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Bases Moleculares de la IHQ Dr. Ronald Pérez L. Tecnólogo Médico. 1. Definición ¿Qué es un anticuerpo? Según Wikipedia Los anticuerpos o inmunoglobulinas, (Ig), son glicoproteína...

Bases Moleculares de la IHQ Dr. Ronald Pérez L. Tecnólogo Médico. 1. Definición ¿Qué es un anticuerpo? Según Wikipedia Los anticuerpos o inmunoglobulinas, (Ig), son glicoproteínas del tipo gamma globulina. Pueden encontrarse de forma soluble en sangre y otros fluidos, disponiendo de una forma idéntica que actúa como receptor de los linfocitos B y son empleados por el sistema inmunitario para identificar y neutralizar elementos extraños tales como bacterias, virus o parásitos. 2. Estructura General de los Anticuerpos I Secuencias de Reconocimiento Areas importantes: Complementarias a la Estructura Conformacional del Antígeno Amino Terminal. –NH3+ Carboxilo Terminal. -COOH Bisagra. Puente Disulfuro 2. Estructura General de los Anticuerpos II Molécula Bivalente. Heterodimero. Unidos por puentes di-sulfuro. S-S Estructura Globular. Región Bisagra permite movimiento. 2. Estructura General de los Anticuerpos III 3. Propiedad de Reconocimiento La propiedad de reconocimiento de los anticuerpos reside en su complementariedad tridimensional con una secuencia determinada de otra molécula. El reconocimiento del antígeno por el anticuerpo tiene lugar en un locus específico constituido por los extremos de la cadena ligera y pesada, en la que ”encaja” el antígeno. La zona de Unión estabilizada por fuerzas que reconocimiento por parte del Ac es de mantienen unido de manera no tamaño limitado (10 aa) covalente al Ac con el Ag. Generando el complejo Ag-Ac. 4. Estabilidad del complejo Ag-Ac La estabilidad de un complejo entre dos moléculas depende de las fuerzas de La complementariedad en la reacción Ag- atracción y repulsión que se generen Ac sigue el modelo de “llave cerradura”, entre sus sitios de interacción. donde cada Ac es específico para una determinada secuencia tridimensionalmente complementaria. Complejo Ag-Ac estable: Complejo Ag-Ac inestable: 𝜀 atracción > 𝜀 repulsión. 𝜀 atracción < 𝜀 repulsión. 4. Fuerzas de unión entre Ag y Ac Enlaces no covalentes Origen Fuerzas electrostáticas Atracción entre cargas opuestas. Fuerzas Hidrofóbicas Colapso hidrofóbico [Exclusión de moléculas de agua en grupos apolares]. Puentes de Hidrógeno Fluctuación de cargas entre nubes electrónicas polarizadas de átomos vecinos. Fuerzas de Van der Waals Átomos de H compartidos entre dos átomos con alta electronegatividad. 5. Etapas de la Reacción Ag-Ac Fase 1 Reconocimiento entre Sitio de Reconocimiento Antigénico y Epítopo. Fase 2 Exclusión de Moléculas de H2O → permite acercamiento estrecho y estabilización de las uniones débiles. 5. Características de la Reacción Ag-Ac I La reacción antígeno- Se produce cuando un anticuerpo (Ag-Ac) → anticuerpo entra en contacto respuesta inmunitaria en con un antígeno para la mamíferos. formación de un complejo antígeno-anticuerpo. Características 1. Las reacciones Ag-Ac dependen de la proporción de Antígeno y Anticuerpo y la temperatura y composición del medio. 2. Específica. [Modelo de Llave-Cerradura]. 3. Uniones débiles NO COVALENTES. [Formación de uniones transcientes]. 4. Rápida [mseg] y espontánea [no requiere energía de activación]. 5. Características de la Reacción Ag-Ac II El reconocimiento Ag-Ac es una reacción de complementariedad, entre una parte del antígeno y los aminoácidos del sitio de unión del anticuerpo. La reacción se caracteriza por su especificidad, rapidez, espontaneidad y reversibilidad. Debido a las fuerzas de Unión del complejo Ag-Ac, la El punto de equilibrio de la estabilidad de la reacción depende de la Ley de reacción se produce cuando la Acción de Masas. cantidad de enlaces formados es equivalente a los enlaces rotos. La formación del Complejo Ag-Ac es REVERSIBLE 5. Estabilidad de los Complejos Ag-Ac Afinidad Avidez Es una propiedad Es una propiedad que intrínseca al anticuerpo y depende de la afinidad a su fabricación. del Ac y de la valencia de la interacción. Fuerza de unión entre una molécula de Ac y el Es una medida de la punto de unión con el fuerza total de unión de determinante antigénico un Ac a su antígeno. [Fuerza de unión epítopo – parátopo] Afinidad intrínseca Afinidad funcional 5. Valencia de Ac y su relación con la avidez Valencia de la Avidez de la Interacción Interacción Monovalente Baja Bivalente Alta Polivalente Muy Alta 5. Valencia de Ac y su relación con la avidez Cuando el anticuerpo es multivalente, la Energía de unión global puede ser mayor que la del fragmento Fab; de esta manera, incluso con una afinidad baja, una IgM puede ser eficaz para unirse a antígenos → Ventaja en procedimientos de IHQ*** Antibody Fab IgG IgG IgM Effective 1 1 2 Up to 10 Antibody Valence Antigen Valence 1 1 n n Equilibrium 104 104 107 1011 Constant (L/M) Advantage of nd nd 103- fold 107-fold multivalence Deffinition of affinity affinity avidity adivity Binding Intrinsic Affinity Functional affinity 6. Factores que afectan la formación y estabilidad de los complejos Ag-Ac Depende de la naturaleza química de las interacciones Ag-Ac. Puentes de Temperatura H son más estables a bajas Tº e interacciones hidrofóbicas más estables a mayor Tº Rango óptimo entre 6,5 y 8,5. pHs extremos pueden cambiar la pH conformación tridimensional de los sitios de reconocimiento del Ac o Ag e inhibir la reacción. Concentración de Iones de Na+ y Cl- pueden desestabilizar las uniones Fuerza Iónica débiles del sitio de interacción. Es un problema cuando se utilizan Ac de baja afinidad. Mantención de su estructura tras el histoprocesamiento o tratamiento de Conservación del las muestras. Puede haber pérdida de reactividad por cambios Ag conformacionales tras el procesamiento de las muestras. Concentración del Viene establecida por el proveedor/fabricante del anticuerpo, pero en Anticuerpo base a esta información, puede ser ajustada por el tecnólogo. 7. Visualización de la reacción Ag-Ac I Determinantes generales de la fuerza de asociación Ag-Ac: 1. Distancia de interacción entre epitopo & paratopo. [