Genom-Editierung: Grundlagen und klinische Anwendung PDF

Einführung in die Genomeditierung Molekulare Genetik“ „ B....

Einführung in die Genomeditierung Molekulare Genetik“ „ B.MM106 SoSe2021 Dr. Gökhan Yigit Institut für Humangenetik Universitätsmedizin Göttingen Georg-August-Universität Göttingen [email protected] Lernziele - Grundlagen und Anwendungbereiche - Werkzeuge - Zinkfinger-Nukleasen - TALEN - CRISPR/Cas-System - Beispiel für therapeutische Anwendungsmöglichkeiten der Genomeditierung Humangenetik, Gökhan Yigit © UMG Was versteht man unter Genomeditierung ? - Molekulargenetische Techniken, Methoden und Verfahren, um gezielt Veränderungen im Erbgut einzuführen - Mikroorganismen, pflanzlichen, tierischen und auch menschlichen Zellen - Ziele: - „knock-out“; Ausschalten eines Gens/mehrerer Gen - „knock-in“; Einbringen eines Gens (Cisgen/Transgen) - Aktivierung/Repression endogener Gene - gezielte Veränderungen einzelner Basen (Punktmutationen) Humangenetik, Gökhan Yigit © UMG Anwendungsbereiche Entwicklung von Arzneistoffen / Tiermodelle Medikamenten zelluläre “Gentherapie” Modellsystem Hsu et al., Cell, 2014 “Grüne Gentechnik” Humangenetik, Gökhan Yigit © UMG Anwendungsbereiche: “Grüne Gentechnik” Leopoldina/DFG/Union der deutschen Akademien der Wissenschaften; Wege zu einer wissenschaftlich begründeten, differenzierten Regulierung genomeditierter Pflanzen in der EU, 2019 Humangenetik, Gökhan Yigit © UMG Anwendungsbereiche genetische Erkrankungen Maeder, Gersbach; Molecular Therapy, 2016 Humangenetik, Gökhan Yigit © UMG Entwicklung der Genomeditierung Doudna and Charpentier, Science, 2014 Humangenetik, Gökhan Yigit © UMG Voraussetzungen DNA-Bindedomäne Nuklease Reparaturprozesse (Donor-DNA template) Humangenetik, Gökhan Yigit © UMG Voraussetzungen DNA-Bindedomäne Nuklease Reparaturprozesse (Donor-DNA template) Humangenetik, Gökhan Yigit © UMG Neue Werkzeuge Adli, Nat. Comm., 2018 programmierbare Genscheren oder Designernukleasen zur gezielten Editierung des Genom Humangenetik, Gökhan Yigit © UMG Neue Werkzeuge Adli, Nat. Comm., 2018 Humangenetik, Gökhan Yigit © UMG Zinkfinger-Nukleasen - entwickelt in den 1990er - jedes Monomer besteht aus zwei Untereinheiten: 1. Fok I-Endonuklease-Domäne 2. 3-6 Zinkfinger-repeats, die 9-18 Nukleotide erkennen und spezifisch binden (3 pro ZF) - Spezifität kann durch den Austausch der ZF- repeats verändert werden - arbeiten als Dimer, dadurch Verdopplung der Erkennungssequenz - jedes Monomer schneidet dabei einen DNA- Strang - Herstellung sehr aufwendig Max Planck-Gesellschaft/ Art for Science Humangenetik, Gökhan Yigit © UMG TALEN - Transcription activator-like effector nucleases (Transkription-Aktivator-artige Effektornuklase) - jedes Monomer besteht aus zwei Untereinheiten: 1. Fok I-Endonuklease-Domäne 2. Erkennungsdomäne basiert auf dem TAL- Effektor-Protein des Bakteriums Xanthomonas spp. - TAL-Effektor-Proteine können Gene in pflanzlichen und tierischen Zellen aktivieren  bessere Infektion durch Bakterien - arbeiten als Dimer Humangenetik, Gökhan Yigit © UMG TALEN Max Planck-Gesellschaft/ Art for Science - TAL-Effektoren bestehen aus bis zu 33 Wiederholungen eines 34 AS langen Abschnitts, die jeweils eine Base erkennen - nur zwei AS determinieren, welche Base gebunden wird  einfache Modifikation - hohe, variable Anzahl an repeats ermöglich eine hohe Spezifität Humangenetik, Gökhan Yigit © UMG  Und heute ? Humangenetik, Gökhan Yigit © UMG Entwicklung des CRISPR/Cas9 Systems I. Zündorf, DAZ, 19/2015 Humangenetik, Gökhan Yigit © UMG CRISPR/Cas9 Systems - clustered regularly interspaced short palindromic repeats - Teil eines bakteriellen „Immunsystem“ zur Abwehr von Viren/Phagen - CRISPR- und „spacer“-Sequenzen in die CRISPR-RNA (crRNA) übersetzt - fertige crRNA liefert der Cas9 die Erkennungssequenz an der das Schneidemolekül die DNA durchtrennen soll - PAM („proto-spacer adjacent motif“) ist ein drei Buchstaben-langer Abschnitt - zwei Guanin und eine beliebige Base - neben der Erkennungssequenz - Cas9 braucht also sowohl die Erkennungssequenz als auch ein PAM, damit es DNA schneiden kann. Da das Erbgut des Bakteriums selbst keine PAMs besitzt, ist es vor der Zerstörung durch das eigene Abwehrsystem geschützt. Max Planck-Gesellschaft/ Art for Science Humangenetik, Gökhan Yigit © UMG CRISPR/Cas9 Systems - Nuclease: Cas9 (CRISPR-associated protein) - Erkennung der Zielsequenz durch „guideRNA“; - separates RNA-Molekül von 20bp - Kombination der bakteriellen crRNA+tracrRNA in RNA-Molekül - komplementär zu Ziel-DNA - wichtig: PAM-Motiv („NGG“) muss in der Ziel-DNA-Sequenz vorhanden sein pigurdesign/www.transgen.de/ Humangenetik, Gökhan Yigit © UMG Vorteile des CRISPR/Cas9 Systems - Erkennung der Zielsequenz durch „guideRNA“; - schnell und günstig zu synthetisieren - Multiplexing - Einführen von mehreren Veränderungen in einer Zelle Addgene Humangenetik, Gökhan Yigit © UMG Anwendungsmöglichkeiten für CRISPR/Cas Adli, Nat. Commun., 2018 Humangenetik, Gökhan Yigit © UMG Voraussetzungen DNA-Bindedomäne Nuklease Reparaturprozesse (Donor-DNA template) Humangenetik, Gökhan Yigit © UMG Reparatur von DNA-Doppelstrang-Brüchen Hsu et al., Cell, 2014 - fehleranfällig - präzise - schnell und unabhängig vom Zellzyklus - abhängig von einem zur Reparaturstelle homologen Bereich (Schwester-Chromatid) Humangenetik, Gökhan Yigit © UMG Voraussetzungen DNA-Bindedomäne Nuklease Reparaturprozesse (Donor-DNA template) Humangenetik, Gökhan Yigit © UMG Reparatur von DNA-Doppelstrang-Brüchen Hsu et al., Cell, 2014 knock-out Korrektur Humangenetik, Gökhan Yigit © UMG Reparatur von DNA-Doppelstrang-Brüchen Homology directed repair (HDR) - „template“ zum Ersetzen und zur Reparatur notwendig - Einzelstrang-DNA - Doppelstrang-DNA - Doppelstrang-Plasmid-DNA - PAM-Motiv fehlt häufig im homologen template, um das erneute Schneiden der Cas9 nach Rekombination zu verhindern - Effizienz der HDR is im Allgemeinen gering (T) - Beta-Thalassämie (HBB) Humangenetik, Gökhan Yigit © UMG Anwendungsmöglichkeit Humangenetik, Gökhan Yigit © UMG Anwendungsmöglichkeiten für CRISPR/Cas Genomeditierung als Behandlungstrategie – Duchenne Muskeldystrophie - neuromuskuläre Erkrankung mit progredientem Muskelschwund - aufgrund der Herz- und Atemschwäche eine stark eingeschränkte Lebenserwartung von 3-4 Lebensjahrzehnten - loss-of-function Mutationen im Dystrophin-Gen (DMD) Lim et al., Drug Des Devel Ther, 2017 Duchenne Becker Muskeldystrophie Muskeldystrophie Humangenetik, Gökhan Yigit © UMG Anwendungsmöglichkeiten für CRISPR/Cas Genomeditierung als Behandlungstrategie – Duchenne Muskeldystrophie Leonela Amoasii et al., Science, 2018 Untersuchungen in einem Hundemodell für DMD - Gentransfer der CRISPR/Cas-Komponenten mittels Adeno-assozierten Viren (AAV) Humangenetik, Gökhan Yigit © UMG Probleme/offene Fragen unter anderem: - Entwicklung von spezifischen Transfersystemen - Wie erreicht man spezifisch die Zielzellen (neuronale Zellen) - Wie werden die einzelnen Komponenten sicher in die Zielzellen gebracht? (Toxizität/Immunogenität) - Multifaktorielle/komplexe Erkrankungen? - Spezifität und Präzision der Genomeditierung - Gibt es off-target Effekte? Homologe Gene/Regionen? - Adäquate Genexpression? - Ethische Fragestellungen : Genomeditierung nur in klinisch relevanten Körperzellen oder in der Keimbahn („Designerbabys“)? Humangenetik, Gökhan Yigit © UMG  Vielen Dank! Humangenetik, Gökhan Yigit © UMG