quanto la mancata formazione o diciamo un riarrangiamento sballato sembra essere responsabile di alcune patologie pesanti. Proteine della stessa famiglia presenti in più isoforme, sono utilizzate in diversa maniera. Vediamo una rappresentazione del dotto collettore (porzione finale del nefrone che ci consente a seguito di stimoli ormonali di decidere se produrremo urina concentrata o meno grazie anche ad altre strutture), in seguito la vedremo più nel dettaglio: Possiamo osservare come dal lato basolaterale di queste cellule del dotto collettore esiste una acquaporina 3 che non è regolata dall’ormone deputato a decidere che tipo di urina produrremo, a livello della membran che si affaccia all’interno del tubulo (parte giallina), l’acquaporina cioè l’isoforma che viene immessa in seguito ad uno stimolo ormonale è l’acquaporina 2. Esistono acquaporine costitutive, presenti un po’ ovunque, che permettono il trasporto di acqua in massa; tuttavia esiste una particolare acquaporina 2 la cui immissione sulla membrana apicale è regolata da un ormone chiamato VASOPRESSINA che è un antidiuretico. Quindi esistono alcune acquaporine che sono costitutive altre che sono regolate, altri dettagli li vedremo dopo. TRASPORTI MEDIATI Prevede interazione più lunga e nel tempo specifica dello ione o sostanza da trasportare con la proteina trasmembrana. Per trasportatori o carrier si intendono proteine che subiscono variazioni conformazionali (anche i canali attivati da ligando o a porta, ciò che varia è il passaggio). Come si vede in figura Nel caso di carrier non abbiamo mai la formazione di un poro aperto da entrambi i lati della membrana; la barchetta sta da un lato, in mezzo o dall’altro lato. Parlando in maniera più specifica, la molecola da trasportare che è in LC (=liquido extracellulare) interagirà con il carrier specifico in un particolare sito che ha la stessa forma della pallina, simile al meccanismo chiave serratura; dopo l’interazione che si crea tra il carrier e la molecola si ha una variazione conformazionale che chiuderà un lato del trasportatore e aprirà l’altro consentendo il rilascio della molecola. Il LEGAME NON è COVALENTE ED è REVERSIBILE. Non sono processi lentissimi ma più lenti rispetto a quelli che abbiamo visto per un canale, la velocità che lì avevamo stabilito era di 10 molecole al secondo, qui abbiamo una velocita di 10 e nei migliori casi ad un milione di molecole al secondo. In linea generale il trasporto attraverso i carrier è più LENTO rispetto a quello dei canali. La cellula fa fare il lavoro pesante ai trasportatori attivi 1° per creare i gradienti e poi apre le porte dei canali. I carrier cosa trasportano?  Piccole molecole organiche, cioè la maggior parte delle molecole che ci servono per il metabolismo cellulare come glucosio e AA  Ioni Non creano un passaggio continuo tra ambiente extra e intracellulare, come al contrario accade per i canali. Il legame tra le molecole della proteina che abbiamo visto esistere, seppure limitato nel tempo, probabilmente a livello del filtro di selettività nei canali, in questo caso è molto più importante. È una delle ragioni per cui si ha velocità inferiore. I carrier sono proteine caratterizzate da 3 caratteristiche fondamentali: 1. Specificità 2. Competizione 3. Saturazione La SPECIFICTA’ dei carrier è superiore in media rispetto ai canali. La caratteristica dei carrier che li avvicina molto (curva simile a quella di Micaelis Menten). Esiste la competizione visualizzabile dalla variazione delle caratteristiche essenziali che si possono definire per un carrier ed enzima che è la Vmax e Km. La SATURAZIONE è il livello al quale il carrier trasporta alla massima velocità. La soglia renale del glucosio si rifà a livello molecolare a questi concetti. I carrier possono funzionare come UNIPORTI, SIMPORTI E ANTIPORTI. La descrizione del trasporto con i carrier è fattibile alla perfezione con la descrizione della cinetica di tipo Micaelis Menten, se consideriamo le velocità del trasporto del glucosio e la concentrazione esterna del glucosio sulle ascisse. Possiamo fare un’analogia con quello già detto, J= FLUSSO cioè la velocità del trasporto del glucosio e ∆c che è la concentrazione esterna del glucosio al variare della quale ci aspettiamo un aumento del trasporto attraverso il trasportatore del glucosio. Cosa si osserva immediatamente? Cosa c’è in più rispetto alla cinetica di Micaelis Menten? Questo grafico ci dice che se non avessimo il trasportatore del glucosio (uno dei tanti) e dovessimo aspettare che il glucosio diffonda (seppur una diffusione minima) avremmo una diffusione che dal punto di vista fisiologico è assolutamente irrilevante. Che vuol dire? I trasportatori consentono a molecole nutritive come glucosio di entrare in cellula dalla membrana apicale e uscire da quella basolaterale per raggiungere il sangue a velocità che siano, da un punto di vista fisiologico, importanti. Se non ci fossero i trasportatori avremmo (diffusione semplice secondo l’equazione di Fick è uguale a p ·∆c, la concentrazione esterna del glucosio rispetto all’interna) un coefficiente di permabilità che è completamente nullo. Grazie, invece, alla presenza dei trasportatori abbiamo una velocità di trasporto molto più elevata, dove la velocità massima sarebbe 500 volte quella della diffusione semplice in questo grafico. I trasportatori sono necessari per la vita data la composizione della membrana. V max e km, sono le caratteristiche per differenziare trasportatori della stessa famiglia. Alcuni trasportatori del glucosio hanno diverse costanti di dissociazione cioè Km per il particolare substrato e sono espresse selettivamente in un tessuto piuttosto che in un altro. È importante comprendere la Km di un dato trasportatore. Andando nel dettaglio, la cinetica di Micaelis Menten è espressa dalla relazione: ∙[ ] v iniziale= [ ] dove S è il substrato cioè la molecola da trasportare e le velocità in questo caso sono dei flussi, cioè velocità di trasporto; al posto di v possiamo scrivere j. Cos’è km? È la concentrazione della sostanza da trasportare a cui il trasportatore funziona alla metà della sua velocità massima. Se in un esercizio viene data una curva (come quella vista prima) e viene data una v max e vi si dice calcola la km. Per ricavare la km o l’affinità dobbiamo tracciare un punto al 50% della velocita massima arrivare sulla curva (che di 500 è 250) tracciare una parallela all’asse delle x e trovare con una perpendicolare il valore della Km. L’affinità invece è l’inverso della Km. Se in un esercizio da l’affinità di un enzima per il suo substrato o di un trasportatore per un suo substrato e Km, non sono la stessa cosa. Alta affinità (1) vuol dire che la concentrazione del substrato a cui avrò la metà della velocita massima sarà alta o bassa? Se l’affinità è alta vuol dire che la Km è bassa e il sistema va prima a saturazione; se l’affinità (2) è bassa, avremo una Km alta e servirà più substrato per raggiungere la saturazione 1) 2) Quando l’affinità è elevata vuol dire che la concentrazione di substrato, che fa lavorare in condizioni ottimali l’enzima, è bassa; basta poco substrato per farlo funzionare ad una velocità elevata. Quando l’affinità è bassa, il substrato deve raggiungere delle elevate concentrazioni affinché l’enzima funzioni a metà della velocità massima. I trasportatori non funzionano mai alla velocità massima, ce ne sono pochi ma il range è molto più vicino all’intorno di ½ della velocità massima. In genere l’affinità ci dà l’idea del range di concentrazione a cui sono presenti nell’intorno di quel particolare trasportatore. La costante di dissociazione, Km, è detta apparente per distinguerla da quella degli enzimi e la differenza rispetto agli enzimi è che una proteina trasportatrice ha un intorno più complesso, spesso ci sono variazioni conformazionali, diversi siti di legame, interazioni tra subunità, variazioni tempo dipendente. Qual è l’effetto della presenza di substrati diversi che sono in grado di legare lo stesso sito? Abbiamo il caso di un inibitore competitivo o una molecola che compete per uno stesso sito di carrier. Cosa accade? Dato il substrato fisiologico più probabile o l’unico fisiologico che si lega alla nostra proteina trasportatrice, in assenza dell’inibitore abbiamo questa costante Km e il trasportatore funzionerà a questa concentrazione di substrato a ½ della sua velocità massima. Se aggiungessi un inibitore competitivo farmacologico a tentare di sostituirsi al substrato o una molecola fisiologicamente rilevante che funziona da inibitore competitivo perché va ad occupare, quando presente, lo stesso sito del substrato. Cosa accade? Per il trasportatore è come se fossero disponibili meno siti per il legame con S, cioè substrato fisiologico e la km apparente aumenta e l’affinità diminuisce. Sarà necessaria una concentrazione del substrato iniziale maggiore per poter raggiungere ½ della velocità massima. Altra caratteristica propria dell’enzima, della sua conformazione, delle sue caratteristiche chimico-fisiche delle sue interazioni con ambiente che la velocità massima non cambierà perché tutto ciò che è cambiata è la disponibilità di siti per l’attacco al substrato iniziale. In quest’altro caso se vogliamo ridurre la velocità massima, cambiare le caratteristiche intrinseche del recettore si va ad utilizzare un inibitore non competitivo. Si lega ad un altro sito, il legame tra inibitore e trasportatore ne altera la conformazione riducendo la capacità di trasporto intesa come v max. Se la molecola è otticamente attiva le due forme hanno una diversa velocità di passaggio. Un classico esempio tra le due forme D e L, i trasportatori hanno una sensibilità notevole e hanno una velocità di trasporto favorita per le molecole fisiologicamente presenti come L-AA e il D-glucosio sono trasportati ad una velocità caratteristica di quel particolare tipo di carrier ed utile fisiologicamente. Se diamo alle cellule D-AA e L-glucosio, cioè gli opposti, il trasportatore funzionerà molto meno o addirittura malissimo. Come funzionano? Storia del modello di trasporto mediato: non troppo tempo fa si riteneva che il trasporto mediato da carriers si svolgesse attraverso un modello del carrier mobile, si pensava che il carrier potesse viaggiare all’interno della membrana per diffusione, subito dopo questo si pensava ci potesse essere il flip flop simile a quello delle proteine, si credeva cioè che si potesse proprio capovolgersi extracellulare flip flop  intracellulare la zona che era rivolta verso l’ambiente extracellulare, dopo il flip flop era rivolta verso l’ambiente intracellulare. Cosa che NON è POSSIBILE da un punto di vista termodinamico, perciò smentita. In realtà questo processo di trasporto mediato da carrier mobili con la sua diffusione all’interno del doppio strato fosfolipidico è un processo che avviene da parte di molecole che funzionano come carrier mobili e che sono gli IONOFORI. Generalmente sono piccoli peptidi o di altra natura che creano al loro interno o in altre molecole una sorta di zona adatta per l’interazione molecolare ed elettrostatica con particolari tipo di ioni. Qual è il modello accettato ad oggi dalla maggior parte dei ricercatori? MODELLO FLIP FLOP che non ha nulla a che vedere con il meccanismo di flip flop per i lipidi. Questo movimento è meno frequente di quello visto per i lipidi, circa 10 𝑠𝑒𝑐𝑜𝑛𝑑𝑖. Avevamo detto che le proteine di intrinseche non subiscono flip flop. Il modello flip flop dice che si lega al suo substrato, si occlude ad un certo punto cioè c’è una variazione conformazionale, intermedio di occlusione ed apertura. Tutti i movimenti che avvengono sono: Non c’è mai un momento in cui ci sia un’apertura come nei canali. TRASPORTI MEDIATIPASSIVI E ATTIVI → DIFFERENZE: stato di occlusione non è disegnato in figura perché avrebbe confuso le idee. Nell’immagine c’è scritto stessa affinità a sinistra, a destra invece bassa e alta affinità, entrambe le immagini riportano uno spazio intracellulare. Che vuol dire? Una delle differenze fondamentali tra questi trasporti, la famosa km per il substrato non è diversa per il lato intra ed extracellulare. L’unica cosa che quel trasportatore può fare è trasportare gli ioni secondo il loro gradiente. Se vediamo quello che succede nel tempo (grafici), possiamo notare che tutto quello che può fare il trasportatore che ha una cinetica di MICEALIS MENTEN (sempre nel grafico sotto c’è una linea retta per paragonare l’eventuale cinetica della diffusione) è portare la concentrazione intracellulare ad una condizione di parità con quella extracellulare, si arriva ad un equilibrio. Questo è il massimo che un trasportatore può fare perchè la sua affinità è tale per cui se trovo lo stesso numero di molecole a dx e a sx, continuerà a trasportare sì, ma in maniera non efficiente, saranno ormai all’equilibrio. Per quanto riguarda il trasporto attivo, la costante di affinità della proteina di trasporto per quel substrato è diversa da un lato e dall’altro della membrana. Questo vuol dire che una variazione conformazionale comporta una variazione dei residui amminoacidici che interagiscono con la molecola trasportata per cui se ha un’alta affinità da un lato, avrà una bassa affinità dall’altro lato. Cosa accade? Esempio: se la km del sito per un ligando è minore dal lato extracellulare che è maggiore da quello intracellulare, cosa accade? Si formerà il legame in maggiore misura dal lato extracellulare perché ciò che conta è che la km è maggiore dal lato extracellulare. Se la Km è minore dal lato extracellulare che vuol dire? Ci vuole meno substrato per raggiungere una velocita considerevole, ½ della velocità massima. Se la km è minore dal lato extracellulare, dunque l’affinità è maggiore dal lato extracellulare, il trasportatore tende a legare in maggior misura il substrato dal lato extracellulare, perché è più affine e basta minor substrato per legare un maggior numero di trasportatori. La variazione conformazionale poi fa in modo di rendere questo effetto opposto dal lato extracellulare e verrà rilasciato dal lato intracellulare. Che comporta? Se la pallina rossa si lega con alta affinità, quindi più facilmente dal lato extracellulare, poi invece quando cambia conformazione l’affinità si abbassa avremo che verrà legata dal lato extracellulare e rilasciata dal lato intracellulare, così si crea un gradiente. Se la concentrazione extracellulare era questa (linea tratteggiata nel secondo grafico a destra) il trasportatore sarà in grado di portare la concentrazione extracellulare a saturazione a livelli maggiori rispetto a quella extracellulare. Il fatto che esistano diverse conformazioni del trasportatore attivo, con diverse affinità per lo ione o gli ioni trasportati che cambiano in seguito a fosforilazione, defosforilazione, variazione di conformazione, comporta la capacità di quel traportatore di non essere indifferente al lato a cui si lega al substrato. Non lega con la stessa affinità, come nel passivo, dal lato intra ed extracellulare. Se ha maggior affinità dal lato extracellulare tenderà a legarlo di là, dopo avrò il flip flop; se da questo lato ha perso affinità cioè la km è cambiata tenderà a rilasciarlo, questa volta. Grazie a questa caratteristica potrà trasportare contro gradiente. Se un trasportatore ha un’affinità maggiore vuol dire che legherà più facilmente anche a basse concentrazioni la sostanza da trasportare, la km è bassa e vuol dire che la concentrazione del substrato anche se bassa potrà funzionare ad un ½ della velocita massima. Alta affinità lega velocemente, bassa tende a rilasciare. TRASPORTO MEDIATO PASSIVO È equilibrante, funziona secondo le leggi della diffusione; va da una zona in cui il substrato è più concentrato a una zona in cui è meno concentrato. Questa è la modalità con cui vengono trasportate il maggior numero di sostanze di interesse vitale. Perché? Quando introduciamo cibo, tipo glucosio questo verrà ad essere concentrato nel tratto gastro-intestinale ed a livello del sangue e potrà passare all’interno dei nostri organi, nostre cellule. Le proteine che catalizzano il trasporto passivo sono le PERMEASI o FACILITANTI. Ne esistono tante e sono presenti in tutti gli esseri viventi (dagli Archeobatteri che sono estremofili, tra i primi batteri comparsi sulla terra che vivono nelle saline cioè in presenza di alte concentrazioni di sale, hanno anche pompe attivate dalla luce). In figura possiamo vedere una permeasi del glucosio: Vediamo come al solito le eliche transmembrana e ancora una volta anche se non si formano pori continui, ci deve essere una zona in cui ci sia la possibilità con gli specifici siti di legame della molecola da trasportare di creare delle tasche più ampie all’interno del bilayer fosfolipidico per consentire il passaggio dello ione. La diffusione facilitata più studiata è quella del glucosio. Di glucosio permeasi ne esistono tante, le più famose sono 7, nuove isoforme sono sempre indentificate nel corso di studi. Ancora una volta la selettività rappresenta un punto centrale, è una caratteristica dei carrier. Ha una km per il glucosio nella forma L, quello che non usiamo e che ha un valore 1000 volte superiore, cioè la trasporterà con una efficienza irrilevante dal punto di vista fisiologico; questo perché è altamente selettiva da distinguere l’isomero L dall’isomero D. Un’altra caratteristica per il trasporto transepiteliale del glucosio che è specifico per la molecola di D-GLUCOSIO ma non per la molecola del glucosio6 fosfato. Questo è un meccanismo simile a quello visto per l’NH3 e ACIDO ACETILSALICILICO con cui questi trasportatori che sono comunque passivi ed equilibranti riescono a creare un trasporto netto attraverso la membrana perchè il glucosio passa attraverso la membrana, poi fosforilato attraverso il metabolismo e questo non può tornare indietro perché il trasportatore non lo riconosce. Le varie isoforme hanno diverse capacità di trasporto espresse in modo diverse a seconda del sito e hanno affinità diverse. Più bassa è la km e più alta è l’affinità cioè la capacità di legare glucosio anche a basse concentrazioni. Non è un caso che quello che ha la km più bassa sia la GLUT3 a livello dei neuroni e della glia perché il metabolismo dei neuroni si basa sul glucosio e abbiamo bisogno di molto glucosio a livello di neuroni e glia. Il primo organo che deve approvvigionarsi di glucosio è il cervello, GLUT 3 ha la capacità di funzionare anche a basse concentrazioni di glucosio consentendo di evitare che ci siano oscillazioni nell’approvvigionamento, in modo che anche quando non stiamo mangiando glucosio viene fornito un apporto quasi costante. Funzionerà quasi a saturazione. Esempio: differenza tra GLUT3 e GLUT2 invece presente nelle cellule del pancreas. Queste hanno un’affinità più bassa, cioè la km è maggiore. Vuol dire che questi GLUT2 funzioneranno in maniera meno efficiente a concentrazioni basali di glucosio. Quando la glicemia si eleva avremo un aumento netto del flusso entrante di glucosio e della velocità del trasporto del glucosio servirà alle cellule beta pancreatiche per dire ad altre cellule del nostro organismo che devono cominciare a prendere più glucosio dal sangue perché ce n’è molto in circolo. Quando nelle cellule beta pancreatiche aumenta il flusso di glucosio, attraverso una serie di passaggi che vedremo, si ha il rilascio di insulina. Questo è ipoglicemizzante, consente alle cellule beta pancreatiche di funzionare come sensori dei livelli di glucosio. AUMENTO DELLA GLICEMIA→ FLUSSO ENTRANTE DI GLUCOSIO AUMENTA→AUMENTO DELLA SECREZIONE DI INSULINA→ ABBASSAMENTO DELLA GLICEMIA Se lui già funzionasse al massimo delle sue possibilità a concentrazioni basali di glicemia, non potrebbe aumentare quando la glicemia si alza. Per questo ha una km che è più elevata e non funziona a saturazione ma può aumentare il flusso a seconda delle variazioni della glicemia. Nel grafico dove dice “oscillazioni della glicemia” sono le variazioni di glicemia che abbiamo normalmente nel nostro corpo durante le diverse fasi post-prandiali o pre-prandiali. LIVELLO DI GLUCOSIO BASALE → LUI FUNZIONA AL 50%. Dopo di che ha la possibilità di aumentare del 10-12% le sue capacità di trasporto del glucosio perché questo consentirà una maggiore secrezione di insulina. Al contrario, a livello neuronale GLUT 3 deve funzionare sempre al massimo delle sue capacità, in condizioni di normale glicemia il GLUT 3 è a saturazione, funziona sempre al suo massimo. Deve consentire alle cellule neuronali di avere glucosio sempre a disposizione. Il maltosio si comporta come inibitore competitivo determinando un aumento della km e quindi un trasporto inferiore del glucosio.