Biologia Molecolare: Tecniche di Genome Editing (PDF)

17.1 Biologia molecolare 12/12/2023 TECNICHE DI GENOME EDITING Quando abbiamo parlato di terapia genica abbiamo affrontato una serie di strategie atte a trattare malattie monogeniche con una mutazione ben precisa. L’idea era quella di...

17.1 Biologia molecolare 12/12/2023 TECNICHE DI GENOME EDITING Quando abbiamo parlato di terapia genica abbiamo affrontato una serie di strategie atte a trattare malattie monogeniche con una mutazione ben precisa. L’idea era quella di utilizzare un vettore virale per correggere il difetto, portando una versione funzionante del gene all’interno delle cellule riceventi. Abbiamo visto che questa strategia si è dimostrata di successo in tanti casi, ma non è un approccio universale: in caso di patologie con più cause genetiche o di patologie che coinvolgono geni di grandi dimensioni, e quindi rendono difficile la sostituzione della molecola non funzionante da parte di una molecola esogena, gli approcci di terapia genica classica sono uno strumento inutilizzabile. L’editing genomico è una tecnologia altamente innovativa che funziona come un “correttore di bozze” del DNA: interviene in maniera precisa per trovare e correggere gli errori genetici all’interno dell’intero genoma. Molti considerano l’editing genomico come la terapia genica del futuro, visto che permetterebbe di correggere un gene difettoso direttamente là dove si trova senza doverne fornire una copia sana dall’esterno. CRISPR La vera rivoluzione in questo campo è arrivata nel 2012 con la scoperta del sistema Crispr-Cas9, che ha messo in secondo piano i sistemi di editing denominati nucleasi a dita zinco (zinc-finger nucleases), meganucleasi e TALEN che erano stati utilizzati fino ad allora dai ricercatori di tutto il mondo. CRISPR ha dimostrato, fin da subito, una potenzialità e una versatilità fino a poco prima inimmaginabili: qualunque tipo di cellula, inclusa quella umana, può essere modificata geneticamente e la correzione può avvenire anche per un singolo errore, e ovunque nel genoma. Inoltre, questa tecnica è facile da utilizzare, veloce ed economica, tutti fattori che contribuiscono ad ampliarne le potenzialità in ambito terapeutico. Questa scoperta rivoluzionaria ha premiato Emmanuelle Charpentier e Jennifer A. Doudna per il loro famoso studio pubblicato su Science nel 2012 con il Premio Nobel per la Chimica 2020 per lo “sviluppo di un metodo di editing genomico” basato su CRISPR. CRISPR è l’acronimo di “Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats”, ovvero sequenze geniche che si ripetono a intervalli regolari. Questo sistema è stato originariamente scoperto nei batteri, nei quali agisce come arma di difesa contro i virus - un po' come il sistema immunitario umano - e funziona in maniera molto semplice ma con grande efficienza. Il sistema CRISPR si basa sulla combinazione di due elementi: un enzima Cas e un RNA guida che si appaia al DNA del virus per indicare a Cas il punto in cui tagliare. Come nel caso della terapia genica, anche la strategia di editing basata su CRISPR può essere somministrata in vivo (direttamente nell'organismo) o ex vivo (all'esterno, su cellule vive prelevate dell'organismo). Feng Zhang nel 2016 ha capito come far funzionare il sistema batterico CRISPR nei mammiferi, il cui DNA è compartimentato e organizzato ben diversamente rispetto a quello dei microrganismi. CARATTERISTICHE E REQUISITI DEL GENOME EDITING CON CRISPR-CAS9 Il genome editing è una tecnica con cui è possibile riconoscere in modo altamente specifico sequenze di DNA che contengono mutazioni, per poi tagliare il gene target sul doppio filamento e sostituirlo con un filamento “sano” sfruttando tre strutture: - Endonucleasi (Cas9) - RNA a singolo filamento, come guida della endonucleasi - Piccola sequenza di cinque nucleotidi (PAM) presente sul DNA. Quest’ultima è necessaria per permettere all’RNA guida di riconoscere il gene target e fare in modo che Cas9 tagli la sequenza corretta. Pertanto, quando in laboratorio si disegna Sbobinatore: Aurora Teso Revisore: Valentina Peretti 17.1 Biologia molecolare 12/12/2023 l’RNA guida è fondamentale individuare il sito PAM d’interesse, così da essere il più possibile sicuri sulla regione che verrà poi tagliata. Le nucleasi che vengono utilizzate per questa tecnica sono endonucleasi di origine batterica (le Cas9 utilizzate derivano da ceppi molto comuni, come il papillo coccus aureus). Queste ultime sono in grado di andare a tagliare, su entrambi i filamenti, il DNA target in maniera altamente specifica. MECCANISMO Questa è l’immagine originale dell’MIT (Massachussetts Institute of Technology) che nel 2015 ha reso noto alla comunità scientifica il successo della procedura. In presenza di una cellula con una mutazione a livello del genoma (non è necessario sia in una fase specifica del ciclo cellulare), la tecnica del genome editing prevede l’impiego di una molecola di RNA a singolo filamento in grado di guidare l’endonucleasi (Cas9) verso la zona del genoma d’interesse. L’RNA si appaia, così, alla sequenza PAM, inducendo Cas9 a tagliare il DNA target su entrambi i filamenti. Questi ultimi si possono riparare spontaneamente (attraverso i due processi descritti sotto), oppure è possibile che al frammento originale contenente la mutazione, venga sostituita una copia sana del DNA (inserita nella cellula assieme a Cas9 e all’RNA guida). L’interruzione del genoma viene, poi, legata dagli enzimi presenti all’interno della cellula eucariote, dando vita ad un gene editing assolutamente preciso. (Nel caso della sostituzione con un DNA sano si parla di gene correcting). Una molecola di RNA guida, una copia sana di DNA e una endonucleasi sono stati gli unici tre elementi che Feng Zhang ha utilizzato per i suoi esperimenti pioneristici. I tagli su entrambi i filamenti possono essere riparati spontaneamente attraverso due vie, a seconda del tipo cellulare: ➔ Non homologous end joining (NHEJ): prevede il ricongiungimento delle estremità della rottura e può richiedere la presenza di alcuni nucleotidi complementari in prossimità della lesione ➔ Ricombinazione omologa: la cellula sfrutta l’allele sano per poter riparare un danno che avviene in modo specifico soltanto su uno dei due filamenti. Sbobinatore: Aurora Teso Revisore: Valentina Peretti 17.1 Biologia molecolare 12/12/2023 EVOLUZIONE DI CRISPR-CAS9 NEL BATTERIO CRISPR-Cas è un sistema molecolare batterico con funzione di protezione dall’infezione dei fagi. Come il sistema CRISPR-Cas9 protegge il batterio: Grazie al sistema Crispr-Cas9 numerosi batteri riconoscono un virus (fago) che li ha già infettati e ne contrastano l’attacco. CRISPR “Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats” è una regione del genoma batterico dove, durante un attacco virale, il batterio accumula sequenze di DNA del virus stesso. Nel caso di un attacco successivo da parte di un virus dello stesso ceppo, l’enzima Cas9, guidato da due RNA, riconoscerà il nuovo DNA virale introdotto e lo disattiverà, tagliandolo. 1. Infezione: Un fago inietta il suo DNA nel batterio 2. Acquisizione: Le sequenze PAM di DNA virale vengono inserite nella regione CRISPR del genoma batterico 3. Nuova infezione: Un virus già incontrato inietta il suo DNA nel batterio 4. Maturazione di Cas9: Nel caso di attacco virale, si attiva la regione CRISPR. Vengono prodotti l’enzima Cas9, un frammento di RNA (tracrRNA) e un RNA per ciascuna sequenza virale registrata in CRISPR. Cas9 e questi RNA formano un complesso. 5. Riconoscimento: Cas9 riconosce la sequenza PAM sul DNA estraneo grazie ai suoi due RNA guida. 6. Distruzione: Cas9 taglia il DNA virale esogeno, che una volta distrutto, non potrà più produrre le proteine necessarie alla replicazione del virus. Perché è stato scelto CRISPR-Cas nel genome editing? Il motivo principale è che questo sistema enzimatico (Crispr-Cas9) può essere ottimizzato ai massimi livelli per quanto riguarda la sito-specificità di azione di intervento endonucleasico. I sistemi di editing denominati nucleasi a dita zinco (zinc-finger nucleases), meganucleasi e TALEN non hanno alcuna possibilità di sviluppo terapeutico perché hanno un’azione aspecifica. Queste nucleasi tagliano in regioni varie del genoma perché le sequenze di riconoscimento sono degenerate, non sono precise. Cercare di utilizzare questo tipo di nucleasi per correggere un difetto, fa più danni che benefici: magari viene corretta la mutazione nel sito di interesse ma il genoma è danneggiato in molti altri punti. Sbobinatore: Aurora Teso Revisore: Valentina Peretti 17.1 Biologia molecolare 12/12/2023 Grazie al sistema Crispr-Cas9 è stata ottenuta la quasi totalità di specificità di intervento. Oggi siamo abbastanza sicuri di andare a colpire solo e soltanto il punto di interesse, sfruttando la guida a RNA a singolo filamento. Perché questo sistema si fa guidare dall’RNA a singolo filamento? Perché questo sistema, come riassunto nel grafico, ha un’origine evolutiva che deriva da un meccanismo di difesa endogeno dei procarioti nei confronti dell’infezione dei fagi (virus batterici). Quando abbiamo parlato delle caratteristiche principali del genoma della cellula eucariota abbiamo detto che il 98% del nostro genoma è non codificante e che molto del DNA è costituito da sequenze virali che si sono inserite nel nostro genoma e sono rimaste lì, inattivate. La stessa cosa succede nei procarioti. Anche le cellule batteriche sono infettate da virus che nel mondo procariota si chiamano fagi. I fagi riescono ad inserire all’interno della cellula batterica il proprio genoma, che si integra in punti specifici del cromosoma batterico e va incontro a una sorta di latenza, rimanendo integrato nel cromosoma batterico, formando una biblioteca genica di sequenze virali il cui significato era completamente sconosciuto fino a qualche anno fa. È stato scoperto che questa libreria di sequenze virali che i procarioti mantengono integrata nel proprio DNA sono una sorta di stampo che permette loro (ai procarioti) di affrontare successive infezioni da parte dello stesso ceppo virale. Come? Uno dei sistemi enzimatici presenti nelle cellule procariote, deputato allo sviluppo di una certa “immunità”, è il sistema Cas9: un sistema enzimatico dotato di attività endonucleasica nei confronti del DNA esogeno. Come fa Cas9 ad attivare la propria azione endonucleasica solo nei confronti delle particelle virali che infettano i procarioti? Il batterio utilizza quelle sequenze virali che sono state integrate nel genoma al momento della prima infezione da parte di un ceppo virale per sintetizzare delle copie di RNA a singolo filamento (complementari alle sequenze integrate) che sono in grado di guidare l’attività degradativa di Cas9 solo e soltanto nei confronti del genoma virale che per la seconda volta ha infettato il ceppo batterico. Quelle sequenze virali che sono andate incontro a integrazione sono una sorta di “vaccinazione” che la cellula procariota subisce, mantenendo all’interno del proprio genoma una memoria della prima infezione. A lezione è stato visto il seguente video: https://youtu.be/2pp17E4E-O8?si=Z0UuQWjn_KNqTWSd Il video evidenzia un aspetto importante: questo tipo di intervento sul genoma porta al ruolo attivo del ricercatore nel fornire la copia di DNA corretto. Se all’interno della cellula bersaglio viene inserita più di una sequenza specifica di riconoscimento, è possibile correggere contemporaneamente più di una mutazione. Il sistema Crispr-Ca9 può essere applicato non soltanto al trattamento delle malattie monogeniche ma, teoricamente, permette di colpire un difetto causato da più mutazioni all’interno della stessa cellula. GENOME EDITING: COSA FA L’OPERATORE NELLA PRATICA? Nella pratica, l’operatore segue i seguenti passaggi: - Studia la sequenza del locus genico di interesse - Disegna le guide di RNA (con il supporto di programmi bioinformatici) - Le guide vengono ordinate e trasferite nella cellula tramite metodi chimici (micelle) - Vengono inseriti anche l’apparato enzimatico (proteina Cas9 ricombinante) e la versione sana del gene di interesse - Dopo 48-72 ore si analizza se la proteina di interesse è stata rimossa o riparata Sbobinatore: Aurora Teso Revisore: Valentina Peretti 17.1 Biologia molecolare 12/12/2023 APPLICAZIONI DI CRISPR-CAS9: CORREZIONE DELLA DISTROFINA Un articolo pubblicato qualche anno fa su Science, riporta uno studio su un modello murino di distrofia muscolare, molto simile nei tratti patogenetici alla distrofia muscolare di Duchenne, trattato con il genome editing. Sono stati utilizzati i vettori adeno-associati per trasferire all’interno degli animali: - il sistema Cas - la guida a RNA specifica, che portasse l’endonucleasi esattamente nel punto della mutazione all’interno della distrofina In questo caso gli animali erano nati ingegnerizzati come portatori della mutazione. Di seguito è riportata la sezione trasversale delle fibre muscolari scheletriche di un fenotipo Wild- Type, un fenotipo distrofico e un fenotipo distrofico trattato con CRISPR-Cas9 - Il fenotipo WT ha un profilo regolare delle cellule muscolari, con i nuclei in blu - Nel fenotipo distrofico il verde brillante è assente, con la presenza di tanti buchi perché il muscolo è morto - Nel fenotipo distrofico trattato con Crispr-Cas9, le fibre verdi brillanti hanno cominciato a ricolonizzare il muscolo Come è stato effettuato questo esperimento? Nel topo malato è stato sfruttato AAV per portare all’interno della fibra muscolare l’enzima Cas9 e la guida a RNA che lo portasse nel punto specifico della mutazione. Le fibre muscolari sono state corrette e il fenotipo è stato ripristinato: anche se non al 100%, la contrazione è ripresa con la quasi completa reversione del fenotipo. PREVENZIONE DELLA DISTROFIA MUSCOLARE IN MURINI ATTRAVERSO L’EDITING GENOMICO DEL DNA DELLO ZIGOTE, MEDIATO DA CRISPR-CAS9 Il gruppo di studio di Eric Olson ha utilizzato il sistema Crispr-Cas9 nello zigote, per modificare il locus genico che porta la mutazione causativa del fenotipo distrofico, utilizzando una guida a RNA e Cas9. Nell’immagine è rappresentata l’immunofluorescenza della Distrofina (colore verde) in soggetti Wild-Type, in soggetti MDX (portatori di mutazione nella distrofina) e soggetti portatori di mutazione con fenotipi corretti a varia penetranza e con varia percentuale di successo (17%, 41%, 83%). Sbobinatore: Aurora Teso Revisore: Valentina Peretti 17.1 Biologia molecolare 12/12/2023 Nel fenotipo Wild-Type le fibre sono strettamente compattate e uniformemente verdi in tutti i muscoli rappresentati. Nel modello murino MDX (portatore di mutazione) il verde non è presente, inoltre non è distinguibile un profilo muscolo- simile. Nei fenotipi MDX corretti con una percentuale di successo del 17% le fibre hanno iniziato ad assumere un profilo tipico delle cellule muscolari, fino ad arrivare alla percentuale di successo del 83%, con la completa reversione del fenotipo. Questo esperimento ha dimostrato che il genome editing con CRISPR-Cas9 permette di correggere completamente il difetto genetico editando la linea germinale del topo affetto da malattia e così revertendo il fenotipo patologico. Le distrofie sono l’esempio per eccellenza di utilizzo di questo approccio, in quanto non possono essere curate con altri metodi. Questo trattamento è stato applicato anche ad altre patologie genetiche invalidanti, come l’emofilia, il cui fenotipo è stato revertito con successo. LIMITI ETICI DEL GENOME EDITING Questo tipo di applicazione ha determinato una grande soddisfazione nell’ambito clinico e scientifico, ma ha diviso un uso corretto e un uso sbagliato di questo tipo di tecnica. Lo studio del gruppo di Olson ha dimostrato che è possibile correggere in homo sapiens un difetto genetico andando a lavorare sulle linee germinali: immediatamente è scattata una moratoria nella comunità scientifica internazionale, su quelli che sono gli usi illeciti di questa tecnologia. Modificare gli zigoti o le linee germinali è una procedura con dei limiti etici. A far scattare il cortocircuito tra ricerca scientifica ed etica è stato il passo compiuto da un gruppo di ricercatori cinesi che nell’aprile del 2015 ha annunciato di aver sottoposto a manipolazione genetica degli embrioni umani per correggere il gene resposabile della talassemia. L’esperimento, ripetuto un anno dopo per rendere gli embrioni resistenti ad Hiv, ha violato la moratoria che qualche mese prima gli stessi ricercatori pionieri della tecnica si erano autoimposti. Un ricercatore che ha assistito la gravidanza di due gemelli, i cui embrioni derivavano da tecniche di fertilizzazione in vitro, ha dichiarato di aver manipolato gli embrioni con il sistema CRISPR- Cas9, in modo da eliminare dal genoma dei gemelli il gene responsabile dell’infezione da HIV, rendendoli resistenti all’infezione, quindi immuni. Sbobinatore: Aurora Teso Revisore: Valentina Peretti 17.1 Biologia molecolare 12/12/2023 Questi casi hanno generato il blocco della ricerca sulle applicazioni di CRISPR-Cas9. Questo è lo strumento che ha la potenzialità di risolvere i difetti genetici MA ha dei limiti rigorosissimi, soprattutto per quanto riguarda le applicazioni ad homo sapiens. In questa cartina sono rappresentati i limiti legislativi sull’utilizzo di Crispr-Cas9 per la manipolazione La tecnologia Crispr-Cas9 sugli embrioni è bandita in Europa, ma non in UK. Basta collaborare con un gruppo che lavora in UK per portare avanti la ricerca in questo campo. Sbobinatore: Aurora Teso Revisore: Valentina Peretti