Clase 3 - Biología Molecular - Universidad Norbert Wiener

¡Bienvenidos! Métodos Moleculares Semana Nº 3 Inmunología Clínica Mg. César Champa Guevara EAP/Tecnología Médica Laboratorio Clínico y Anatomía Patológica 1. Conectándonos : Nuestros saberes previos Los ácidos nucleicos son biomoléculas gr...

¡Bienvenidos! Métodos Moleculares Semana Nº 3 Inmunología Clínica Mg. César Champa Guevara EAP/Tecnología Médica Laboratorio Clínico y Anatomía Patológica 1. Conectándonos : Nuestros saberes previos Los ácidos nucleicos son biomoléculas grandes que cumplen funciones esenciales en todas las células y virus. Una función importante de los ácidos nucleicos implica el almacenamiento y la expresión de información genómica. El ácido desoxirribonucleico, o ADN, codifica la información que las células necesitan para producir proteínas. Un tipo relacionado de ácidos nucleicos, denominado ácido ribonucleico (ARN) se presenta en diferentes formas moleculares que cumplen funciones celulares múltiples, que incluyen la síntesis proteica. Atentos!!!! Visualizaremos el video, para luego responder las preguntas de tal forma que todos puedan tener los conceptos claros sobre los Ácidos Nucleicos. 2. Logro de la sesión LOGRO DE LA SESIÓN: Al finalizar la sesión los estudiantes podrán conocer las principales Técnicas Moleculares y relacionarlas para realizar diagnóstico en el laboratorio e investigación. 3. Desarrollo del tema DEFINICION El concepto de “diagnóstico molecular” es un término amplio que incluye técnicas de biología molecular en beneficio de la salud humana, detectando y/o cuantificando secuencias genéticas específicas de ácido desoxirribonucleico (ADN), ácido ribonucleico (ARN) o proteínas. Inicialmente, el concepto de “Biología Molecular” se aplicó a los trabajos realizados sobre el ADN y se consideraba materia solo académica y de investigación.  Diagnóstico Molecular Proteómica Genómica Maldi TOF PCR RT-PCR q-PCR FISH Microarray  Un poquito de historia JF Meishner descubre ADN 1869 Watson, Crick, Franklin, estructura ADN 1953 Edwin Southern Southern Blot 1973 Kari Mullins, perfecciona la PCR 1983 Higuchi et Al, qPCR 1993 Preguntas al Laboratorio Paciente tiene o no una infección ¿Cuál es el agente causal? TRATAMIENTO EMPÍRICO  Resistencia antimicrobiana ¿Con qué tratarlo?  Efectos colaterales  Gasto innecesario Preguntas al Laboratorio Paciente tiene o no una infección Técnicas Moleculares TRATAMIENTO ADECUADO ¿Cuál es el agente causal? en menor tiempo  ¿Con qué tratarlo? - Rápidas Alta sensibilidad - PRUEBA CORRECTAy especificidad PACIENTE CORRECTO MOMENTO CORRECTO - Alto costo -Validación y control de calidad Biología Molecular. Aplicaciones.  Identificación del agente causal de la infección (virus, bacteria, parásito, hongo) Microorganismos no cultivables (HPV, HBV) Microorganismos fastidiosos, crecimiento lento (M. tuberculosis, Legionella) Microorganismos altamente infecciosos de cultivo de alto riesgo Microorganismos presentes en muy baja cantidad en la muestra (humor vítreo, muestras forenses) Monitoreo de carga viral (pronóstico y respuesta al tratamiento CMV, HIV, HBV, HCV)  Genotipificación de agentes antigénicamente similares (tipos de HPV)  Determinación de genes de resistencia (mecA, KPC) o suceptibilidad a drogas (resistencia a ART)  Epidemiología molecular OBTENCION DEL MATERIAL GENÉTICO (ADN ó ARN) DE MUESTRAS BIOLÓGICAS Proceso Manual o Automatizado MagnaPure 96 (Roche) Diagnóstico Molecular en enfermedades infecciosas. AMPLIFICACION DEL TARGET DE ADN : Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR / RT-PCR)  Amplificación exponencial Diagnóstico Molecular en enfermedades infecciosas. DETECCION DEL PRODUCTO AMPLIFICADO PCR PUNTO FINAL PCR EN TIEMPO REAL Diagnóstico Molecular en enfermedades infecciosas. Procesos de extracción y amplificación automatizados. Ejemplos. COBAS 4800 FILMARRAY - Cargas virales de HCV, HBV y HIV. Detección de más de 20 patógenos - Detección cualitativa de HPV, C. trachomatis y N. simultáneamente. gonorroheae COBAS S201 Testeo de ácidos nucleicos de HCV, HBV y HIV en donantes de sangre. Diagnóstico Molecular en enfermedades infecciosas. Ej. Detección de Cualitativa CMV Único target Semi - Ej. Carga viral de cuantitativa CMV Detección mediante PCR EN TIEMPO REAL Ej. Detección e identificación HSV1/HSV2 Multiplex Ej. Paneles Moleculares Métodos diagnósticos rápidos: PCRs multiplex-Paneles Técnicas más comunes para el diagnóstico molecular FISH: Fluorescent In Situ Hybridization De gran utilidad en estudios citogenéticos. Detección de genes anómalos. Detección/diagnóstico de enfermedades congénitas. Detección/diagnóstico de cáncer. Mucho procedimiento manual Bajo grado de automatización Buena sensibilidad y especificidad Requiere de personal entrenado Técnicas más comunes para el diagnóstico molecular Microarray: Técnica que permite la hibridación de un genoma incógnita con sondas fijas en un dispositivo. Se fundamenta en la complementariedad del ADN ADN. Enfermedades congénitas. Mutaciones Epidemiología Filogenética  Técnicas más comunes para el diagnóstico molecular PCR “PCR is a technique that allows chemists to easily, and inexpensively, replicate as much precise DNA as they need”. La PCR es un proceso biosintético in vitro que simula los procesos naturales de la replicación de ácidos nucleicos mediante el control de variables básicas como tiempo, temperatura y adición de reactivos. Grado de automatización variable En ocasiones requiere de personal entrenado Infraestructura y equipamiento La reacción  Técnicas más comunes para el diagnóstico molecular Proteómica: Biotipificación de proteínas de microorganismos. MALDI-Toff, análisis de riboproteinas Identificación bacteriana rápida. Para laboratorios de alto volumen. Permite la identificación de variados microorganismos Aplicaciones de Biología Molecular Algunos ejemplos Los avances en medicina del Cáncer cáncer se han logrado en gran parte gracias a BM Pronóstico: Mediante detección de mutaciones (PCR/MICRO) Oncogenes (met, ret) Genes de regulación (Rb, p53) Genes care giver (BRCA 1, XP) Diagnóstico: Cáncer cérvix, genotipificación de HPV detección de genotipos de alto riesgo (PCR/LIPA/CH)  Aplicaciones de Biología Molecular Algunos ejemplos Cáncer Seguimiento: Transcripción de oncogenes (ARNm) PCR/FISH Producción de proteínas (proteómica) Tratamiento: Cáncer de mama, tumores ErbB positivos (FISH/PCR).  Cáncer En la actualidad se cuentan con diferentes kit para diferentes aplicaciones con diferente grado de automatización, principalmente: CA de mama CA de cuello de útero Muchas de estas tecnologías no están disponibles en la región. Varias relacionadas con casas farmacéuticas  ¿QUÉ ES LA PCR? Es una técnica de biología molecular desarrollada en 1986 por Kary Mullis El objetivo es obtener un gran número de copias de un fragmento de ADN particular, partiendo de un mínimo. Esta técnica sirve para amplificar un fragmento de ADN; su utilidad es que tras la amplificación resulta mucho más fácil identificar con una muy alta probabilidad, virus o bacterias causantes de una enfermedad, identificar personas (cadáveres) o hacer investigación científica sobre el ADN amplificado.  COMPONENTES DE LA PCR  Iniciadores: son moléculas de ADN Equipos Reactivos de pequeño tamaño,cada uno son  Termociclador: el aparato complementarios a una de las dos que va a mantener la  ADN que contenga la región(es) que se desea amplificar hebras del ADN, son secuencias temperatura necesaria en  Buffer o solución amortiguadora : cortas, de entre seis y cuarenta cada una de las etapas mantiene el pH adecuado para el nucleótidos, permiten que la que conforman un ciclo.  Vortex funcionamiento de el ADN polimerasa inicie la reacción.  Micropipetas polimerasa.  ADN polimerasa o mezcla de  Microcentrífuga  Cloruro de Magnesio (MgCl2): lo distintas polimerasas con necesita la Taq para actuar, es un temperatura óptima alrededor de cofactor. 70 °C (la más común es la  Desoxirribonucleótidos trifosfato polimerasa Taq) (dNTPs):son los nucleótidos  Agua destilada necesarios para formar o producir  Iones monovalentes, como el las copias de ADN durante los potasio. 2018]. diferentes ciclos de la PCR.  ETAPAS DE LA PCR DESNATURALIZACIÓN: en esta etapa HIBRIDACIÓN: en esta etapa participan los las cadenas de ADN son calentadas a primers, los cuales son secuencias de 95 C° durante un tiempo promedio de oligonucleótidos que delimitan la secuencia 20 a 30 segundos, con el objetivo de blanco que se quiere amplificar. En la etapa de separar ambas cadenas. Si la cadena hibridación los primers se alínean al extremo 3’ de ADN contiene gran cantidad de de la cadena molde, para lo cual se necesitan uniones g-c será necesario mayor dos secuencias diferentes, una denominada tiempo, ya que la unión de éstas se forward, o sentido, y otra reverse, o antisentido. hace mediante tres enlaces, uno más Para que esto suceda es necesario que el que las bases a-t. Al final de esta etapa termociclador alcance una temperatura entre 50- tendremos las cadenas separadas, las 60 C°, generalmente se necesitan 30 segundos cuales servirán como molde. en este ciclo. EXTENSIÓN: en esta etapa se necesita una enzima con la función de ADN polimerasa, la cual se encargará de la catálisis de la reacción, sintetizando nuevas cadenas de Los dntp’s son las bases nitrogenadas que ADN a partir de una cadena molde. La normalmente se utilizan a una enzima más usada es la Taq ADN concentración entre 0.2 a 1.0 mM, para polimerasa, con capacidad de soportar obtener un producto de amplificación de 1 temperaturasmuy altas. Provienede una 000 pb se requiere de un minuto. bacteria termófila llamada Thermophilus Al final de cada ciclo se habrán duplicado aquaticus. En la etapa de extensión la Taq dos cadenas de ADN a partir de una, y de polimerasa actúa sobre el complejo esta forma la replicación de una cadena templado-primers a una temperatura óptima blanco por cada ciclo se realiza de manera de 72 C°, y a una velocidad muy rápida exponencial y logarítmica. agrega los desoxirribonucleótidos libres (dntp’s) complementarios, creando así las cadenas completas de ADN. ELONGACIÓN FINAL: Se lleva a cabo a una temperatura de 70-74 °C durante 5-15 minutos tras el último ciclo de PCR. Con ella se asegura que cualquier ADN de cadena simple restante sea totalmente ampliado. CONSERVACIÓN: Este paso que se lleva a cabo a 4-15 °C durante un tiempo indefinido para conservar la reacción a corto plazo. NÚMERO DE CICLOS Este número de ciclos depende de la cantidad de ADN que existe en la muestra una vez que el resto de factores han sido optimizados (normalmente de manera empírica). Hay que tener en cuenta que la reacción está producida por una enzima que sufre el efecto meseta que describe la atenuación en la tasa de la acumulación del producto. Después de un número determinado de ciclos la amplificación deja producirse de manera exponencial y llega a una fase estacionaria. Generalmente cuando el efecto meseta se produce, la cantidad de ADN sintetizado es suficiente para su posterior utilización. CONTAMINACIÓN EN LA PCR La Reacción en Cadena de la Polimerasa es una técnica muy sensible, por lo que es de gran importancia evitar contaminaciones, ya que es posible que el ADN no deseado (aunque se encuentre en una cantidad muy pequeña) se amplifique y obtengamos un resultado que no es real. Vemos que una de sus mayores ventajas de la técnica, se convierte a la vez en el principal inconveniente. Existen una serie de normas que ayudan a evitar las contaminaciones. En el caso de trabajar con muestras de ARN las precauciones se deben extremar al máximo: Realización de Uso de controles de Lugar físico Utilización de Uso de guantes blanco (se añade instrumental exclusivo para reactivos y por el agua en lugar de exclusivo para realizar la PCR tubos estériles manipulador ADN, no debe la PCR existir amplificación).  TIPOS DE PCR PCR IN SITU: La PCR in situ consiste en una PCR EN TIEMPO REAL O PCR reacción de PCR en secciones histológicas o CUANTITATIVA (QPCR): Reacción células, donde los productos generados pueden de PCR cuya principal característica visualizarse en el sitio de amplificación. En la es que permite cuantificar la cantidad técnica de PCR in situ se realiza una primera de ADN o ARN presentes en la amplificación de ADN blanco y luego detección muestra original, o para identificar con mediante hibridación in situ convencional con una muy alta probabilidad, muestras sondas de ADN/ARN. De esta manera pueden de ADN específicas a partir de su detectarse cantidades pequeñísimas de genoma. temperatura de fusión.Se puede Esta tecnología es de gran alcance en la capacidad dividir en las técnicas basadas en de amplificar específicamente una población de fluorocromos no específicos secuencias de menor representación.  PCR ANIDADA: Técnica muy sensible de PCR en la que el producto de una amplificación es PCR MÚLTIPLE: PCR en la cual se amplifica utilizado como molde para realizar una segunda simultáneamente más de una secuencia. amplificación con cebadores que se ubican Para ello, se combinan dos o más pares de dentro de la primera secuencia amplificada, es cebadores en un mismo tubo, junto con el decir, cuando tenemos el primer amplicón se resto de los reactivos de la reacción en pueden unir los cebadores y se hace de nuevo cantidades suficientes, para amplificar una amplificación dentro del amplicón inicial. simultáneamente varios segmentos de Este tipo de PCR tiene la ventaja de brindar alta ADN. Ventajas: información sobre varios sensibilidad y especificidad. La especificidad locus en una sola reacción, menor cantidad aumenta porque como es amplificación de un de molde para el análisis, menor cantidad de amplicón obtenido previamente, los cebadores reactivos, rápida construcción de bases de sólo van a hibridar en un sitio dentro de la datos. Desventajas: para llevarla a cabo molécula y el resultado será una única banda. adecuadamente y sin errores, se requiere de Así, evitamos posibles hibridaciones una cuidadosa optimización del proceso. inespecíficas de los cebadores. La desventaja de esta técnica es que no nos permite cuantificar la muestra.  Fundamentos de la qPCR | Reactivos y Etapas ¿Qué es una PCR? Es una técnica de biología molecular desarrollada en 1986. Su objetivo es obtener un gran número de copias de un fragmento de ADN diana, partiendo de un número mínimo de copias (en teoría, con 1 copia sería suficiente para amplificar). Este alto número de copias obtenidos permite identificar este ADN y ser utilizado, entre otros fines, como prueba diagnóstica. Reactivos ADN diana Primers o cebadores dNTPs (nucleótidos) Polimerasa (enzima) Etapas 1. Desnaturalización 2. Hibidación 3. Extensión  Fundamentos de la qPCR | Detección en tiempo real ¿Qué diferencia hay entre una qPCR y una PCR convencional? La PCR cuantitativa o PCR en tiempo real (qPCR) es una variante de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) utilizada para amplificar y simultáneamente cuantificar de forma absoluta el producto de la amplificación de ADN. Para ello emplea los mismos reactivos y etapas que una PCR convencional pero, a dicha mezcla se le adic iona una sustancia marcada con un fluoróforo. Esta sustancia permite medir la tasa de generación de los amplicones en un termociclador provisto de sensores de fluorescencia. Consideraciones generales Implementación/elección de la técnica Establecer necesidades: Tiempo de respuesta. Aumentar capacidad diagnóstica. Manejo efectivo de pacientes. Infraestructura física de los laboratorios: Se cuenta con todo el recurso físico necesario? Consideraciones generales La muestra Sensibilidad deseada del ensayo Volumen requerido de muestra para procesar Número de pruebas diferentes a realizar sobre la misma muestra procesada Estabilidad, conservación Tiempo y forma de recolección Consideraciones generales Selección de la metodología (s) grado de automatización Tiempo de respuesta. Disponibilidad de personal. Grado de entrenamiento/conocimiento. Necesidades del entorno Consideraciones generales Interpretación de resultados Todos los resultados obtenidos deben ser analizados considerando diferentes variables:  Calidad de la muestra.  Cuadro/historia clínica.  Tiempo de evolución de la patología.  Coinfección Comunicación de los resultados  Debe ser acorde con las técnicas empleadas y los requerimientos de los usuarios Consideraciones generales Análisis de costo-beneficio:  Debe ser un análisis integral de todas las aristas.  Considerar la visión:  Clínica.  Laboratorio.  Financiera.  Epidemiológica.  Humana.  En resumen Las técnicas de molecular son versátiles y permiten obtener resultados adecuados y fidedignos en tiempo récord. Permiten aumentar la capacidad y oferta diagnóstica. Existe una variedad importante de plataformas que se adecuan a la realidad y necesidad individuales de los laboratorios Para finalizar No olvidemos que las técnicas moleculares se aplican más allá del diagnóstico clínico. Son de utilidad en Industria y en Veterinaria. Es un campo de constante crecimiento y en un futuro cercano permitirá el diagnóstico de precisión y la medicina personalizada Next Genertation Sequencing. El diagnóstico molecular complementa las metodologías actuales de diagnóstico 4. Aplicación  Test de saberes aprendidos semana 3 en clase. 5 preguntas. 10 minutos para resolver. 5. Cierre Cierre: El docente comprueba el cumplimiento del logro propuesto en la sesión. Termina la sesión haciendo un resumen muy breve de la clase, incorporando los comentarios e inquietudes de los estudiantes enfatizando los logros que se han conseguido. Puede usar una dinámica participativa o herramienta digital. Ejemplos de preguntas de reflexión: *(Esta información es referencial para el diseño del tema) ¿Qué hemos aprendido? ¿En qué ámbitos de nuestra vida diaria aplicamos lo aprendido? ¿Cómo podemos mejorar nuestro aprendizaje? 6. Referencias bibliográficas Ejemplos de referencias bibliográficas  Bolívar AM, Rojas A, García LP. RCP y RCP-Múltiple : parámetros críticos y protocolo de estandarización (RCP and RCP-Multiplex:critical parameters and standardization protocol). Avan Biomed. 2014;3(1):25-33  Conca N. "Diagnóstico etiológico en meningitis y encefalitis por técnicas de biología molecular". Rev. chil. pediatr. 2016; 87(1): 24-30.  Jiménez EA, Gobernado I, Sánchez HA. Secuenciación de genoma completo: Un salto cualitativo en los estudios genéticos. Rev Neurol. 2012;54(11):692-8.  Lilia M, Mesa F. Características, ventajas y desventajas de la hibridización in situ para la identificación de agentes patógenos. Rev Biomédica. 2013;63-78.  Martínez RR. Empleo de la técnica hibridación in situ fluorescente para visualizar microorganismos. Salud UIS. 2011;43(3):307-16.