Preparación de Materiales y Reactivos PDF

UD5. Preparación de Materiales y Reactivos Disoluciones/Diluciones Módulo de Cultivos Celulares Curso de Especialista en Cultivos Celulares IES Leonardo Da Vinci Prof: Verónica Rivero Hernández 1 La concentración de las disoluciones La concentración de una...

UD5. Preparación de Materiales y Reactivos Disoluciones/Diluciones Módulo de Cultivos Celulares Curso de Especialista en Cultivos Celulares IES Leonardo Da Vinci Prof: Verónica Rivero Hernández 1 La concentración de las disoluciones La concentración de una disolución es la cantidad de soluto que hay en una determinada cantidad de disolución o de disolvente. La concentración de una disolución se define como la proporción existente entre:  soluto / disolvente  soluto / disolución La concentración determina muchas de las características de las disoluciones y es imprescindible saber expresarla con corrección. Formas de expresar la concentración Existen distintas formas de expresar la concentración:  PORCENTAJE EN PESO (% p/p): Gramos de soluto contenidos en 100 gramos de disolución. m soluto(g) % peso/peso = · 100 m disolución(g) (s + dte) Ejemplo: ¿Cuál es el % p/p de perclorato amónico (NH4ClO4) en una disolución que contiene 11’7 g de dicha sal en 25 g de agua? Los gramos de disolución son= 11,7+ 25= 36,7g Aplicando la fórmula Con equivalencias  PORCENTAJE ENVOLUMEN (% v/v) Son los ml de soluto contenidos en 100 ml de disolución. v soluto(ml) %v/v = · 100 v disolución (ml) (s+dte) Ejemplo: Determinar el % v/v de una disolución obtenida disolviendo 12 ml de alcohol metílico en agua hasta un volumen final de 80 ml.  PORCENTAJE PESO -VOLUMEN (% p/v) Son los g de soluto que hay en 100 ml de disolución. m soluto(g) % p/v = · 100 v disolución (ml) Ejemplo: Calcular el % en p/v de una disolución que se ha obtenido disolviendo 28 gr de glucosa C6H12O6 en agua hasta un volumen final de 250 ml. % p/v = _ 28g_ · 100 = 11’2 % 250 ml La relación peso/volumen es la expresión más utilizada en el laboratorio  PARTES POR MILLÓN (ppm): Indica el número de g de soluto por cada 1 000 000 de gramos de disolución. Relación 1/106 independientemente de las unidades m soluto(g) ppm = · 106 Masa disolución (g) Ejemplo: ¿A cuántas partes por millón equivale una concentración de Fe del 0’0005 por 100? 1. ¿Cuál es el % p/v de NaCl en una solución que contiene 10 g de soluto en 120 ml de solución? R= 8’33% 2. Calcula la cantidad de gramos de MgCl2 que se requiere para preparar 150 ml de disolución acuosa de MgCl2 al 12%(p/v) R= 18 g 3. ¿Cuál es el % v/v de una disolución que contiene 5 ml de HCL en 100 ml de agua? R= 4’8% 4. ¿ Cuántos mililitros de ácido acético se necesitan para preparar 300ml de disolución al 20% v/v? R= 60 ml 5. Se desea preparar 50ml de solución de NaCl, cuya concentración sea 5% p/v ¿Qué cantidad de sal (soluto) debe medirse en una balanza?. R= 2’5 g de Na 6. Se disuelven 28 ml de alcohol en 120 ml de agua. Calcular la concentración % v/v de la solución. R= 23’3% 7. Si a 2’5 g de sal común se la añade agua hasta completar 125 ml de solución, ¿cuál será la concentración % p/v de la solución R= 2% p/v 8. Se requieren 250ml de solución de alcohol cuya concentración sea al 30% v/v, ¿qué volumen de alcoho (soluto) debe medirse? R= 75mL 9. ¿Qué cantidad de soluto se necesitará para preparar 90g de solución de KMnO4 al 40% en p/p. R=36g. 10. ¿Qué cantidad de solvente se necesita para preparar 180g de una solución al 15% en p/p? R=153g 11. ¿ Qué cantidad de ácido clorhídrico al 70% en v/v se necesitará para preparar 200ml de una solución para limpiar pocetas? R= 140ml 12. ¿Qué cantidad de alcohol se tendrá que añadir al agua para preparar 500ml de solución al 5% en v/v? R= 25ml  MOLARIDAD (moles / litro) Se define como el nº de moles de soluto que hay en 1 litro de disolución n (moles de soluto) M = ------------------------------------ V disolución (l) El nº de moles de una sustancia (n): nº de gramos de la sustancia dividida por su peso molecular m (g) n = -------------- Pm (g/mol) 1 mol de una sustancia se define como el peso molecular de la sustancia expresado en gramos Para expresar la molaridad hemos de poder calcular los moles y su equivalente en gramos, puesto que serán estos los que nosotros podremos pesar. Para ello: Conocemos el peso atómico de un elemento mirándolo en la TABLA PERIÓDICA. P.e. si se trata de un elemento Calcio (Ca) al ir a la tabla veremos que su peso atómico es de 40 → Pm Ca = 40 g/mol En el caso de compuestos, necesitamos conocer su fórmula química y su peso molecular será la suma de cada uno de los componentes multiplicado por el subíndice. carbonato cálcico→ fórmula CaCO3 Pm C= 12 El peso molecular del compuesto será: Pm O = 16 12 + (3 · 16) + 40 = 100 g/mol Pm Ca = 40 Ejemplo: Calcula la molaridad de una disolución formada por 450 g de cloruro de sodio en 500 ml de disolución. n (moles de soluto) Pm Cl = 35’54 g/mol M = ------------------------------------ Pm Na = 23 g/mol V disolución (l) m (g) n = ----------------- Pm (g/mol) Respuesta: Peso molecular del compuesto: 35’54 +23 = 58’54 g/mol n (número de moles) : m (g) n = ----------------- Pm (g/mol) n = 450g NaCl / 58’54 g/mol Na Cl = 7’69 moles de NaCl n (moles de soluto) M (molaridad): M = ------------------------------------ V disolución (l) M = 7’69 moles NaCl / 0’5 l de dis = 15’37 molar  siendo el volumen de la disolución resultante de 2 litros.  EJERCICIO RESUELTO siendo el volumen de la disolución resultante de 2 litros. Ejercicio 13: Supongamos que se nos encarga preparar 200ml de una disolución de C2H6O (etanol) 2’06M (Pm etanol = 46g/mol). Esto significa que cada litro de disolución que preparemos deberá contener 2’06 moles de etanol. Calcula los gramos de etanol que contendrá esa disolución. Aplicando la fórmula de la Molaridad:  EJERCICIO RESUELTO EJEMPLO Supongamos que se nos encarga preparar 200ml de una disolución de etanol 2’06M (Pm etanol = 46g/mol). Esto significa que cada litro de disolución que preparemos deberá contener 2,06 moles de etanol. Calcula los gramos de etanol que contendrá esa disolución. 1. Aplicando la fórmula de la molaridad: Milimolar, micromolar, nanomolar, picomolar Milimolar= milimoles/V disolución en litros Milimoles= miligramos/Pm Micromolar= micromoles/V disolución en litros Micromoles= microgramos/Pm Nanomolar= nanomoles/V disolución en litros nanomoles= nanogramos/Pm 1M= 103mM= 106 µM= 109 nM= 1012pM  NORMALIDAD Se define como el nº de equivalentes-gramo de soluto existentes en 1 litro de disolución: Nº equivalentes-gramo (soluto) N= v disolución (litros) Los equivalentes están relacionados con su capacidad de combinarse y por tanto con la valencia (nº de hidrógenos con los que se puede combinar) Peso de la sustancia en gramos Nº de equivalentes-gramo = Peso equivalente Peso molecular (g/mol) Peso equivalente = Valencia https://www.youtube.com/watch?v=bOXQves_2_g  Valencia Nº de H (hidrógenos) o de OH (grupos hidroxilo) de la molécula puestos en juego. La valencia de un ácido es el nº de H que se producen al disociarse:  H2SO4 es V= 2  HCl V= 1  H3PO4 esV= 3. La valencia de las bases es el nº de OH de su molécula:  Fe(OH)2 V=2  Fe(OH)3 V= 3. Para sales, el peso equivalente es el cociente entre el peso molecular y el producto de la valencia del catión por su subíndice, p.e.: Na2SO4 , la valencia del sodio es +1 y el subíndice es 2, multiplicaremos por tanto por 2. Relación entre Molaridad y Normalidad nº equivalentes de soluto g soluto / peso equivalente N = --------------------------------- = ----------------------------------= Volumen de disolución (L) Volumen disolución (L) g soluto /pm/valencia (g de soluto x valencia )/ Pm = ------------------------------- = ------------------------------------- = volumen de disolución (L) volumen de disolución (L) g de soluto/Pm x valencia nº moles x valencia = -----------------------------------= ------------------------- - volumen disol (L) volumen disol (L) g soluto/ Pm N = ----------------- x Valencia N= M ·Valencia V disol (L) Ejemplo 3 : Calcular la normalidad y la molaridad de 50 gramos de Na2CO3 en 100 ml de disolución:  EJERCICIO RESUELTO Ejemplo 3 : Calcular la normalidad y la molaridad de 50 gramos de Na2CO3 en 100 ml de disolución: Normalidad (N):  Peso molecular del Na2CO3 = 106 g/mol  Peso equivalente del Na2CO3 = peso molecular / nº de carga del catión de la sal = = 106 / 2 = 53  nº de Equivalentes en 50 g de Na2CO3 = 50 / 53 = 0’94  N = nº de Equivalentes / litros de disolución = 0’94 / 0’1 = 9’4 N Molaridad (M):  Moles de soluto = masa soluto / peso molecular = 50 / 106 = 0’47 moles  M = moles soluto / litros disolución = 0’47 / 0’1 = 4’7 M (M = N/2 en este caso) N= M xValencia= 4’7 x 2= 9’4 N  MOLALIDAD: Peso del disolvente en kg, no de la disolución Para calcular el peso del disolvente necesitamos introducir el concepto de densidad, que relaciona el peso de un líquido con el volumen. Se expresa en kg/m3 = kg/l o en g/ml =g/cm3 La densidad del agua es de 1 g/ml o 1 kg/l, así en las disoluciones acuosas sabremos el peso del disolvente. Si me dan la densidad de la disolución podré calcular el peso de la disolución y a partir de aquí el peso del disolvente. g de disolución = g soluto + g disolvente Ejemplo resuelto: Calcular la molalidad de una disolución de 95 gramos de ácido nítrico (HNO3) en 2,5 litros de agua. Peso molecular del HNO3 = 63 g / mol Moles de HNO3 = 95 / 63 = 1’51 moles de HNO3 Peso del disolvente: tenemos 2’5 litros de agua → 2’5 kg Molalidad = moles de HNO3 / kg de disolvente = 1’51 moles / 2’5 kg = 0,6 m Calcular los gramos de metanol (CH3OH) en una disolución 15 molal donde el disolvente son 50 gramos de agua. Peso molecular del CH3OH = 32 g / mol Molalidad = 15 = moles de CH3OH / 0’05 Kg de disolvente → moles de CH3OH = 15 · 0’05 = 0’75 mol de CH3OH Moles de CH3OH = 0’75 = masa CH3OH / peso molecular → masa CH3OH = 0,75 · 32 = 24 gramos de CH3OH  Ejemplo resuelto Calcular la molalidad de una disolución de 25 gramos de ácido nítrico (HNO3) en 0,5l de disolución, si la densidad de la solución resultante es de 1,02g/ml. Peso molecular del HNO3 = 63 g / mol Moles de HNO3 = 25 / 63 = 0,397 moles de HNO3 Densidad= 1,92g/ml= gramos disolución/ml disolución= Gramos disolución= 1,92x500 = 960g= Gramos disolución= gramos soluto+ gramos disolvente 960=25g+gramos disolvente Gramos disolvente= 960-25=935g= 0,935kg Molalidad = 0,397 moles de HNO3 / 0’935 Kg de disolvente= 0,42molal  FRACCIÓN MOLAR: La fracción molar es otra forma de medir la concentración y expresa la proporción en que se encuentra una sustancia respecto a los moles totales de la disolución. Ejemplo: Mezcla binaria de 6 moles de etanol y 4 moles de agua da un total de 10 moles. La fracción molar del etanol = 6/10=0’6 La fracción molar del agua = 4/10=0’4 También puede expresarse en %  FRACCIÓN MOLAR: Como el volumen de una disolución depende de la temperatura y de la presión, cuando éstas cambian el volumen también lo hace, lo que afecta a otras formas de expresar la concentración, como por ejemplo la molaridad. En cambio, la fracción molar es independiente de la Temperatura y la presión.  5.3.PREPARACIÓN DE DISOLUCIONES: La preparación de disoluciones debe seguir las siguientes etapas: Preparación del material. 1. Cálculo de las cantidades de soluto y disolvente: para hacerlo tenemos que tener en cuenta el etiquetado 2. del producto donde se especifica la fórmula, la masa molecular, la riqueza y la densidad. Preparación del soluto y del disolvente. 3. Mezcla del soluto en el disolvente: tomamos el vaso de precipitados con el soluto, le añadimos una 4. pequeña cantidad de disolvente y mezclamos con la varilla. Luego vamos incorporando más disolvente. La disolución puede desprender calor, por tanto, no se realizará en material volumétrico de precisión, ya que podría alterar su calibrado de volumen. Enrase: cuando el soluto está bien disuelto, transferimos la disolución a un matraz aforado, cuyo volumen 1. sea el volumen total de la disolución. A temperatura ambiente, vamos añadiendo los últimos ml gota a gota con un cuenta gotas o una pipeta Pasteur. Homogenización: movimientos circulares del matraz o agitador magnético. 2. Envasado y etiquetado: indicar al menos, la cantidad total de disolución, la composición cualitativa y 3. cuantitativa, fecha de elaboración y condiciones de conservación. Algunas disoluciones requieren pasos adicionales: ajuste de pH o esterilización. 4.  Velocidad de disolución Hay varios factores que influyen en la velocidad de disolución: Solubilidad: cuanto más soluble sea el soluto, mayor velocidad de disolución. ⚫ ⚫Tamaño de partícula del sólido: la disolución es más rápida, cuanto mayor sea la superficie de contacto entre soluto y disolvente. A menor tamaño de partícula, mayor velocidad de disolución. Agitación: favorece la velocidad de disolución porque aumenta el contacto soluto- ⚫ disolvente. PREPARACIÓN DE DISOLUCIONES: Si el soluto es SÓLIDO y el disolvente LÍQUIDO: 1. Calculamos las cantidades. 2. Se pesa el soluto y se pasa a un vaso de precipitados. 3. Se recoge lo que haya podido quedar en el vidrio de reloj o vaso de precipitados utilizado para pesar enjuagándolo con una pequeña cantidad del disolvente. 4. Removemos con una varilla de vidrio disolviendo el soluto en 2/3 del disolvente aproximadamente. 5. Trasvasamos a un matraz aforado usando un embudo hasta el inicio del cuello del matraz, quitamos el embudo y completamos con el disolvente necesario hasta la línea de enrase con ayuda de una pipeta Pasteur de plástico. Si fuera necesario aprovechar el disolvente para recoger restos del vaso de precipitado. 6. Agitamos. 7. Guardamos en el recipiente adecuado. 8. Se etiqueta o se rotula, indicando: disolución preparada, concentración y fecha de realización. Ejemplos de preparación de disoluciones Disolución de sólido en líquido Preparamos 100 ml de disolución de NaCl 1M en agua. Seguiremos todos los pasos explicados anteriormente. 2. Cálculo de cantidades de soluto y disolvente.  Si el soluto es LÍQUIDO y el disolvente es LÍQUIDO: En muchas ocasiones tendremos que cambiar la unidad de masa en unidad de volumen, para lo cual se necesita conocer la densidad. Tendremos en cuenta en primer lugar la concentración del reactivo de partida, calcularemos los ml necesarios que deberemos coger para preparar nuestra disolución a la concentración deseada. Se vierte el soluto en un recipiente adecuado (vaso de precipitados) y, de éste, se pipetea el volumen que necesitamos y lo depositamos en un matraz aforado. Añadimos el disolvente, agitamos y continuamos añadiendo hasta enrasar. A continuación, volver a agitar. Finalmente poner en el recipiente adecuado y rotular o etiquetar. Cálculos para preparación de disoluciones cuando el reactivo comercial no tiene un 100% de pureza Riqueza: Llamamos riqueza o pureza de una sustancia a los gramos de la misma que hay en cada 100 gramos de la sustancia impura. La riqueza siempre es igual o inferior de 100% Siempre tendremos que pesar una cantidad mayor de sustancia impura que la cantidad de sustancia pura que necesitemos. La riqueza de la siguiente sustancia es del 50 %, es decir 50% corresponden al compuesto rosa y el resto a impurezas. Si quiero tener 20 g de sustancia ¿cuanto debe pesar? tendré que tomar 40 g así tendré 20g de sustancia y 20 g de impurezas Ejemplos de preparación de disoluciones Disolución de líquido en líquido Preparación de 250ml de disolución 0’25 M de H2SO4 en agua, partiendo de H2SO4 comercial de 96% de riqueza y densidad de 1’84 g/ml. Siempre el ácido sobre el agua Ejercicios preparación de disoluciones 13. Calcula los gramos que hay que tomar de un reactivo comercial de NaCl que posee un 94%p/p necesarios para preparar 100 ml de una disolución de Na Cl 0,2M. Cl=35,5u, Na=23u. Sol: 1,24g de reactivo comercial 14. Indica cómo se prepararía 250ml de una disolución 1M de ácido nítrico, si se dispone de un ácido nítrico comercial de riqueza 25,48% y densidad 1,15g/ml. masa molar 63g/mol. Sol: se toman 53,75ml del reactivo comercial. 15. Calcular el volumen de ácido clorhídrico de densidad 1,083 g/mL y del 52% de riqueza en peso necesario para preparar 5 litros de disolución de concentración 2M. sol= 646,35ml 16. Calcula la MOLARIDAD de una disolución de hidróxido de sodio que se prepara tomando 18,5 g de un reactivo comercial de un 97% de pureza y se disuelve en 500 ml de disolución. Sol: 0,897M 17. Determinar la concentración de una disolución de ácido sulfúrico H2SO4 que contiene 14,7 gramos de dicho ácido en agua, de forma que el volumen de disolución es de 600ml, es de si su densidad es de 1,018 Kg/l. Soluciones: %p/v = 2,45%p/v, g/l= 24,5g/l Sol: M= 0,25M, N= 0,5N, %p/p= 2,406679 %p/p, Ppm = = 24066,79 ppm, Molalidad= 0,2516 m, Fracción molar= 0,0045 o bien 0,45% Cálculo de unas expresiones de concentración a partir de otras 1. Calcula la molaridad, molalidad y fracción molar de una disolución acuosa de cloruro de sodio al 15% p/p y densidad 1,029g/ml. Sol: X=0,05, molalidad 3, molaridad 2,64mol/L Suponemos un volumen cualquiera, con la densidad se calculan los gramos de disolución. Con el %peso se calculan los gramos de soluto Con el volumen supuesto y los gramos de soluto calculados se puede obtener las concentraciones que piden Calcula la molaridad, molalidad y fracción molar, %p/v de una disolución acuosa de cloruro de sodio al 15% p/p y densidad 1,029g/ml. Pm Cl=35,5 g/mol Pm Na= 23g/mol Suponemos: volumen disolución= 100ml Densidad= gramos disolución/ml disolución 1,029 g/ml= gramos disolución/ 100ml => gramos disolución= 1,029 g/mlx 100ml= 102,9 gramos disolución m soluto(g) % peso/peso = · 100 m disolución(g) (s + dte) soluto(g) ⇒Gramos soluto = 15x102,9/100= 15,435 g 15% peso/peso = · 100 ⇒Moles de soluto= 15,435 g/58,5= 0,264moles 102,9 g ⇒Gramos disolvente= gdisolución-gsoluto= 102,9- 15,435= 87,465g ⇒Moles disolvente= 87,465g/18=4,859 moles disolvente  Molaridad= moles soluto/Ldisolución= 0,264moles/0,1= 2,64M Normalidad= Mxv= 2,64x1= 2,64N Molalidad= moles soluto/Kgdisolvente= 0,264/ 0,087,465g= 3,02m %p/v= gsoluto/ml disolución x100= (15,435 g/100ml)x100= 15,4355p/v Fracción molar= moles soluto/ moles soluto+moles disolvente= 0,264/0,264+4,859=0,264/5,123=0,051 Una disolución de HNO3 15M con densidad 1,4g/ml. Calcula el %p/p del ácido, su molalidad, su fracción molar, %p/v, g/l. Pm(H=1, 0=16, N= 14) Pm= 11+3x16+14=63g/mol Suponemos 1 volumen disolución = 100ml= 0,1L= 15M= moles soluto/ 0,1L ⇒moles soluto= 1,5moles soluto= gramos soluto/Pm ⇒Gramos soluto= 1,5x63= 94,5 gramos soluto ⇒Densidad= gramos disolución/ml disolución 1,4g/ml= gramos disolución/100 ml gramos disolución= 1,4x100= 140gramos disolución= 140g disolución= gs oluto+g disolvente G disolvente= 140-94,5= 45,5g disolvente Moles disolvente= 45,5/18=2,528g Calcula los g/l y la molaridad y normalidad de una disolución de ácido sulfúrico H2SO4 cuyo 3,5%p/v. Pm=98g/mol 3,5%p/v => 3,5g soluto moles soluto= 3,5/98= 0,036 moles 100ml disolución g/l= 3,5g/0,1L= 35g/l Molaridad= 0,036 moles/0,1L= 0,36M N=Mxv= 0,36x2= 0,72N OSMOLARIDAD: osmoles/litro de solución La osmolaridad es la forma de calcular el número de partículas totales presentes en una solución, sin importar su naturaleza. Osmol= un mol de partículas osmóticamente activas Para calcular la osmolaridad de una solución compleja, se suman las Osmolaridades de los distintos solutos que la componen. Para determinar la osmolaridad de cada soluto hay que conocer como se comporta la molécula en solución, si se disocia y en cuántas partículas. Calculo de la osmolaridad Solución salina normal (suero fisiológico): 0,9% p/v de cloruro de sodio. NaCl 0.9 g/100 mL. El peso molecular es 58.5 g 0,9g de NaCl en 100 ml Moles de NaCl= 0,9g/ 58,5= 0,0154moles en 100ml Molaridad= 0,0154moles/0,1L= 0,154 Molar => 0,154 moles en 1L Como el NaCl se disocia en dos partículas: NaCl -> Na + + Cl- El número de osmoles es 0,154 x2= 0.308 por litro. Es una solución 0.308 OsM o 308 mOsM por lo tanto es una solución isotónica.  Solución Ringer-‐Lactato: imita la composición del líquido extracelular. Ejemplo: 102 mmol/L NaCl; 28 mmol/L lactato de sodio, 4 mmol/L KCl, y 1,5 mmol/L de CaCl2. (NaCl) 102 mM (NaCl -> Na + + Cl - ) Osmolaridad= 102x2= 204 mosM (Lactato Na) 28 mM (NaLac-> Na + Lac -) Osmolaridad= 28 x2= 56mM (KCl) 4 mM (KCl ->K + + Cl - ) Osmolaridad= 4x2= 8 mosM (CaCl2 )1.5mM (CaCl2 -> Ca 2+ + 2Cl - ) Osmolaridad= 1,5x3= 4.5 mosM Osmolaridad total= 204+56+8+4.5 = 272.5 mosM Calcula la osmolaridad de una solución de glucos al 5%p/v 5% p/v glucosa Pm= 180,156 g/mol 5 gramos de glucosa en 100ml de disolución Moles de glucosa= 5/ 180,156= 0,028 moles Molaridad= 0,028 moles/0,1= 0,28 Molar Glucosa-> glucosa la osmolaridad es: 0.28 osM o 280 mosM  NORMAS PARA EL USO DE REACTIVOS No se sacará reactivo del frasco original, sino que se tomará la cantidad necesaria en un recipiente y se trabajará con ella Verter siempre el ácido sobre el agua y no al revés, pueden emitir proyecciones. Debemos añadirlos, poco a poco y agitando continuamente Bases fuertes, sobre todo en estado sólido, deben estar poco tiempo en contacto con el aire, ya que son muy higroscópicas, (esto es valido también para ácidos). Se diluirán lentamente agitando, en volúmenes grandes de agua, para que el calor de disolución se difunda. LAS DILUCIONES Realizar una dilución es tomar un volumen de una disolución y añadirle disolvente, consiguiendo así aumentar el volumen y reducir la concentración. Volumen  Concentración Así pues, al diluir una disolución le estamos:  aportando más disolvente  sin modificar la cantidad de soluto presente  pero reduciendo la concentración.  La dilución es una operación que: -Se practica muy a menudo en los laboratorios, debido a que a menudo se necesitan disoluciones con una concentración muy baja. Prepararlas directamente dichas disoluciones supone: Tener que pesar cantidades muy pequeñas de soluto, y el riesgo de error en estas pesadas es más alto que si pesamos cantidades mayores. Por eso se prepara una disolución más concentrada, y a partir de ella se toma la cantidad necesaria y se diluye hasta tener la concentración deseada.  Lasdisoluciones concentradas preparadas para realizar diluciones a partir de ellas se denominan disolución madre o stock. Estasdisoluciones tienen además la ventaja de que se conservan mejor que las disoluciones de muy baja concentración. Otra aplicación es: - la dilución seriada o banco de diluciones.  La nueva concentración En términos numéricos, la relación entre el volumen y la concentración de la disolución inicial y los que obtenemos después de incorporarle más disolvente es la siguiente: Puesto que la cantidad de sustancia es constante: Despejando: Cantidad de sustancia inicial Vi. Ci = Vf. Cf Cantidad de sustancia final Vi y ci el volumen y la concentración de la disolución de origen. Vf y cf el volumen y la concentración resultantes.  Conocemos:  Los datos de la disolución inicial  Volumen final que damos a la dilución Por tanto, el cálculo de la concentración resultante es: 𝑽𝑽𝑽𝑽 𝑪𝑪𝑪𝑪 =. Ci 𝑽𝑽𝑽𝑽 Tener en cuenta que: - Ambos volúmenes se deben medir en las mismas unidades. -La concentración que obtendremos tendrá las mismas unidades que la inicial. -Aumenta el volumen en la misma proporción en la que disminuye la concentración  Por ejemplo, tenemos 100 ml de disolución al 5% p/v y le añadimos 900 ml de disolvente. ¿Cuál será la concentración de la dilución resultante? Vi= 100 ml Vf= 100+900=1000 ml 𝑽𝑽𝑽𝑽 𝟏𝟏𝟏𝟏𝟏𝟏𝟏𝟏𝟏𝟏 𝑪𝑪𝑪𝑪 =. Ci =. 5%= 0,5% Ci= 5% 𝑽𝑽𝑽𝑽 𝟏𝟏𝟏𝟏𝟏𝟏𝟏𝟏𝟏𝟏𝟏𝟏 Veamos qué hubiera sucedido si en lugar de añadir 900 ml hubiéramos añadido solo 100 ml: Vi= 100 ml 𝑽𝑽𝑽𝑽 𝟏𝟏𝟏𝟏𝟏𝟏𝟏𝟏𝟏𝟏 Vf= 100+100=200 ml 𝑪𝑪𝑪𝑪 =. Ci =. 5%= 2,5% 𝑽𝑽𝑽𝑽 𝟐𝟐𝟐𝟐𝟐𝟐𝟐𝟐𝟐𝟐 Ci= 5%  Las disoluciones pueden denominarse: MADRE= INICIAL= CONCENTRADA=stock HIJA= DILUIDA= FINAL EL FACTOR DE DILUCIÓN (D): Es la relación que hay entre el volumen de la solución final y la inicial, o lo que lo mismo la relación entre la concentración inicial y la final. No tiene unidades. 𝑽𝑽𝑽𝑽 𝑪𝑪𝑪𝑪 D= = El factor de dilución y la dilución son 𝑽𝑽𝑽𝑽 𝑪𝑪𝑪𝑪 𝟏𝟏 𝑽𝑽𝒇𝒇 𝑪𝑪𝑪𝑪 inversamente proporcionales. D= F= = 𝑭𝑭 𝑽𝑽𝒊𝒊 𝑪𝑪𝑪𝑪 Ejemplo: Una solución de NaCl 0’5 M se utilizó para preparar una solución diluida de NaCl 0’01 M. Calcular el valor del factor de dilución. D = Ci / Cf = 0’5 / 0’01= 50 D= 50 por tanto prepararíamos una dilución 1/50 Ejemplo: Sabiendo que el factor de dilución es 15: ¿qué volumen de agua hay que añadir a 5 ml de una solución concentrada de glucosa para hacer la dilución deseada? Vi= 5ml F = Vf /Vi. Vf = F x Vi= 15 x 5 ml = 75 ml será el volumen final Por tanto tendremos que añadir 70 ml EXPRESIÓN DE LAS DILUCIONES: 1. Como una fracción: (Vi /Vf) - En el numerador va el volumen inicial (Vi). - En el denominador el volumen resultante tras la dilución (Vf), que +V será la suma del volumen inicial más el volumen de disolvente 0 añadido. Vf = Vi +Vdisolvente Como cifras separadas por dos puntos: Vi :Vf ejemplo 1:10 1ml de la disolución concentrada y se lleva hasta 10ml (Vi :Vdiluyente ) (1:9) 1ml de la disolución concentrada y 9ml de diluyente.  3. Como porcentaje volumen-volumen en que, por ejemplo: una dilución 1/10 será una 𝑽𝑽𝑽𝑽 dilución al 10%: %v/𝐯𝐯 = 𝑽𝑽𝑽𝑽.100 Porejemplo, si a un volumen inicial de 10 ml le añadimos 90 ml de disolvente para obtener 100 ml de disolución diluida, podemos expresar la dilución: 10 / 100 = 1 / 10 10 : 100 = 1 : 10 (10Ci :90diluyente)= (10 / 100) ∙ 100 = 10%  Ejemplos de cálculos de diluciones Las diluciones se pueden realizar con distintos objetivos, pero los procedimientos básicos de cálculo y elaboración serán los que estamos explicando. 1. Conseguir una dilución establecida 2.Saber qué dilución debemos hacer para conseguir una determinada concentración. 3. Calcular el volumen de reactivo para una disolución  1. Conseguir una dilución establecida Tenemos 850 ml de una disolución de 20 g de NaCl en agua y tenemos que hacer una dilución 1:10. - ¿Cuánto disolventeV hemos de añadir? - ¿Cuál será la concentración final en porcentaje peso/volumen? Como es una dilución 1:10, y el factor de dilución es 10, significa que el volumen aumenta 10 veces: V1 = V0 ∙ 10 = 850 ∙ 10 = 8500 ml El volumen de agua que debemos añadir a la disolución es: V1 = V0 + V de disolvente que debemos añadir. 8 500 – 850 = 7650 ml  La concentración inicial es: Como es una dilución 1:10 y el factor de dilución es 10, significa que la concentración se reduce 10 veces: 2. Saber qué dilución debemos hacer para conseguir una determinada concentración. Por ejemplo: - Tenemos una disolución 3 M de KOH en agua - Necesitamos 100 ml de disolución 1,5 M de KOH ¿CÓMO DEBEMOS HACER LA DILUCIÓN PARA CONSEGUIR LA CONCENTRACIÓN DESEADA? Sabemos que, para un factor de dilución x, se cumple la siguiente expresión: Ya que como hemos visto el factor de dilución nos informa sobre la relación entre las concentraciones, es decir, cuanto se ha visto reducida la concentración.  Ya sabemos que la dilución es 1/2. Esto significa que deberemos duplicar el volumen. Como necesitamos 100 ml, no es necesario que diluyamos toda la disolución que tenemos, ya que podemos calcular la cantidad que necesitamos: Tomando 50 ml de la disolución inicial y duplicando su volumen (añadiéndole 50 ml de agua) tendremos los 100 ml de disolución 1’5 M de KOH. Otra forma de hacerlo: Tenemos una disolución 3 M de KOH en agua, y necesitamos 100 ml de disolución 1,5 M de KOH. Vi·Ci=Vf·Cf Vi = ? Vi·Ci=Vf·Cf Ci= 3M Vi=Vf·Cf/Ci Vf=100ml Cf= 1’5 M Vi =100ml x 1’5M/3M Vi=50ml Tomaremos 50ml de la solución 3M de KOH y añadiremos agua hasta tener 100ml. Ejemplos: 1. Tenemos una disolución 5 M de KOH en agua y necesitamos 250 ml de disolución 0’5 M de KOH, ¿cómo debemos hacer la dilución para conseguir la concentración deseada? 1. Tenemos una disolución 5 M de KOH en agua y necesitamos 250 ml de disolución 0’5 M de KOH, ¿cómo debemos hacer la dilución para conseguir la concentración deseada? Vi = ? Vi·Ci=Vf·Cf Ci = 5M Vf = 250ml Vi=Vf·Cf/Ci Cf = 0’5 M Vi= 250mlx0,5M/5M Vi= 25ml Tomaremos 25ml de la solución 5M de KOH y añadiremos agua hasta tener 250ml. 3. Calcular el volumen de reactivo para una disolución Los reactivos comerciales indican en sus etiquetas: - La riqueza - La densidad Estos datos son los que debemos utilizar para determinar la cantidad que hemos de tomar en cada caso. Veamos cómo podemos hacerlo a partir de lo que hemos aprendido sobre diluciones. DISOLUCIONES DE LÍQUIDO EN LÍQUIDO: Queremos preparar 250 ml de disolución 0’25 M de ácido sulfúrico (H2SO4) en agua partiendo de un ácido sulfúrico comercial de: Datos: 96% en riqueza densidad 1’84 g/ml PMH2SO4: 98’08 u Para calcular el volumen de reactivo ácido sulfúrico que debemos tomar debemos conocer primero la concentración del preparado comercial: Partimos de un litro del preparado comercial: ρ = 1’84 g/ml  El litro de preparado pesa 1 840 g (masa soluto comercial) Riqueza = 96% : Riq% = (m sol puro / m sol comercial) · 100  En 1 840g de preparado hay 1 766’4 g de H2SO4 puro Masa molecular = 98’08 u: n = m soluto (g) / Pm n sol puro = 1766’4 / 98’08 n sol puro = 18 moles  Los 1 766’4 g se corresponden con 18 moles Hay 18 moles de H2SO4 en 1 litro de preparado: La concentración es 18M  Aplicamos ahora la fórmula de las diluciones: Vi·Ci=Vf·Cf Vi: ? ci: 18 M Vf: 250 ml cf: 0’25 M  Ejercicios: 19. Si se toman 50 ml de una solución NaCl 0’4M y se llevan a un volumen final de 1l ¿Cuál es la concentración final? 20. ¿Qué volumen de HCl 6M debe usarse para preparar 500 ml de una solución de HCl 5 mM? 21. ¿Cuál sería la concentración final de una solución preparada al diluir 45 ml de KOH 4’2 M en un volumen final de 300 ml? Se necesita diluir una muestra con un factor de 25 de forma que el volumen final sea de 500 µl. Calcula: a) Volumen inicial que hay que tomar. b) Si se diluye de forma que la concentración final es de 200mg/ml, indica cuál sería la concentración inicial en µg/ µl al hacer la dilución propuesta. 1 𝐶𝐶𝐶𝐶 𝑉𝑉𝑉𝑉 𝑉𝑉𝑉𝑉 F= 25 => D= = = = 25 𝐶𝐶𝐶𝐶 𝑉𝑉𝑉𝑉 500 µ𝑙𝑙 500 Vi= = 20 µl 25 1 200𝑚𝑚𝑚𝑚/𝑚𝑚𝑚𝑚 D= = 25 𝐶𝐶𝐶𝐶 𝑚𝑚𝑚𝑚 103 µ𝑔𝑔 1 ml µ𝑔𝑔 Ci= 25x200 mg/ml = 5x103 x x = 5x103 𝑚𝑚𝑚𝑚 1 𝑚𝑚𝑚𝑚 103 µl µ𝑙𝑙  Diluye D= 1/3 una muestra de células de forma que se obtenga 120 µl. Diluye una muestra D= 1/5 una suspensión celular de forma que se obtenga 2 µl. D= 1/5 = Vi/Vf = Vi/(2 µl) Vi= 0,4 µl Prepara 60 µl de una disolución celular en PBS en una proporción D (1:2) (suspensión celular: PBS) Hay 3 partes: 1 de suspensión celular y 2 de PBS. 60/3= 20 µl 20 µl de suspensión celular 40 µl de PBS 22. Prepara 20 µl en de mezcla de reacción compuesta por una proporción D (1:3) (muestra + reactivo de reacción). Calcula a. La cantidad por ensayo que hay poner de muestra y la cantidad de reactivo de reacción. Sol: muestra 15 µl y reactivo de reacción (1X)= 15 µl b. La cantidad de reactivo de reacción 10x que hay que diluir para 10 muestras. Sol: Vi= 15 µl del (10X) y 135 µl de tampón. 24. Prepara 120 µl, en una proporción D (50%) (PBS: disolución celular) una disolución celular en PBS. Sol: Suspensión celular= 3x30= 90 µl 25. Prepara 1L de tampón TAE 1x a partir de TAE 50X Se toman 200ml de (50X) y se lleva a 1L. 26. Se necesita preparar tampón 1X para realizar 10 ensayos, para cada uno de ellos se gastan 500 µl, se dispone de un tampón concentrado 10X, explica cómo lo prepararías.Sol:Se toman 0,5ml de (10X) y se añade 4,5 ml de agua destilada. 27. Calcula la cantidad que hay que tomar de una disolución stock 20 pmol/ µl para obtener 50 µl de concentración 40nM (Cf). Sol: Vi=0,1 µl 28. Calcula la cantidad que hay que tomar de una disolución stock 25 mM, para obtener 50 µl de concentración 250 µM (Cf) Sol: Vi = 0,5 µl 29. Calcula la cantidad de enzima hay que tomar de una solución stock de 250 U/ ml si se quiere tener 50 U. Sol: 200µl 30. Hay que reconstituir un estándar liofilizado que contiene 29,5 nmoles de forma que la solución preparada sea 0,1mM, explica cómo lo harías. Sol: 295 µl  Llega al laboratorio de cultivos celulares un espécimen de 1ml de células con un recuento de 2,5.104 cel/ml. De requieren 2. 106 células en 100 µl de PBS, indica cómo lo prepararías: Solución: 1º Calculamos el volumen que hay que tomar del espécimen para tener 2x 106 células: 1ml/2,5x 104 células = Xml/2x 106 células Xml= 0,8ml=800 µl 2º Se centrifuga 800 µl del espécimen, se elimina el sobrenadante y se reconstituye con 100 µl Llega al laboratorio de cultivos celulares un vial con 15ml de una suspensión celular de concentración 2x104 cel/ml. Calcula los ml de la suspensión celular que hay que tomar para tener 8x104 células. Si a continuación esa alícuota, se centrifuga y se resuspende con 500 µl de medio de cultivo, calcula la concentración celular en esos 500 µl expresado en cel/ml. Solución 1𝑚𝑚𝑚𝑚 𝑋𝑋𝑋𝑋𝑋𝑋 = Xml= 4ml de la suspensión celular habrán 8x104 2 𝑥𝑥𝑥𝑥4 𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐 8 𝑥𝑥𝑥𝑥4 𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐 células. En 0,5ml las cel/ml = 8x104 células/0,5= 1,6 x 105 cel/ml Se tiene un tubo con 10ml de células con una concentración de 15000 cel/ml. a. Si se requieren 105 células, calcula el volumen que hay que tomar. b. Calcula el número de células que hay en 7ml. c. Si se toman 7 ml, se centrifugan y se resuspenden en 100 µl, calcula cuál será la concentración resultante. Solución 1𝑚𝑚𝑚𝑚 𝑋𝑋𝑋𝑋𝑋𝑋 a) = X ml= 6,67ml 15000 𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐 105 𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐 a) Número de células que hay en 7ml 1𝑚𝑚𝑚𝑚 7 𝑚𝑚𝑚𝑚 = X células= 105.000 células= 1,05 x 105 células 15000 𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐 𝑋𝑋 𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐 Si se toman 7 ml, se centrifugan y se resuspenden en 100 µl, calcula cuál será la concentración resultante expresado en cel/ml. Células/ml= 105.000 células/0,1ml= 1050000 células/ml = 1,05 x106 células/ml Llega al laboratorio de cultivos celulares un espécimen de 200 µl de células, para saber su recuento se toman 10 µl y se obtiene un recuento de 650 células en 0,4 µl. Indica cuántas células se disponen y cómo preparar 2x105 células en 100 µl. 1º Calculamos la concentración de células/ml 0,4 µ𝑙𝑙 1000 µ𝑙𝑙 = X células/ml= 650x1000/0,4= 1,625 x106 células/ml 650 𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐 𝑋𝑋 𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐 2º El número total de células que se dispone, teniendo en cuenta que se han gastado 10 µl para el contaje: 200-10= 190 µl número total de células que se dispone= 1000 µ𝑙𝑙 190 µ𝑙𝑙 = = número total de células que se dispone= 1,625.106 x190/1000= 308750 1,625 x106 𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐 𝑋𝑋 𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐 células 3º el volumen que hay que tomar del espécimen para tener 2 x105 células: 1𝑚𝑚𝑚𝑚 𝑋𝑋𝑋𝑋𝑋𝑋 = X ml= 0,1231 ml 1,625 𝑥𝑥𝑥𝑥6 𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐 2 𝑥𝑥𝑥𝑥5 𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐 Se toma 0,1231 ml de espécimen, se centrifuga y se resuspende en 100 µl de PBS. Se dispone de 400 µl de una suspensión celular. Se toma una alícuota de 10 µl, se diluyen con un factor F=15 y se realiza el recuento, obteniéndose un valor de 860 células en 0,4 µl. Se necesitan 107 células en 1,5ml. Calcula la concentración inicial de células y si hay células suficientes. Explica el volumen que hay que tomar de la suspensión celular. 1º calculamos la concentración inicial de la suspensión celular. 860 cel Ci= 15x = 32,25 x 103 células/ µl= 32,25 x 106 células/ ml 0,4 µl 2º Como hay 0,4ml, la cantidad total de células= 32,25 x 106 células/ ml x 0,4ml= 12,9 x 106 células. Sí hay células suficientes. 3º El volumen necesario para tener 107 células 1𝑚𝑚𝑚𝑚 𝑋𝑋𝑋𝑋𝑋𝑋 = Xml= 0,3107ml= 310, 07 µl 32,25 x 106 𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐 107 𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐 Se toman 310, 07 µl, se centrifugan, se elimina el sobrenadante y se añaden 1,5ml de medio de cultivo. Diluciones seriadas o banco de diluciones Un banco de diluciones es una serie de diluciones realizada a partir de una disolución madre, en que el factor de dilución es el mismo en cada paso. Concentraciones de los diferentes tubos de una dilución seriada: Cn= Ci. (1/F)n Se pueden hacer los cálculos de dos formas: 1ª en la que Vf= Vi+Vdiluyente Se aplican las mismas fórmulas que las vistas en la dilución normal, solo que ahora el factor de dilución es el producto de cada uno de los factores de dilución intermedios. D=Vi/Vf 2ª En la que el volumen final se refiere al que queda en cada tubo una vez que se pasa el volumen inicial también llamado volumen de paso al tubo siguiente, este volumen equivale al volumen fijo o volumen de diluyente es decir Vf=Vdiluyente. El volumen total= Vpaso+Vfinal D= Vp/Vp+Vf  1. Preparación de un banco de diluciones Por ejemplo: Preparamos un banco de cinco diluciones con un factor de dilución 2 a partir de una disolución madre con concentración ci. El volumen final es de 2ml. Vi·Ci=Vf·Cf Para hacerlo seguimos estos pasos: 1. Numeramos los tubos de dilución del 1 al 5. 1 2 3 4 5  2. Ponemos 1 ml de diluyente en cada uno de ellos. Para facilitar los cálculos, usamos el volumen necesario para que, añadiéndole 1 ml luego la dilución sea la deseada. En este caso, para obtener una dilución 1:2 a partir de 1ml de disolución madre, la cantidad de diluyente necesario es de 1 ml. A este volumen lo denominamos volumen fijo. F=Ci/Cf= Vf/Vi= 2= 2ml/Vi Vi= 1ml Vdiluyente= 1ml  Traspasamos 1 ml de la disolución madre al tubo número 1; este volumen que traspasamos de cada tubo al siguiente lo denominamos volumen inicial (Vi). Agitamos para homogeneizar y así con el resto de los tubos Al acabar, los tubos 1 a 4 contendrán 1 ml de dilución, que coincidirá con el volumen de diluyente que hemos puesto al principio en cada tubo, volumen fijo (Vf) El tubo 5, en cambio, contendrá 2 ml; lo habitual es extraer el volumen sobrante para que este tubo también quede con el volumen final.  Las concentraciones en las diluciones seriadas: Las concentraciones de cada tubo serán las que muestra, la dilución se va acumulando: Si el F es siempre el mismo Cn= Ci. (1/F)n Si el F es diferentes, se calcula el F total multiplicando los factores intermedios siempre el mismo Cn= Ci. Ftotal Si lo que se necesita es tener 1ml en cada tubo (Vf=Vdiluyente). Este valor equivale al volumen de diluyente. Para realizar los cálculos, tenemos en cuenta que el volumen total es Vt= Vp+Vd = Vp+Vf Si nos piden que quede 1ml = Vd D=1/2= Vp/Vt= Vp/Vp+1 Vp= 1ml Vdiluyente=Vf= 1ml Se necesita preparar un banco de 4 diluciones, con un factor de dilución de 3, a partir de una disolución 2M, de tal forma que en cada tubo queden 9ml. Calcula: a) El volumen a trasvasar de un tubo al siguiente. b) El volumen de disolvente que hay que poner en cada tubo. c) La dilución de cada tubo respecto a la disolución madre. d) La concentración de cada tubo. Vf=Vd= 9ml D=1/3= Vp/Vp+Vd 1/3= Vp/Vp+9 Vp+9= 3Vp 2Vp= 9 Vp= 9/2= 4,5ml D1= 1/3 C1= 2M. 1/3 D2=(1/3).(1/3) C2= 2M (1/3) (1/3) D3= (1/3).(1/3). (1/3) C3= 2M (1/3) (1/3) (1/3) D4= (1/3).(1/3). (1/3).(1/3)= C4= 2M (1/3) (1/3) (1/3). (1/3) 31. A partir de una disolución estándar de 800 µg/µl se han de realizar 5 diluciones a ½, de forma que en cada tubo queden 200 µl y calcula la concentración en cada tubo. Sol: Vi= 200 Cn= Ci Dn C0= 800 µg/µl C1= 400 µg/µl C2= 200 µg/µl C3= 100 µg/µl C4= 50 µg/µl C5= 25 µg/µl 2. Aplicaciones de los bancos de diluciones El banco de diluciones se emplea mucho en: - Inmunología. - Hematología. - Microbiología. - Bioquímica. Diluciones seriadas en microbiología Un ejemplo muy común es: La preparación de las diluciones decimales para el análisis microbiológico. Para cuantificar la contaminación bacteriana en una muestra: 1. Se hace una siembra en una placa de Petri 2. Se hace el recuento del número de colonias que han aparecido. Para que el procedimiento sea correcto debe haber un número adecuado de colonias: si hay muchas se apelotonarán y no se podrán contar si, por el contrario, hay pocas, el resultado dependerá del azar, es decir, de cuántas colonias se «pillen» al hacer el recuento. Poreso, cuando llega al laboratorio una muestra de la que se sospecha que está muy contaminada, se prepara con ella una serie de diluciones 1/10 y se toma 100 µl de cada dilución y se siembra en una placa Petri. Se cuenta el número de colonias en cada placa: En la placa correspondiente a la dilución del tercer tubo el número de colonias es de 159 a partir de 100 µl Luego las colonias por ml son 1590. Para calcular la Ci aplicamos la fórmula. Cf = Dn. Ci 1590 UFC/ml = (1/10)3. Ci Ci= 1590. 103= 159. 104 UFC/ml  Uso de las diluciones seriadas en bioquímica: Las diluciones seriadas se pueden usar para la construcción de CURVAS DE CALIBRADO. Estas curvas relacionan las concentracionesconocidas de una disolución de un analito con las absorbancias a una determinada longitud de onda. Por ello se realizan diluciones de una disolución madre ( ½, 1/5,1/10….) para ensayar diferentes concentraciones conocidas. Esto permite establecer una ecuación de la recta y calcular así concentraciones desconocidas que este dentro del rango de concentraciones usadas. Cuantificación de colesterol con una curva de calibrado Se necesita cuantificar el colesterol presente en 4 muestras de suero. Las muestras se diluyen para el ensayo con un factor de 10. Para el ensayo se necesitan mezclar la alícuota del suero con el reactivo de reacción en la proporción (1:1), el volumen de la mezcla es de 1ml. El reactivo de reacción viene concentrado 10x.// Para la cuantificación se prepara una recta de calibrado con 4 estándares. El más concentrado es de 500mg/ml, se realizan 4 diluciones (1/2), de forma que en cada tubo queden 0,5ml. Una vez realizada la reacción se obtienen los siguientes valores de absorbancia: La ecuación obtenida es: absorbancia= 0,002 x [concentración]+ 0,003 R² = 1 [concentración]= (absorbancia-0,003)/ 0,002 mg/ml absorbancia Realiza los cálculos necesarios para realizar el ensayo 500 0,99 y calcula la concentración de cada suero 250 0,5 125 0,25 62,5 0,125 0 0,01 suero 1 0,028 suero 2 0,065 suero 3 0,018 suero 4 0,04  1º Volumen de muestra diluida necesario para la reacción: (1:1) con un volumen total de 1ml. 0,5 muestra+ 0,5 reactivo de reacción. 2º Dilución de la muestra (1/10), para 0,5 ml se toman D= 1/10= Vi/Vf= Vi/0,5ml Vi= 0,05ml= 50 µl Tampón de dilución: 500-50= 450 µl ……………………………………………………………………… Si se ha de diluir (1:9) Se hacen 10 partes (1 de reactivo+9 de buffer) 5/10= 0,5ml reactivo Buffer= 9x0,5= 4,5ml  3º Reactivo de reacción: 0,5ml por ensayo: (4 controles+ control negativo+ 4 sueros+ 1 extra)= 10 ensayos Volumen de reactivo de reacción 10x 0,5= 5ml Como está 10x: Vi xCi = Vf x Cf Vix (10X)= 5mlx (1X) Vi= 0,5ml Se ponen 0,5ml del (10X)+4,5ml de buffer 4º Recta de calibrado: Volumen que ha de quedar en cada tubo= 0,5ml, diluciones D=1/2 Ci = 500mg/dl Los 0,5ml equivalen al volumen de diluyente D=1/2= Vi/Vi+0,5= 2Vi= Vi+0,5 Vi= 0,5ml C1= Ci D1= 500x1/2= 250mg/dl C2= Ci D2= 250mg/dl C3= Ci D3 =125mg/dl C4= 62,5 mg/dl Al obtener la ecuación absorbancia= 0,002 x [concentración]+ 0,003 R² =1 [concentración]= (absorbancia-0,003)/ 0,002 Y sustituir las absorbancias de cada suero, y multiplicando por el factor de dilución realizado se obtienen los siguientes valores: absorbancia mg/dl diluido mg/dl (1/10) (real) suero 1 0,028 12,5 125 suero 2 0,065 31 310 suero 3 0,018 7,5 75 suero 4 0,04 18,5 185  Diluciones con más de un factor de dilución Si se tiene una solución stock de Ci= 4M y se necesitan 10ml de concentración Cf= 2 µM, indica cómo harías el banco de diluciones: Se pone ambas concentraciones en las mismas unidades: 106 µM Ci= 4M = 4. 106 µM 1M 2 µM 1 1 1 6 La D= Cf/Ci= = =.( ) 4. 10 µM 2. 10 2 10 6 6 D=1/2= Vi/10 => Vi= 5ml Vd= 5ml D=1/10= Vi/10 => Vi= 1ml Vd= 9ml 33. Si se realizan las siguientes diluciones D1=1/2, D2=1/3, D3=1/10 Calcula la dilución del tercer tubo en relación a la disolución madre: D3= ½.1/3. 1/10= 1/60 34. Si se cuenta con una solución 2,2 M de NaCl, ¿Cuántas diluciones seriadas 1/10 deben realizarse para llegar a una solución de concentración 22 μM? Indique que volúmenes utilizaría si las diluciones se realizan en eppendorfs con Vtotal=1,5ml. Sol: D=(1/10) 5 Vi=0,15ml Vd= 1,35ml 35. Su jefe le entrega 10ml de un cultivo de E. coli (bacterias) con 8.4 x 107 células/ml y le pide que prepare 100 ml de una suspensión que contenga menos de 100 células/ml, ¿qué diluciones debe realizar para llegar al resultado deseado si en cada tubo elVtotal=100ml? Sol: Dt= (1/8,4) (1/10) 5 D=1/10 Vi= 10ml Vd=90ml D= (1/8,4) Vi= 11,9ml Vd= 88,1ml 36. Usted posee un eppendorf con 1 ml de una solución 4.3 x 104 células y debe producir una solución que contenga 43 cel/ml. ¿Qué diluciones seriadas haría si en los tubos sólo puede llegar a un Vtotal=1ml ?¿y tuviese que pasar de cada solución a la siguiente no menos de 5 µl? Sol= D=(1/10)3 Vi= 0,1ml Vd=0,9ml Vi= 5 µl Vf= 50 µl Vd= 45 µl 37. Usted posee una sustancia coloreada y desea realizar una curva de calibración con al menos 4 puntos para el rango de concentraciones 0,1 mM a 0,2 M. Si ud. posee una solución 2,5 M y sabe que la ε490 = 50 M-1-1cm -1 a. Indique qué diluciones seriadas haría para obtener esos puntos. b. ¿Cuál será la Absorbancia a 490nm de cada uno de los puntos que ud. eligió? Sol: D1=1/12,5 -> C1 = 0,2M= 2x10 2 mM Abs= 4 D2= ½= -> C2= 0,1M= 10 2 mM Abs =2 D3=1/10 => C3= 10 mM Abs=0,2 D4= 1/10 => C4= 1 mM Abs= 0,02 D5= 1/10 => C5= 0,1 mM Abs=0,002 https://www.youtube.com/watch?v=ysAxpUZ-m-w https://sites.google.com/a/goumh.umh.es/practicas-de- microbiologia/indice/tecnicas-de-aislamiento/banco-de-diluciones-1 https://www.youtube.com/watch?v=4f3uiwiioRg