Tema 10 DIyS 20232024 PDF

TEMA 10: LA VÍA SECRETORA. 1) TRANSLOCACIÓN DE PROTEÍNAS COTRADUCCIONAL Y POSTRADUCCIONAL AL RETÍCULO ENDOPLASMICO RUGOSO (RER). 2) PLEGAMIENTO ASISTIDO Y COORDINADO, MODIFICACIONES POSTRADUCCIONALES Y CONTROL DE CALIDAD EN EL RER. 1) Chaperonas del RE 2) Proteínas plegadoras 3) Glucosilación y su m...

TEMA 10: LA VÍA SECRETORA. 1) TRANSLOCACIÓN DE PROTEÍNAS COTRADUCCIONAL Y POSTRADUCCIONAL AL RETÍCULO ENDOPLASMICO RUGOSO (RER). 2) PLEGAMIENTO ASISTIDO Y COORDINADO, MODIFICACIONES POSTRADUCCIONALES Y CONTROL DE CALIDAD EN EL RER. 1) Chaperonas del RE 2) Proteínas plegadoras 3) Glucosilación y su modificación 4) ERAD: degradación asociada al RER 5) La respuesta a proteínas desplegadas (UPR) 6) Estrés en el RER y enfermedades humanas Direccionamiento de proteínas 2 1) TRANSLOCACIÓN DE PROTEÍNAS COTRADUCCIONAL Y POSTRADUCCIONAL AL RER Direccionamiento de proteínas Se usan los mismos mecanismos para dirigir a las proteínas a diferentes orgánulos. 1) La información está en la secuencia señal. ¿Cuál es? 2) Existen receptores específicos en cada orgánulo. ¿Cuál es el receptor? 3) Cada orgánulo tiene un translocador particular. ¿Cuál es su estructura? 4) La translocación es unidireccional mediante el acoplamiento de energía. ¿De dónde procede la energía? Recordamos…. Funciones del RE * Biosíntesis celular, plegamiento, ensamblaje y transporte de proteínas a orgánulos y al espacio extracelular * Producción de todas las proteínas transmembrana y lípidos de la mayoría de los orgánulos Regulador de la proteostasis Premios Nobel asociados con el RE George Palade :Vía secretora: experimentos de pulso y caza (años 60). Premio Nobel en Fisiología y Medicina 1974. Günther Blobel: La hipótesis señal. Premio Nobel en Fisiología y Medicina 1999 Translocación co-traduccional vs post-traduccional proteínas accesorias ATPasa unión estrecha SecA Translocación postraduccional: Proteínas ‹ 70 aa (40 aa fuera + 30 aa dentro del ribosoma) Translocación al tilacoide (Org. de la Célula) Energía: gradiente electroquímico y ATP Proteínas sec: translocadores bacterianos y del RE SRP: homologo a la SRP del RE TAT: translocador que puede importar proteínas plegadas Inserción espontánea: no necesita translocador Los posibles destinos de las proteínas que entran en el RE 1) Plegamiento y posiblemente ciclo de calnexina/calreticulina 2) Proteínas correctamente plegadas salen en vesículas COPII hacía el Golgi 3) Proteínas irreversiblemente mal plegadas entran en ERAD 4) Agregados. Se eliminan por fagia del RE → lisosomas (tema 14) 2) PLEGAMIENTO ASISTIDO Y COORDINADO, MODIFICACIONES POSTRADUCCIONALES Y CONTROL DE CALIDAD EN EL RER 1. Las chaperonas del RE. Bip y co-chaperonas ERdj Chaperonas de unión a carbohidratos (lectinas: calnexina y calreticulina) 2. Proteínas plegadoras. Formadoras de puentes disulfuro (proteínas PDI y ERp57) Peptidil-prolil isomerasas (PPIs). 3. Adición covalente de carbohidratos, glucosilación (N, O) y su modificación 4. ERAD (degradación asociada al RE) 5. UPR (respuesta a proteínas mal plegadas) EL RER ES UN SITIO DE CONTROL DE CALIDAD Procesos de plegamiento y sus proteínas principales que promueven la maduración de las proteínas en conformaciones funcionales. BiP: (Hsp70) dependiente del ATP. Impide que segmentos de una cadena naciente se plieguen mal o formen agregados Co-chaperonas: proteínas ERdj. Calreticulina y Calnexina: chaperones (lectinas) impiden la agregación de segmentos adyacentes de una proteína. Plegadoras de proteínas. PDI (proteínas disulfuro isomerasa) y PPIs (peptidyl-prolil isomerasas). En un entorno oxidante. Wiseman et al. 2022 Mol.Cell. 1) Las chaperonas del RE La chaperona BiP. (Binding Protein) - chaperona mas abundante del RE - relacionada con Hsp70 citosólica - tiene un dominio de ATPasa y un sitio de unión al péptido. Se une a regiones de aa hidrófobos. - asiste en el plegamiento de proteínas. Impide que segmentos de una cadena naciente se plieguen mal o formen agregados, promoviendo así el plegamiento de todo el polipéptido en su estructura apropiada. - debido a su ubicación es la primera que actúa - forma un complejo con co-chaperonas (modulan hidrólisis de ATP ej. ERdj) y proteínas plegadoras (pliegan) - Mantiene la barrera de permeabilidad. BiP en la translocación post-traduccional de proteínas al RER Tetrámero Chaperonas citosólicas Sec 61 Chaperona molecular (Hsc70) Figure 1. El ciclo BiP ATPasa y sus co-chaperonas Erdj (familia de proteínas DnaJ) con el ADP unido=tapa cerrada Dominio de unión a nucleótido (NBD) Dominio de con el ATP unión a nucleótidosunido=tapa abierta (NBD) Dominio de unión al sustrato (SBD) Pobre et Journal al. (2019) JBC 294:2098-2108 of Biological Chemistry 2019 2942098-2108DOI: (10.1074/jbc.REV118.002804) 1) En presencia de ATP, NBD y SBD están acoplados. 2) Hidrólisis de ATP, desacoplamiento de NBD y SBD, cierre de la tapa y retención del sustrato. Regulado por cofactores DnaJ asociados al RE (ERdjs, interactúan con el péptido desplegándolo, estimulan la hidrólisis de ATP y llevan el péptido a BiP-ADP). 3) Liberación de ADP y unión de ATP. 4) Cambio conformacional, unión de NBD y SBD y expulsión del péptido. 5) Reordenación del complejo NBD y SBD con la ayuda de ERdjs y comienzo de otro ciclo. 6) Modificación postraduccional con AMP. inactivación. Las chaperonas calnexina y calreticulina (lectinas) : asisten al plegamiento pero no pliegan Dominio P: bolsillo dominio lectina Dominio de bolsillo transmembrana soluble Señal de recuperación 2) Proteínas plegadoras Proteínas plegadoras PDI y ERp57: Tiol oxireductasas. Formación de puentes disulfuro y reordenación. Tiene lugar solo en el entorno oxidante en el RE. ¡En proteínas citosólicas NO! * 20 proteínas diferentes en mamíferos. Formación de un puente disulfuro PDI: protein disulfide isomerasa Sitio activo Ditiol reducido Tiol ionizado - entorno oxidante -S-S ayudan a estabilizar la estructura terciaria y cuaternaria - proteínas citosólicas no Disulfuro oxidado Remodelado de puentes disulfuro (S-S) Los S-S se forman entre cisteínas que aparecen en CIS dentro de la secuencia, las enzimas tipo PDI remodelan los S-S existentes para alcanzar la estructura termodinámicamente más estable - entorno oxidante - proteínas citosólicas no Proteína plegadora: Peptidil-prolil isomerasa. Aceleración de la rotación alrededor de los puentes peptidil-prolil en los segmentos desplegados de un polipéptido 3) Glucosilación y su modificación Hacía ERAD Sitio de unión a la lectina. Reconocido por calreticulina y calnexina. Núcleo invariable Composition of the Glc3Man9GlcNAc2 oligosaccharide initially transferred to nascent glycoproteins. The blue box surrounds the monoglucosylated Glc1Man9GlcNAc2 oligosaccharide recognized by calnexin and calreticulin. It is formed by the initial action of -glucosidase I followed by cleavage of a second glucose by glucosidase II. The lectin sites of Cnx and Crt bind to the terminal glucose residue of the Glc1Man9GlcNAc2 oligosaccharide as well as to three underlying mannose residues (dashed box). Also indicated is the terminal mannose residue cleaved by – mannosidase I to create a signal associated with rapid degradation of misfolded glycoproteins. Glc, glucose; Man, mannose; GlcNAc, Nacetylglucosamine. N-glucosilación  1 Transferencia del precursor a Asn-X-Ser/Thr. Oligosacaril transferasa. Interacción con ribosoma. secuencia señal  2-4 Inmediata y sucesiva modificación del precursor Organización de la Célula La última glucosa: papel en la unión a lectinas Modificación de carbohidratos y “el ciclo de la calnexina/calreticulina” (Org. de la Célula) ¿Y SI NO SE PUEDE PLEGAR BIEN? NO PASAN EL CONTROL DE CALIDAD ERAD (DEGRADACIÓN ASOCIADA AL RE) EDEM Y OS9 RETROTRANSLOCADOR PROTEASOMA Fagia del RE (tema14) LISOSOMA Wiseman et al. 2022 Mol. Cell. 4) ERAD (ER-associated degradation) Cómo se decide si una proteína entre en el sistema ERAD? N-oligosacárido: temporizador Competición entre: Glucosidasa: reacción rápida Manosidasa: reacción lenta. Ejemplo: si una proteína se pliega rápidamente se empaqueta en vesículas y viaja al Golgi. Si una proteína tarda en plegarse o no se pliega bien entra en varias rondas en el ciclo de calnexina/calreticulina y las manosidasas tienen oportunidad de actuar lo que la destina a ERAD. Ciclo de la calnexina/calreticulina Las chaperonas EDEM y OS-9, lectinas que juegan un papel en el control de calidad por ERAD en el RE. glucosa glucosidasas manosa manosidadas parte de un “gate-keeping complex” En levadura Yos9 ERAD Hoseki et al. (2010) J. Biochemistry 147:19-25 Modelo simplificado de ERAD (ER-associated degradation) AAA-ATPasa (p97). Complejo homohexamérico en forma de barril. El péptido tiene que desplegarse para pasar por el retrotranslocador ERAD-L (proteínas luminales glucosiladas) y ERAD-M (proteínas mal plegadas en el segmento transmembrana) * El RETROTRANSLOCADOR La vía de ERAD-L 1. Modificación por glucosidasas y manosidasas. 2. Unión de Yos9 y unión a Hrd3. 3. Inserción en el El péptido tiene que desplegarse para translocador Hrd1 con ayuda pasar por el retrotranslocador de Der1. *Sustratos de ERAD-M entran lateralmente a Hrd1. 4. Polyubiquitinación por Hrd1. 5. Reconocimiento por la Hrd1 es una E3 Cdc48 AAA-ATPasa y ubiquitina ligasa que extracción del sustrato. forma un translocador: Cdc48: AAA- 6. Recorte de la cadena de ubiquitación en el citosol ubiquitinas por una ATPasa deubiquitinasa. 7) Degradación por el proteasoma. Wu and Rapaport (2018) Algunos virus se aprovechan de ERAD Pérdida parcial del cápside Pérdida total del cápside Polioma virus (DNA). Entrada por caveosomas - Viaje por microtúbulos al RER - Cambio de la estructura del cápside por interacción con proteínas plegadoras - Reconocimiento por ERAD como proteínas mal plegadas – retrotranslocación al citosol bajo en Ca2+ pérdida del cápside – Importación del DNA al núcleo. Función de las chaperonas en condiciones normales (libres de estrés) 1) Translocación cotraduccional y postraduccional 2) Mantenimiento de la barrera de permeabilidad del RE 3) Ayuda en el plegamiento 4) Retrotranslocación 5) Almacenaje de Ca2+ 6) Detecta situaciones de estrés en el RE. Factores que inducen el estrés celular: - Niveles altos de síntesis proteica - Proceso de la ubiquitinación alterado y a consecuencia la degradación por el proteasoma - Autofagia alterada - Falta de nutrientes y energía - Niveles de Ca2+ o la homeostasis redox alterados - Inflamación - Hipoxia Respuesta 5) UPR (respuesta a proteínas mal plegadas) Sensores de estrés Situación de estrés celular: la respuesta de la célula a proteínas desplegadas (UPR). Mecanismo autónomo celular. Se activan 3 vías paralelas: Ire1, ATF6 y PERK La respuesta es la síntesis/activación de factores de transcripción en el citoplasma y se translocan al núcleo donde regulan la transcripción de genes implicados en el plegamiento y degradación del mRNA. Al mismo tiempo se para la síntesis de ciertas proteínas para Factores de bajar la cuantidad proteica. transcripción (TF) Regulación de genes ¿Cómo siente la célula el estrés? La clave es la chaperona BiP forma inactiva forma activa En situaciones libre de estrés BiP se une a los dominios luminales de los sensores de estrés Ire1, ATF 6 y PERK. Cuando la célula sufre estrés se desencadena la UPR con BiP disociándose de los sensores de estrés y así activándolos. La UPR adaptiva para la supervivencia celular corte Componentes - BiP - ATF6 viaja al Golgi donde se procesa y el fragmento entra en el núcleo - IRE1α. Homo dimerización y - autofosforilación. Activación de actividad endorribonucleasa. Esplicing no-convencional. XBP1 entra en el núcleo. RIDD: desintegración del mRNA - PERK. Homodimerización y trans-autofosforilación. Parada de la síntesis proteica global pero activación de la transcripción de genes específicos. Activación inmediata de ATF6 e IRE1 α. Si el estrés persiste, se activa PERK. Si el estrés persiste, la célula entra en apoptosis IRE1 PERK PERK. Inducción de los factores pre-apoptóticos ATF4 y CHOP. Vía intrinseca de la apoptosis (en Proliferación y Destino Celular). Involucración de IRE1 es incierta. Wang and Kaufman (2016) Nature Review 529:326-335. Homeostasis o Apoptosis? Bucle de retroalimentación Peter Walter, and David Ron Science 2011;334:1081-1086 6) Estrés reticular y enfermedades humanas HOT TOPIC Impact of UPRER Dysfunction with Age As an organism ages, the ability to induce a protective UPRER response declines. We propose that this, in combination with other factors (such as environmental stimuli and genetic risk factors), leads to protein aggregation, unresolved ER stress, and chronic inflammation. Ultimately, chronic inflammation increases susceptibility to disease and accelerates aging. Frakes and Dillin (2017) Molecular Cell 66:761-771. El papel del estrés y la UPR en la neurodegeneración. ER stress, UPR and neurodegeneration. Genetic mutations, ageing, oxidative stress, disrupted proteostasis and other stimuli may induce the misfolding and aggregation of proteins leading to ER stress. In order to resolve ER stress, adaptive response through UPR is activated. However, prolonged ER stress induces apoptosis affecting neurons and synaptic funcion, thus leading to neurodegenerative disease Enfermedades neurodegenerativas que pertenecen al grupo de enfermedades de plegamiento incorrecto de proteínas Trastorno cerebral que destruye lentamente la memoria. Trastorno de movimiento por falta de dopamina. Esclerosis lateral Demencia asociada amiotrófica (ELA). a trastornos de Afectación de movimiento motoneuronas. Proteostasis y envejecimiento Decline of Protein Homeostasis with Age Cell stress response pathways maintain proteostasis throughout the lifetime of an organism. Recent studies suggest that these protective mechanisms are diminished with age. Also, UPRER components are reduced in brain tissue of rodents with age. Impaired UPRER likely contributes to unresolved ER stress and chronic inflammation, which leads to tissue decline with age and exacerbates pathology in diseases of protein aggregation. C. Elegans como modelo de estudio del desarrollo y el envejecimiento 1) es transparente a lo largo de toda su vida, lo que facilita la observación de su desarrollo temprano bajo el microscopio; 2) es hermafrodita, lo que favorece la obtención y mantenimiento de individuos con mutaciones recesivas; 3) es uno de los organismos animales más simples que cuentan con sistema nervioso y digestivo bien definidos, por ejemplo en cuanto a número celular, posee 959 células, lo que ha permitido caracterizar cómo se genera cada linaje celular a lo largo del desarrollo; 4) es de muy fácil mantenimiento en el laboratorio, fácil de alimentar y manejar; 5) su corta vida de 2-3 semanas lo convierte en un modelo de alto rendimiento con resultados en corto plazo de tiempo; 6) y es relativamente sencillo interrumpir la función de genes específicos mediante interferencia por ARN interferente (RNAi), lo que permite silenciar la función de un gen para inferir su efecto. Comunicación no autónoma celular de la UPR Relación entre el mantenimiento de un proteoma equilibrado y longevidad. C. Elegans: Mejorando la proteostasis protege de la agregación proteica y extiendo la vida del organismo. Experimento: Expresión ectópica de xbp-1s (TF de la vía IRE1) en neuronas. Restauración de la pérdida de la UPR con la edad, confiriendo resistencia al estrés y prolongación de la vida de C. elegans. Molécula responsable? No se conoce, pero requiere unc13, un mediador de la secreción de vesículas en neuronas. Neurotransmisor?? Xbp-1s neuronal activa la UPR en células intestinales a distancia. Mecanismo no autónomo celular Comunicación entre tejidos. Frakes and Dillin (2017) Molecular Cell 66:761-771. Estrés en el ER y activación de la UPR en tumores humanos Células transformadas suelen tener un metabolismo elevado. Son células que proliferan rápidamente y tienen una síntesis proteica elevada → precisan de más proteínas plegadoras. Pueden activar la UPR como una medida de supervivencia. Respuesta autónoma celular. En la progresión maligna se pueden activar vías que afectan las células del microentorno. Estimulación de células inmunes y endoteliales que ayudan en el crecimiento tumoral. Inducción de la UPR en macrófagos y su activación (secreción de citoquinas que promueven la angiogénesis, activación de metaloproteasas de la matriz etc..) y en células dendríticas (suprimen la proliferación de células T). Respuesta no autónomo celular Facilitan el crecimiento tumoral Agentes terapéuticos para el tratamiento del estrés en el RE y la UPR Aumentan el plegamiento Cajas verdes: resuelven estrés reticular Cajas rojas: inducen estrés reticular con el fin de matar o sensibilizar las células para otros tratamientos Enfermedades neurodegenerativas Diabetes Inflamación Cáncer Wang and Kaufman (2016) Nature Review RESUMEN 1) En el lumen oxidante del RE las proteínas se glucosilan, se pliegan, se forman los puentes disulfuro y se ensamblan las subunidades de proteínas multiméricas. 2) En el RE existen chaperonas (BiP, calnexina y calreticulina..) que ayudan en el plegamiento de proteínas por proteínas plegadoras (PDI, ERp57 etc.) 3) Regla de oro: solamente las proteínas bien plegadas salen del RE hacia el aparato de Golgi. 4) Hay dos procesos clave de control de calidad: ERAD y UPR. 5) Las proteínas mal plegadas, subunidades no ensambladas o péptidos son transportadas al citosol (retrotranslocación por Hrd1) donde son degradadas en proteasomas (ERAD). Las lectinas como EDEM y OS9 reconocen proteínas destinadas a ERAD. 6) La acumulación de proteínas no plegadas causa el incremento de proteínas plegadoras y chaperonas (UPR). Hay tres vías que se inducen en paralelo: IRE1, ATF6 y PERK. Si no se resuelve el estés en el ER puede causar apoptosis. 7) El estrés crónico puede contribuir al desarrollo de ciertas enfermedades entre ellas neurodegerativas y al envejecimiento. 8) Existe una repuesta no autónoma celular al estrés que se transmite por el sistema nervioso. Bibliografía básica Alberts et al. (2016) Biología molecular e la célula 6ª ed. Capítulo 12. RE. Lodish et al. Molecular Cell Biology. (2016) 8th ed. Chapter 13.1 and 13.3. Moving proteins into membranes and organelles. Bibliografía complementaria Frakes and Dillin (2017) The UPRER: Sensor y Coordinador of Organismal Homeostasis. Molecular Cell Review 66:761-771. Wang and Kaufman (2016) Protein misfolding in the ER as a conduit to human disease. Nature Review 529:326-335. Wiseman et al. (2022) Reshaping Endoplasmic Reticulum Quality Control Through the Unfolded Protein Response. Mol Cell. 82: 1477–1491. Wu and Rapoport (2018) Mechanistic insights into ER-associated protein degradation. Curr Opin Cell Biol. 53:22-28.