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Tema 2. Obtención y purificación de ácidos nucleicos Métodos rápidos para la obtención de DNA Obtención de DNA de colonia Obtención de DNA con discos de celulosa Métodos “estándar” para la obtención de ácidos nucleicos Etapas básicas del proceso...

Tema 2. Obtención y purificación de ácidos nucleicos Métodos rápidos para la obtención de DNA Obtención de DNA de colonia Obtención de DNA con discos de celulosa Métodos “estándar” para la obtención de ácidos nucleicos Etapas básicas del proceso Procedimiento para la lisis celular Componentes esenciales del medio de extracción La extracción orgánica Mezclas de fenol:cloroformo Fenol neutro vs. Fenol ácido Trizol Concentración y purificación de ácidos nucleicos Precipitación con alcohol Concentración y purificación por adsorción sílice Purificación con perlas magnéticas  Tema 2. Obtención y purificación de ácidos nucleicos Obtención de plásmidos: la lisis alcalina Kits de ”miniprep” Purificación de plásmidos superenrrollados mediante gradientes de CsCl Análisis cuantitativo y cualitativo de ácidos nucleicos Cuantificación espectrofotométrica Criterios de pureza basados en la Absorbancia Análisis cualitativo de ácidos nucleicos La electroforesis en gel de agarosa Tinción de ácidos nucleicos Patrones de tamaño Información obtenida a partir de la observación de geles Purificación de fragmentos de DNA a partir de geles  Tema 2. Obtención y purificación de ácidos nucleicos Identificación de fragmentos con secuencias específicas en mezclas complejas de ácidos nucleicos Concepto de “sonda” Características de las sondas Marcaje e hibridación de ácidos nucleicos Sondas de DNA Métodos de marcaje Random priming (“primado al azar”) Nick Translation (“traslado del corte”) PCR con precursores marcados Marcaje terminal Sondas de oligonucleótidos Sondas de RNA Tipos de marcas Marcas radiacticas Marcas no radiactivas Hibridación: concepto de “astringencia”  Objetivo El objetivo es la extracción del DNA (o RNA, o ambos) de la célula. Esto implica la separación de otros componentes con los que está formando un complejo (CROMATINA) y su purificación, en mayor o menor grado, dependiendo de la finalidad que tenga esta obtención.  Objetivo El tipo de extracción del DNA pude ser diverso y dependerá de la finalidad que le vamos a dar a ese ácido nucleico: - Clonación de fragmentos de DNA genómico en un vector: construcción de genotecas - Obtención de vectores de clonación (plásmidos, fagos…) - DNA molde para una reacción de PCR. - Análisis RFPL (restriction fragment length polymorphism). - Northern y Southern blot. Métodos rápidos  Métodos rápidos Se utilizan para obtener el DNA que se va a utilizar como molde para una reacción de PCR. Muy variados en cuanto al detalle, pero, en esencia, se trata de calentar las células a alta temperatura para que se libere de la misma una porción de su DNA o permeabilizar las células para hacer accesible el DNA a los componentes de la reacción de PCR. Veamos dos ejemplos Métodos “ultra-rápidos” (bacterias) For the rapid direct colony PCR, two protocols were followed. The first one consisted of lightly touching a colony of a culture on blood agar with a sterile pipette tip and placing of the collected material into a tube containing 50 µL nuclease-free water, then subjected to boiling at 1000 C for five minutes and subsequently frozen at -200 C for 10 minutes, the mixture was centrifuged at 3000 g for 10 minutes. In the second procedure the colony was preheated at 950 C for 10 minutes in the thermal cycler and cooled. In both cases, 5 µL was used for PCR amplification. A colony from both 24 and 48 hour cultures were used. Finally, the mix was added into the two sets of samples separately. The PCR with extracted genomic DNA as template of strains of S. suis was made as reported by Marois et al. (19). The primers amplify a fragment of 294 bp of 16S rRNA gene. Métodos rápidos  Métodos rápidos PCR de colonia (levaduras) 1. Preparar alícuotas de 50 µl de agua en tubos de PCR de 0,2 ml. Use una pequeña punta de pipeta para recoger una pequeña cantidad de levadura (menos del tamaño de un grano de arroz). Evite tocar el agar. Transfiera la levadura al agua, girando para quitar las células de la punta. Agite suavemente para suspender las células. 2. Colocar los tubos en una máquina de PCR con programa: 99ºC, 5 min y 4ºC (mantener). Retire los tubos de la máquina, centrifugue rápidamente, coloque los tubos en hielo. La levadura calentada está lista para usar o se puede congelar a -20ºC para más tarde sin pérdida de eficiencia. Importante: agite suavemente las células en vórtex justo antes de agregarlas a las reacciones de PCR. El DNA está en las células. Use la suspensión celular. 3. De aquí en adelante, la PCR es esencialmente lo mismo que con cualquier molde (por ejemplo, plásmido, DNA genómico puro). Haga una mezcla maestra de PCR siguiendo el fabricante de la enzima PCR. Métodos rápidos  Métodos rápidos (A) The cellulose dipstick consists of a 2x40 mm wax impregnated handle and a 2x4 mm nucleic acid binding zone. (B) An overview of the dipstick-based purification method in which tissue is homogenised by shaking it in a tube containing ball bearings and an appropriate extraction buffer. Métodos “estándar”  Etapas básicas de un procedimiento general para extracción y purificación de ácidos nucleicos Disgregación o fragmentación del tejido Reactivos/agentes: Las etapas Lisis celular Disolventes Orgánicos deben ir como el fenol y el cloroformo acompañadas Detergentes como SDS, de medidas o Clarificación deoxycolato, triton X-100, agentes que NP-40 Enzimas como la inactiven lisozima y la proteinasa K nucleasas Purificación Calor celulares Sonicar o triturar Cualitativo: Cuantitativo: Análisis electroforesis espectrofotometría UV  Lisis celular 1. Lisis celular La lisis de las células puede conseguirse por: Métodos físicos Lisis enzimática  Lisis celular: rotura física de los tejidos y células Table 1. Techniques used for the physical disrup tion of cells. Lysis Method Description Apparatus Waring Blender Rotating blades grind and disperse cells and Mechanical Polytron tissues Dounce Homogenizer Liquid Cell or tissue suspensions are sh eared by Potter-Elvehjem Homogenization forcing them through a narrow space Homogenizer French Press Sonication Sonicator High frequency sound waves shear cells Freezer or dry Repeated cycles of freezing and thawing Freeze/Thaw ice/ethanol disrupt cells through ice crystal formation Manual grinding Mortar and pestle Grinding plant tissue, frozen in liquid nitrogen Homogenizador Dounce Homogenizador mecánico - polytron Lisis enzimática de las células  Extracción de ácidos nucleicos 1. Lisis Celular: se lisa la membrana celular. Tampón básico para la lisis celular: u pH entre 7 y 8 (por ejemplo, Tris-HCl que tampona en el rango entre 7 y 9) u Concentración moderada de sal, como NaCl 150 mM u Presencia de EDTA (etilendiamino tetraacético; sal disódica) Es un agente quelante de cationes divalentes tales como Mg2+. El Mg2+ es un cofactor para nucleasas (DNasa). Si el Mg2+ está unido al EDTA, las nucleasas no están activas u Un detergente (como el SDS) En caso de querer obtener núcleos: detergente no iónico que lisa la membrana celular externa, pero no se rompe la membrana nuclear. Detergentes  Extracción de ácidos nucleicos 2. Clarificación del extracto. -centrifugación -filtración -métodos mixtos (enzimas + centrifugación)  Extracción de ácidos nucleicos en plantas La extracción del DNA en plantas puede presentar problemas por el alto contenido en carbohidratos de los extractos. Una opción es utilizar un detergente denominado CTAB. La interacción entre el DNA y el CTAB depende de la fuerza iónica. Se produce a fuerzas iónicas bajas o moderadas y el complejo es precipitable. Extracción de ácidos nucleicos a partir de la cromatina  Extracción de ácidos nucleicos El método más habitual es la extracción orgánica con fenol o fenol-cloroformo Los solutos se disuelven mejor en un disolvente que es más similar en estructura química a sí mismo. La capacidad global de solvatación de un disolvente depende principalmente de su polaridad. Los ácidos nucleicos son polares debido a su esqueleto de fosfato cargado negativamente y, por lo tanto, los ácidos nucleicos son solubles en la fase acuosa.  Extracción “orgánica” de ácidos nucleicos Fenol / Clorformo La manera estándar para eliminar las proteínas a partir de soluciones de ácidos nucleicos es extraer una vez con fenol, una vez con una mezcla 1:1 de fenol y cloroformo, y una vez con cloroformo. También es habitual utilizar una mezcla fenol: cloroformo alcohol isoamílico en proporciones 25:24:1  Extracción “orgánica” de ácidos nucleicos El fenol separa/disocia las proteínas del DNA. El cloroformo: desnaturaliza las proteínas y los lípidos hace al DNA menos soluble en la fase orgánica favorece la separación entre la fase acuosa y la orgánica. El alcohol isoamílico reduce la formación de espuma Una extracción final con sólo cloroformo elimina cualquier rastro persistente de fenol de la preparación de ácido nucleico. El fenol es altamente corrosivo y puede causar quemaduras graves  Extracción “orgánica” de ácidos nucleicos La extracción orgánica se puede realizar con fenol tamponado a pH neutro o a pH ácido. A pH neutro tanto el DNA como el RNA son moléculas cargadas y van a la fase acuosa RNA  Extracción “orgánica” de ácidos nucleicos Fenol ácido (pH 4,5) Debido a la mayor acidez del RNA respecto al DNA (pKa RNA menor que pKa DNA). Por lo tanto, los grupos fosfato en el DNA son neutralizados con mayor facilidad que en el RNA. Además, el RNA es monocatenario y deja expuestas las bases nitrogenadas que pueden formar enlaces de hidrógeno con agua, manteniéndolo en la fase acuosa. Permite una obtención preferente del RNA. A este pH ácido la mayoría de las proteínas y fragmentos de DNA pequeños (< 10 kb ) fraccionan en la fase orgánica, mientras que los fragmentos grandes de DNA y algunas proteínas permanecen en la interfase. Por el contrario, el RNA permanece en la fase acuosa superior.  Extracción “orgánica” de ácidos nucleicos Una variante es el TRIZOL, un reactivo listo para usar para el aislamiento de RNA total a partir de células y tejidos. El reactivo, una solución monofásica de isotiocianato de guanidinio y fenol,  Extracción “orgánica” de ácidos nucleicos Durante la homogeneización de la muestra o la lisis, el reactivo Trizol ® mantiene la integridad del RNA mientras que disgrega las células al disolver determinados componentes celulares. La adición de cloroformo seguida de centrifugación permite separar la solución en una fase acuosa y una fase orgánica. El RNA permanece exclusivamente en la fase acuosa. Se separa la fase acuosa y se recupera el RNA mediante precipitación con alcohol isopropílico.  Concentración de ácidos nucleicos 1. Precipitación con alcohol (etanol o isopropanol) 2. Filtración a través de membranas con exclusión molecular 3. Resinas cargadas 4. Columnas de sílice (sílica gel) 5. Perlas (bolas) magnéticas 6. Purificación a través de centrifugación en gradientes de CsCl+EtBr  Concentración de DNA: precipitación El método más ampliamente utilizado para la concentración de DNA es la precipitación con alcoholes, principalmente con etanol. El precipitado de ácido nucleico, se forma en presencia de concentraciones moderadas de cationes monovalentes (sales de Na+). El Na+ interrumpe los enlaces de hidrógeno entre el agua y las moléculas de DNA. En presencia de cationes, el alcohol induce un cambio estructural en las moléculas de DNA que hace que se agreguen y precipiten.  Concentración de DNA: precipitación Las cuatro variables críticas son la pureza del DNA, su peso molecular, su concentración, y la velocidad a la que se centrifuga. Típicamente se añaden 2-2,5 volúmenes de etanol frío para precipitar el DNA. DNA a concentraciones tan bajas como 20 ng/ml forma un precipitado que puede ser cuantitativamente recuperado. Para soluciones muy diluidas se puede añadir un “carrier” como glucógeno o tRNA Moléculas de DNA muy cortos (