Einführung in Molekulare Genetik - Genomeditierung

Einführung in die Genomeditierung

• Genomeditierung: Molekulargenetische Techniken, Methoden und Verfahren, um gezielt Veränderungen im Erbgut einzuführen
• Ziele: „knock-out“; Ausschalten eines Gens/mehrerer Gene, „knock-in“; Einbringen eines Gens (Cisgen/Transgen), Aktivierung/Repression endogener Gene, gezielte Veränderungen einzelner Basen (Punktmutationen)

Anwendungsbereiche

• Entwicklung von Arzneistoffen/Tiermodellen
• Gentherapie
• Grüne Gentechnik (Pflanzen)
• Genetische Erkrankungen

Entwicklung der Genomeditierung

• Zinkfinger-Nukleasen (1990er)
• TALEN (Transcription activator-like effector nucleases)
• CRISPR/Cas-System (2014)

Voraussetzungen

• DNA-Bindedomäne
• Nuklease
• Reparaturprozesse (Donor-DNA template)

CRISPR/Cas9 System

• Clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)
• Cas9 (CRISPR-associated protein)
• guideRNA
• PAM-Motiv (NGG)

Vorteile des CRISPR/Cas9 Systems

• Schnelle und kostengünstige Synthese
• Multiplexing (Einführen von mehreren Veränderungen in einer Zelle)

Anwendungsmöglichkeiten für CRISPR/Cas

• Reparatur von DNA-Doppelstrang-Brüchen
• Gentherapie (z.B. Duchenne Muskeldystrophie)
• Grüne Gentechnik (Pflanzen)

Probleme/offene Fragen

• Entwicklung von spezifischen Transfersystemen
• Multifaktorielle/komplexe Erkrankungen
• Spezifität und Präzision der Genomeditierung
• Off-target Effekte
• Ethische Fragestellungen

Einführung in die Genomeditierung

• Genomeditierung: molekulargenetische Techniken, Methoden und Verfahren, um gezielt Veränderungen im Erbgut einzuführen
• Ziele: "knock-out" (Ausschalten eines Gens/mehrerer Gen), "knock-in" (Einbringen eines Gens), Aktivierung/Repression endogener Gene, gezielte Veränderungen einzelner Basen (Punktmutationen)

Anwendungsbereiche

• Entwicklung von Arzneistoffen/Tiermodellen
• "Gentherapie" (zelluläre Modellsysteme)
• "Grüne Gentechnik" (Pflanzen)
• Genetische Erkrankungen (z.B. Duchenne Muskeldystrophie)

Werkzeuge

• Zinkfinger-Nukleasen (ZFN)
  • entwickelt in den 1990er Jahren
  • bestehen aus zwei Untereinheiten: Fok I-Endonuklease-Domäne und 3-6 Zinkfinger-repeats
  • spezifität kann durch den Austausch der ZF-repeats verändert werden
• TALEN (Transcription activator-like effector nucleases)
  • bestehen aus zwei Untereinheiten: Fok I-Endonuklease-Domäne und Erkennungsdomäne basiert auf dem TAL-Effektor-Protein des Bakteriums Xanthomonas spp.
  • arbeiten als Dimer
• CRISPR/Cas-System
  • besteht aus zwei Komponenten: Cas9-Nuklease und guideRNA
  • ermöglicht die gezielte Veränderung von DNA-Sequenzen

CRISPR/Cas-System

• clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)
• Teil eines bakteriellen "Immunsystems" zur Abwehr von Viren/Phagen
• Cas9-Nuklease: schneidet die DNA an einer spezifischen Stelle
• guideRNA: erkennt die Zielsequenz und aktiviert die Cas9-Nuklease
• PAM-Motiv (proto-spacer adjacent motif) ist erforderlich für die Cas9-Nuklease

Vorteile des CRISPR/Cas-Systems

• schnell und günstig zu synthetisieren
• ermöglicht Multiplexing (Einführen von mehreren Veränderungen in einer Zelle)

Anwendungsmöglichkeiten für CRISPR/Cas

• Reparatur von DNA-Doppelstrang-Brüchen
• Gentherapie (z.B. Duchenne Muskeldystrophie)
• "Grüne Gentechnik" (Pflanzen)

Probleme/offene Fragen

• Entwicklung von spezifischen Transfersystemen
• Multifaktorielle/komplexe Erkrankungen
• Spezifität und Präzision der Genomeditierung
• Ethische Fragestellungen: Genomeditierung nur in klinisch relevanten Körperzellen oder in der Keimbahn