Análisis Hematológico de la Serie Blanca: Neoplasias Hematopoyéticas - PDF

Introducción ============ Los leucocitos son células sanguíneas nucleadas y carentes de pigmentos que se originan en la medula osea y en el tejido linfático, y son los encargados de defender al organismo frente a células y sustancias extrañas, y agentes infecciosos. Se distinguen neutrófilos, eosin...

Introducción ============ Los leucocitos son células sanguíneas nucleadas y carentes de pigmentos que se originan en la medula osea y en el tejido linfático, y son los encargados de defender al organismo frente a células y sustancias extrañas, y agentes infecciosos. Se distinguen neutrófilos, eosinófilos, basófilos, linfocitos y monocitos. Los leucocitos son capaces de salir de los vasos sanguíneos hacia los tejidos mediante diapédesis. Algunos son capaces de evolucionar en los tejidos: los monocitos se transforman en macrófagos y los linfocitos B en células plasmáticas. Leucopoyesis ============ Es el proceso de producción y maduración de leucocitos. Proceso evolutivo ----------------- Tiene lugar en cuatro compartimentos: *células madre, células progenitoras, células precursoras y leucocitos maduros*. Las células madre y las progenitoras se localizan en la médula ósea y son indistinguibles, aunque si se pueden diferenciar mediante citometría de flujo. En la evolución de la serie blanca se distinguen dos procesos: 1. **Linfopoyesis:** proceso de producción de linfocitos, en el que una célula madre linfoide da lugar a progenitores linfoides pre-B y pre-T. La diferenciación y maduración de los linfocitos B y células NK se lleva a cabo en la medula osea; los linfocitos T, en el timo. 2. **Mielopoyesis:** proceso de producción de las células sanguíneas excepto linfocitos. Tiene lugar en el compartimento de las células progenitoras, en el que, como respuesta a diversas citoquinas, se diferencian progenitores específicos de cada tipo celular. ### Células precursoras Son reconocibles por su morfología en frotis de medula osea mediante microscopía óptica, y se diferencian los cinco tipos de leucocitos. Las tres series que originan los granulocitos (neutrófilos, eosinófilos y basófilos) se componen de las mismas células precursoras, por lo que, realmente, se puede hablar de tres tipos de series precursoras: *precursores granulocíticos, precursores monocíticos y precursores linfoides*. #### Precursores granulocíticos Cada serie está constituida por cinco células precursoras: mieloblasto, promielocito, mielocito, metamielocito y cayado. Los mieloblastos y los promielocitos no poseen gránulos secundarios específicos, por lo que no se pueden distinguir los que van a originar neutrófilos, eosinófilos o basófilos. Los demás se diferencian los de cada serie por las propiedades tintoriales de sus granulaciones secundarias. #### Precursores monocíticos La serie la constituyen dos precursores: monoblasto y promonocito. #### Precursores linfoides El precursor principal es el linfoblasto (B o T). ### Células maduras Los precursores leucopoyéticos generan los leucocitos circulantes (cuarto compartimento), se pueden clasificar: 1. **Según la línea evolutiva:** 1. [Células mieloides:] granulocitos y monocitos. En los tejidos, los monocitos se transforman en macrófagos. 2. [Células linfoides:] linfocitos B y T, y células NK. En los tejidos, los linfocitos B evolucionan a células plasmáticas. - *T cooperadores o CD4+: coordinan la respuesta inmune celular y humoral mediante citoquinas.* - *T citotóxicos o CD8+: destruyen células infectadas por virus, células tumorales...* *\***Órganos linfoides primarios**: timo, bolsa de Fabricio (aves) y médula ósea; **Órganos linfoides secundarios**: bazo, ganglios linfáticos, médula ósea y tejido linfoide asociado a intestino, aparato respiratorio y a las mucosas.* 2. **Según la morfología nuclear y las granulaciones citoplasmáticas:** 3. [Granulocitos:] tienen el núcleo dividido en lóbulos y presentan granulaciones, son los neutrófilos, basófilos y eosinófilos. 4. [Agranulocitos:] tienen el núcleo sin lobular y carecen de granulaciones (excepto las NK), son los linfocitos B, linfocitos T, monocitos y células NK. Funciones de los leucocitos --------------------------- 1. **Neutrófilos:** fagocitan las bacterias; los restos de la digestión y los neutrófilos muertos forman el pus. Procesos infecciosos. 2. **Eosinófilos:** intervienen en reacciones alérgicas y antiparasitarias. 3. **Basófilos:** liberan histamina y heparina en las reacciones alérgicas. Procesos inflamatorios. 4. **Linfocitos T:** intervienen en la respuesta inmunológica mediada por células. Pueden ser: 5. [Linfocitos T citotóxicos o T8:] pueden matar células. 6. [Linfocitos T cooperadores o T4:] colaboran con los linfocitos B. 5. **Linfocitos B:** intervienen en la respuesta inmunológica mediada por anticuerpos, transformándose en células plasmáticas, que liberan anticuerpos. 6. **Células NK:** intervienen en la inmunidad antitumoral. 7. **Monocitos:** se transforman en macrófagos, con capacidad fagocítica. Alteraciones cuantitativas y funcionales de los leucocitos ========================================================== El recuento normal oscila entre 4 y 10 ∙ 10^3^/µL. Las alteraciones en el recuento se denominan: 1. **Leucocitosis:** valores de leucocitos por encima de los valores normales, causada por infecciones bacterianas, algunas víricas y neoplasias hematológicas. Un tipo especial es la **reacción leucemoide**. 2. **Leucopenias:** valores de leucocitos por debajo de los valores normales, causada por infecciones bacterianas graves, en víricas, y en procesos neoplásicos hematológicos. Las que tienen mayor importancia son la **neutropenia** y la **agranulocitosis**. Existen tambien patologías asociadas a déficits funcionales de los leucocitos, que ocasionan trastornos en la respuesta inmunitaria, por lo que se denominan **inmunodeficiencias**. Éstas pueden ser debidas a defectos de la fagocitosis. Reacción leucemoide ------------------- Es un aumento del recuento de leucocitos por encima de 50 ∙ 10^3^/µL con presencia de células inmaduras en sangre periférica, y no es causada por proceso neoplásicos. Existen tres tipos de reacción leucemoide: 1. **Mieloide:** es la más frecuente, se caracteriza por una neutrofilia con desviación izquierda (presencia de cayados, metamielocitos, mielocitos, promielocitos y mieloblastos), granulación toxica y neutrófilos vacuolados. Lo más habitual es que se produzcan por infecciones bacterianas, pero tambien se observan en anemias hemolíticas severas. 2. **Linfoide:** es una linfocitosis absoluta con presencia de linfocitos atípicos y células inmaduras. Se observa en algunas infecciones víricas, como la mononucleosis infecciosa, y tras ciertas vacunas. 3. **Monocitoide:** es la más rara y se observa en algunas parasitosis. Si hay confusión con una leucemia, se realiza un diagnóstico diferencial: examen morfológico, técnicas citoquímicas y citometría de flujo. Neutropenia y agranulocitosis ----------------------------- La neutropenia es el recuento de neutrófilos por debajo de los valores normales (\1,0 ∙ 10^3^/µL; sin embargo, \10%). Las células neoplásicas producen una inmunoglobulina monoclonal que puede detectarse en suero mediante un proteinograma. En orina de 24 horas se pueden detectar tambien cadenas ligeras monoclonales, lo que se conoce como proteinuria de Bence-Jones. En hematología se debe realizar un examen citomorfológico de médula ósea. La citometría de flujo permite comprobar la clonalidad de las células plasmáticas neoplásicas, diferenciándolas de las normales, bien por la pérdida de expresión de antígenos normales, bien por la expresión de antígenos no habituales. Los estudios genéticos tienen también importancia pronóstica, pero en este caso suele aportar más información la FISH que el cariotipo convencional. Estudio de la serie blanca en el laboratorio de hematología =========================================================== Alteraciones cuantitativas, morfológicas y funcionales de los leucocitos ------------------------------------------------------------------------ ### Alteraciones cuantitativas: Hemograma 1. **Recuento de leucocitos:** expresado como numero de leucocitos en miles/µL de sangre. 2. **Fórmula leucocitaria:** recuento diferencial de los 5 tipos de leucocitos + LUC. 3. **Índice de lobularidad:** da información de la proporción de leucocitos polimorfonucleares y mononucleares y detecta posibles desviaciones a la izquierda. \ [**IL** **ARNETH** **=** **Nº** **DE** **LOBULOS** **CONTADOS/Nº** **DE** **NEUTROFILOS** **CONTADOS**]{.math.display}\ Imagen que contiene Interfaz de usuario gráfica Descripción generada automáticamente ### Alteraciones morfológicas #### Alteraciones morfológicas del núcleo ##### Corpúsculo de Barr Son apéndices nucleares en palillo de tambor que corresponden al cromosoma X y se unen a uno de los lóbulos del núcleo. Sólo podemos observarlo en neutrófilos de hembras. ##### Neutrófilos hipersegmentados y en cintas El núcleo tiene más de 2-5 lóbulos, y son típicos en anemias megaloblásticas y en algunos síndromes mielodisplásicos. Si presentan más de 5 lóbulos se denominan pleocariocitos de Pittaluga. ##### Núcleo en anillo Hiposegmentación que se observa en síndromes mielodisplásicos y mieloproliferativos. Se produce en procesos sépticos (daño máximo). ##### Anomalía de Pelter-Huët Los núcleos de los neutrófilos presentan solo uno o dos lóbulos. Es una alteración hereditaria, o se puede producir de forma secundaria a infecciones, neoplasias o síndromes mielodisplásicos (pseudo-Pelger). ##### Núcleo cerebriforme Ocurre en linfocitos, en el síndrome de Sézary (micosis fungoide) y en el linfoma de células T. #### Alteraciones morfológicas del citoplasma ##### Cuerpos de Döhle Son zonas ovaladas de color azul pálido y situación excéntrica que se observan en el interior de los neutrófilos. Se forman en infecciones, quemaduras y otras situaciones. ##### Granulación tóxica Es un refuerzo de la granulación, que normalmente presentan los granulocitos. Se relaciona con infecciones bacterianas, quemaduras y otras circunstancias. ##### Linfocitos y neutrófilos vacuolados Suele indicar infección. ##### Células peludas o vellosas Son linfocitos con proyecciones citoplasmáticas que tienen aspecto de pelos. Aparece en la leucemia de células peludas o tricoleucemia. ##### Bastones o cuerpos de Auer Son agrupaciones de gránulos con forma de agujas de color rojo-malva. Se encuentran en los blastos de la leucemia aguda megaloblástica. ##### Manchas de Gumprecht Son linfocitos destruidos debido a su fragilidad, sin núcleos ni membranas. Son típicas de la leucemia linfática crónica. ### Alteraciones funcionales Se realizan dos pruebas específicas para diagnosticar la enfermedad granulomatosa crónica (EGC): 1. **Prueba del nitroazul de tetrazolio** (NBT): se estimulan los neutrófilos con acetato de forbol miristato (PMA) y se incuban con nitroazul de tetrazolio. Los fagocitos normales reducen el NBT a formazán y se vuelven azules. Los fagocitos alterados no son capaces de reducirlo y se quedan incoloros. **\ ** 2. **Test citométrico de la dihidrorodamina:** se basa en la capacidad de los fagocitos normales de oxidar la dihidrorodamina a rodamina, que es fluorescente y puede ser medida en un citómetro de flujo. Las normales provocan fluorescencia, las alteradas no. Estudio de las leucemias ------------------------ El diagnostico requiere analizar las células neoplásicas de la sangre periférica, medula osea y otros tejidos, como ganglios o LCR. ### Hemograma El valor normal de los leucocitos es 3,9-10,2∙10^3^/µL. Se detecta leucocitosis en más del 50% de los pacientes; en el 20% la cifra de leucocitos excede los 100∙10^3^/µL, normalmente con predominio de blastos. La mayoría de los pacientes presentan anemia normocítica arregenerativa y son frecuentes la neutropenia y la trombopenia. ### Frotis de médula ósea y sangre periférica Teñidos con tinciones convencionales, como May-Grünwald o Wright. Las muestras de medula se obtienen mediante aspiración y biopsia. El criterio más determinante para el diagnóstico es el porcentaje de blastos, que se calcula contando 200 células nucleadas (en sangre periférica) o 500 células nucleadas no eritroides (medula osea). Se estima que hay leucemia cuando la población de blastos en medula osea es superior al 20%. Son contados como blastos los mieloblastos, los linfoblastos, los monoblastos, los promonocitos, y los megacarioblastos (pero no megacariocitos displásicos). ### Citoquímica Permite diferenciar el linaje celular, facilitando la filiación de la leucemia según la clasificación FAB. Las tinciones citoquímicas que aportan más información son: 1. **Tinción de PAS:** Es una tinción especial de médula ósea (eritroleucemia y LAL son PAS positivas). En las células monocitoides y mieloides maduras, en cambio, la positividad citoplasmática es más uniforme. 2. **Mieloperoxidasa:** es positiva en las células mieloides y negativa en las linfoides. Algunas mieloides muy inmaduras son mieloperoxidasa-negativas, por lo que su identificación debe realizarse con marcadores inmunofenotípicos. 3. **Fosfatasa ácida:** es positiva en la leucemia de células vellosas y en la LAL 4. **Inmunocitoquímica:** el uso de paneles de anticuerpos dirigidos contra marcadores específicos de linaje celular, diferenciación y maduración permite obtener el inmunofenotipo de las células neoplásicas y clasificarlas. ### Citometría de flujo Permite clasificar de manera precisa las neoplasias hematológicas con base en el inmunofenotipo de las células tumorales. Se basa en la utilización de anticuerpos contra antígenos celulares específicos de membrana, nucleares o citoplasmáticos. Presenta dos ventajas: su sensibilidad (capaz de detectar una célula entre 100000) y que permiten analizar simultáneamente la expresión de varios marcadores en la misma célula. La única limitación es que requiere material fresco, sin fijar, y se puede aplicar a sangre periférica, aspirados de medula osea, biopsias, fluidos biológicos y material obtenido mediante punción-aspiración con aguja fina. #### Fundamento La citometría de flujo es una metodología de análisis de partículas en suspensión que se hacen pasar alineadas una a una por delante de un haz luminoso laser monocromático, generando una serie de señales que aportan información sobre la naturaleza de la partícula: 1. **La dispersión frontal de la luz (FSC):** se produce cuando el haz laser incide sobre la célula depende del tamaño de la célula. Un detector recoge esta FSC y la transforma en una señal eléctrica proporcional al tamaño de la célula. 2. **La dispersión lateral de la luz (SSC):** se produce cuando el haz laser incide sobre la célula depende de propiedades físicas intrínsecas de la célula (complejidad celular) y, en particular, de la granularidad citoplasmática. Un detector recoge esta SSC y la transforma en una señal eléctrica proporcional a la complejidad de la célula. 3. **La intensidad de la fluorescencia** que se detecta es proporcional a la cantidad de marcaje presente en la célula (densidad antigénica). En los citómetros que tienen varios canales, se marca la célula simultáneamente con varios anticuerpos conjugados con distintos fluorocromos que emiten luz de distintas longitudes de onda. Cada canal las recoge y analiza, con lo que un solo laser puede detectar varios antígenos simultáneamente en una misma célula. Para cada muestra se analizan mínimo 10000-20000 células (eventos), que son analizadas mediante software. Se presentan los datos como gráficos de dos variables en los que cada célula se representa como un punto (presenta una nube de puntos, que el software delimita y cuantifica grupos de puntos de cada población celular. Los gráficos bidimensionales pueden combinar un marcador fluorescente con la FSC o SSC, o pueden combinar dos marcadores fluorescentes. #### Procedimiento Las muestras de sangre periférica y médula ósea deben estar anticoaguladas con EDTA, el resto de las muestras no hace falta. Cada laboratorio tiene protocolos estandarizados, y habitualmente se usan tablas de anticuerpos que cubren las distintas neoplasias. Éstos combinan los anticuerpos conjugados con fluorocromos, que cubren todos los marcadores necesarios para establecer un diagnóstico. #### Aplicaciones 1. **Diagnóstico y clasificación de las neoplasias** con base en el inmunofenotipo de la población tumoral, que permite distinguir: - [El linaje mieloide o linfoide] de las células neoplásicas. - [El estado madurativo (precursor o célula madura)] de las células neoplásicas. - [La naturaleza B o T] de las neoplasias linfoides. - [La estirpe (granulocítica, monocítica, megacariocítica o eritroide] de las neoplasias mieloides. 2. **Monitorización de los pacientes tras el diagnóstico** para detectar la enfermedad mínima residual, evaluar la respuesta al tratamiento quimioterápico o al trasplante de médula ósea. ### Citogenética Las alteraciones cromosómicas se asocian con las neoplasias hematológicas, tanto cuantitativas como estructurales. La citogenética aporta información tanto para la clasificación, como para el pronostico y evolución. El estudio citogenético se basa en la obtención del cariotipo de la población celular neoplásica. En las leucemias está indicada al diagnóstico, a los 30 días de la terapia de inducción de remisión y tras el tratamiento de consolidación. Si se detecta una alteración que se puede seguir por FISH, no es necesario repetir el estudio. Los mejores resultados se obtienen con muestras de médula ósea o sangre periférica anticoaguladas con heparina sódica. La elección de una muestra u otra dependerá de la neoplasia en estudio. ### Hibridación *in situ* fluorescente (FISH) Es una técnica de biologia molecular que detecta alteraciones cromosómicas numéricas y estructurales. El principal inconveniente es la limitación de sondas comerciales, solo disponibles para las alteraciones frecuentes. Presenta varias ventajas con respecto a la citogenética: 1. **Mayor sensibilidad:** - [Detección de células neoplásicas] que representan un porcentaje muy bajo respecto al total de células presentes en la muestra. - [Detección de anomalías estructurales] con un tamaño inferior al límite de detección de la citogenética. 2. **Mayor rapidez:** no es necesario cultivar la muestra ni envejecer las preparaciones. #### Fundamento La técnica se basa en la utilización de sondas de ácidos nucleicos conjugadas con fluorocromos, complementarias de una región concreta del ADN. Se requiere un microscopio de fluorescencia para visualizar el resultado, y hay que contar mínimo 200 núcleos. La FISH se realiza a partir de muestras de médula ósea o sangre periférica anticoagulada con heparina de litio. ### Otras pruebas de biología molecular En el caso de las mutaciones puntuales, las microdeleciones y las microinserciones, se utiliza la PCR a tiempo final y a tiempo real, la secuenciación y el análisis de fragmentos. No se utilizan sólo en el análisis de neoplasias, sino que también se extiende a la confirmación de resultados de citogenética o FISH no concluyentes y a la detección de la enfermedad mínima residual.