Tema 16. Técnicas no Cromatográficas. Electroforesis PDF

ANÁLISIS QUÍMICO II BLOQUE III TEMA 16 ELECTROFORESIS CAPILAR TEMA 16: ELECTROFORESIS CAPILAR Contenidos 16.1 Introducción 16.2 Instrumentación 16.3 Fundamento teórico la Electroforesis Capilar 16.4 Aplicaciones analíticas ❑ Cuantitativa ❑ Cualitativa...

ANÁLISIS QUÍMICO II BLOQUE III TEMA 16 ELECTROFORESIS CAPILAR TEMA 16: ELECTROFORESIS CAPILAR Contenidos 16.1 Introducción 16.2 Instrumentación 16.3 Fundamento teórico la Electroforesis Capilar 16.4 Aplicaciones analíticas ❑ Cuantitativa ❑ Cualitativa 16.5 Modalidades de la Electroforesis Capilar TEMA 16: ELECTROFORESIS CAPILAR 16.1 Introducción La ELECTROFORESIS CAPILAR (CE) es una técnica separativa que se desarrolla dentro de un capilar y se basa en la migración diferencial de partículas cargadas en solución al ser sometidas a la acción de un campo eléctrico. La CE es importante en la industria e investigación:  TEMA 16: ELECTROFORESIS CAPILAR 16.1 Introducción Características: ❑ La separación se realiza en un capilar de sílice fundida. ❑ Se utilizan campos eléctricos elevados en la separación ❑ Se necesita menor tiempo y menor consumo de reactivos ❑ Es una técnica simple y fácil de automatizar. ❑ Permite determinaciones simultáneas de varios compuestos (cationes, aniones y neutros). ❑ La detección se puede realizar en línea. TEMA 16: ELECTROFORESIS CAPILAR 16.2 Instrumentación Esquema: Capilar COMPONENTES: ❑ Capilar ❑ Tampón de separación ❑ Fuente de Alto Voltaje ❑ Sistema de inyección de la muestra ❑ Sistemas de Detección ❑ Registro de la señal TEMA 16: ELECTROFORESIS CAPILAR 16.2 Instrumentación ❑ Capilar de Sílice Fundida: 1.- Propiedades ideales - Química y eléctricamente inerte - Transparente a la radiación UV-Vis - Robusto a la vez que flexible (recubierto de poliimida) - Barato 2.- Características de los capilares (i.d. (20-200 µm), e.d., longitud efectiva y total (15- 100 cm) 3.- Acondicionamiento del capilar por presión (elimina compuestos adsorbidos a superficie interna y genera superficie fresca por desprotonación de grupos SOH - flujo constante y consistente) 4.- Termostatización del capilar (por aire o por líquido refrigerante) 5.- Almacenamiento del capilar (lavado con H2O y secado al aire – evita cristalización tampón y obstrucción capilar) TEMA 16: ELECTROFORESIS CAPILAR 16.2 Instrumentación ❑ Tampón de separación: Condiciones que debe reunir un buen buffer: Parámetros químicos a controlar: ❑ Alta capacidad de tamponamiento al pH 1.- pH de separación ❑ Que su pH muestre pequeñas 2.- Concentración variaciones con la temperatura 3.- Conductividad ❑ Ser transparente a la radiación UV-Vis ❑ Baja conducción de corriente eléctrica 4.- Aditivos que modifican la selectividad ❑ No influir negativamente sobre la - Adición de disolventes orgánicos separación - Adición de surfactantes, selectores quirales TEMA 16: ELECTROFORESIS CAPILAR 16.2 Instrumentación ❑ Fuente de Alto Voltaje: ▪ De corriente continua ▪ Conectada a dos electrodos de platino ▪ Capaz de trabajar en modo de intensidad constante (< 100 μA) y voltaje constante ▪ Capaces de aplicar un voltaje entre 1 y 30 kV (según electrolito, i.d. capilar y analitos) ▪ Capaz de cambiar la polaridad de los electrodos ▪ Capaz de aplicar potencial en forma de rampa programada TEMA 16: ELECTROFORESIS CAPILAR 16.2 Instrumentación ❑ Sistema de inyección de la muestra: Modos de inyección: 1. Inyección hidrodinámica 2. Inyección electrocinética Se inyectan volúmenes pequeños (10-100 nL) TEMA 16: ELECTROFORESIS CAPILAR 16.2 Instrumentación ❑ Sistemas de detección: Tipo de detector LOD (mol L-1) Absorción UV-Vis (universal, DAD espectro) 10-5 - 10-8 Fluorescencia 10-7 - 10-9 (sensible, derivatización) Fluorescencia inducida por láser 10-14- 10-16 Amperométricos 10-10- 10-11 (sensible, selectivo, modificaciones electrónicas y capilar) Conductimétricos 10-7 - 10-8 (universal, modificaciones electrónicas y capilar) Indirectos Espectrometría de masas 10-8 - 10-9 (sensible, info. estruct., acoplamiento complejo) Otros (radiométricos, índice refracción, etc.) - TEMA 16: ELECTROFORESIS CAPILAR 16.2 Instrumentación ❑ Sistemas de detección (Interfases): CE-UV-Vis: CE-MS: TEMA 16: ELECTROFORESIS CAPILAR 16.2 Instrumentación ❑ Registro de la señal: Electroferograma: Representación de respuesta del detector de cada analito en función del tiempo de migración. Parámetros determinantes en la separación: señal 1. Tiempo de migración: tiempo que tarda un analito en recorrer la longitud efectiva del capilar. Tm (min) 𝑳𝑫 𝑳 𝒕𝒎 = ൘𝝁 𝑽 𝒂𝒑 2  t  2 t  2. Eficiencia (N): N = 16 R  N = 5.54 R     1/ 2  3, Selectividad: capacidad del sistema para separar solutos que están próximos entre sí (pH, fuerza iónica, selección tampón, aditivos): t R2 − t0 K 2  1, 2 = = 1 t R1 − t 0 K1 (t R 2 − t R1 ) 2(t R 2 − t R1 ) Rs = = 4, Resolución: indica lo bien separados que están dos compuestos: ( 2 + 1 ) / 2 ( 2 + 1 ) TEMA 16: ELECTROFORESIS CAPILAR 16.3 Fundamento teórico de la Electroforesis Capilar Ionización de los grupos silanoles: (pH ≥ 3) SiOH ⇋ SiO- + H+ Capilar ❑Los grupos silanol son fácilmente ionizables cerca del pH 4 ❑La pared del capilar estará cargada negativamente ❑La cantidad de cargas es controlada por el pH del buffer 13 TEMA 16: ELECTROFORESIS CAPILAR 16.3 Fundamento teórico de la Electroforesis Capilar FLUJO ELECTRSMOTICO O ELECTROÓSMOSIS: Modelo de Sterm …Fenómeno que se produce al aplicar un campo eléctrico a un sistema líquido en contacto con una superficie cargada. Ánodo Capilar Cátodo Doble Capa Doble Capa Muestra Fija o Rígida Difusa (rica cationes) 𝜺 : Cte. Dieléctrica electrolito 𝛏 : Potencial Zeta 𝛈: 𝐕𝐢𝐜𝐨𝐬𝐢𝐝𝐚𝐝 𝐝𝐞𝐥 𝐦𝐞𝐝𝐢𝐨 Flujo Electroosmótico MOVILIDAD DEL FLUJO 𝜺𝝃 µfeo = ELECTRSMOTICO (µfeo): 𝟒𝝅𝜼 14 TEMA 16: ELECTROFORESIS CAPILARMOVILIDAD Total o aparente (µa o µt): 16.3 Fundamento teórico de la Electroforesis Capilar ❑ 𝐂𝐮𝐚𝐧𝐝𝐨 𝐬𝐞 𝐢𝐧𝐭𝐫𝐨𝐝𝐮𝐜𝐞 𝐮𝐧𝐚 𝐦𝐮𝐞𝐬𝐭𝐫𝐚 𝐞𝐧 𝐞𝐥 𝐜𝐚𝐩𝐢𝐥𝐚𝐫 𝐲 𝐬𝐞 𝐚𝐩𝐥𝐢𝐜𝐚 𝐮𝐧𝐚 𝐝𝐢𝐟𝐞𝐫𝐞𝐧𝐜𝐢𝐚 𝐝𝐞 𝐩𝐨𝐭𝐞𝐧𝐜𝐢𝐚𝐥, los solutos iónicos se van a desplazar hacia el capilar debido a dos razones ∶ 1. Por un lado, Feo que arrastra todo el seno de la disolución y por lo tanto va a arrastrar también los solutos iónicos. 2. Por otro lado, la propia carga del soluto muestra una movilidad que llamamos movilidad electroforética (𝝁𝒆) 𝑞 𝒒: carga del analito 𝝁𝒂 = 𝝁𝒇𝒆𝒐 + 𝝁𝒆 : Velocidad aparente o total: 𝜇𝑒 = 6 𝜋 𝜂𝑟 𝛈: 𝐕𝐢𝐜𝐨𝐬𝐢𝐝𝐚𝐝 𝐝𝐞𝐥 𝐦𝐞𝐝𝐢𝐨 𝐫: 𝐑𝐚𝐝𝐢𝐨 𝐝𝐞𝐥 𝐚𝐧𝐚𝐥𝐢𝐭𝐨 𝛍𝐞 Ánodo: Cátodo: 𝛍𝐚(𝐜𝐚𝐭𝐢𝐨𝐧𝐞𝐬) = 𝛍𝐟𝐞𝐨 +𝛍𝐞 𝛍𝐚(𝐞𝐬𝐩𝐞𝐜𝐢𝐞𝐬 𝐧𝐮𝐞𝐭𝐫𝐚𝐬) = 𝛍𝐟𝐞𝐨 𝛍𝐚(𝐚𝐧𝐢𝐨𝐧𝐞𝐬) = 𝛍𝐟𝐞𝐨 - 𝛍𝐞 15 TEMA 16: ELECTROFORESIS CAPILAR 16.3 Fundamento teórico de la Electroforesis Capilar CONTROL DEL FLUJO ELECTRSMOTICO O ELECTROÓSMOSIS: 𝜀𝜉 𝜺 : Cte. Dieléctrica electrolito µfeo = v FEO =  FEO E 4𝜋𝜂 𝛏 : Potencial Zeta 𝛈: 𝐕𝐢𝐜𝐨𝐬𝐢𝐝𝐚𝐝 𝐝𝐞𝐥 𝐦𝐞𝐝𝐢𝐨 1.- Campo eléctrico (> E → > VFEO) 2.- pH del tampón de separación (> pH → desprotonación de SiOH → densidad de carga → > potencial Z →> VFEO) 3.- Fuerza iónica del tampón (> [iones], Tª, <  → > VFEO) 5.- Adición de disolventes orgánicos:10-20% MeOH, EtOH, IsoOH ↓ VFEO 10-20% ACN ↑ VFEO 6.- Recubrimiento pared interna capilar (ej. trimetilclorosilano): supresión FEO TEMA 16: ELECTROFORESIS CAPILAR 16.4 APLICACIONES ANALÍTICAS de la Electroforesis Capilar Análisis cualitativo – tiempo de migración Electroferograma de muestra: Electroferograma del patrón: Análisis cuantitativo – curva de ❑ Determinación de pequeños iones (en aguas, productos farmacéuticos o fluidos calibración biológicos). ❑ Compuestos farmacéuticos: sulfamidas, penicilinas, cefalosporinas, analgésicos, barbitúricos, vitaminas, etc. (en productos farmacéuticos y fluidos biológicos). ❑ Herbicidas y pesticidas (alimentos y aguas). ❑ Análisis de carbohidratos. ❑ Separación de Isómeros (en la industria farmacéutica). ❑ Análisis clínico: fármacos y drogas de abuso. ❑ Análisis Biológico: determinación de aa’, péptidos, proteínas, oligonucleótidos, ácidos nucleicos, separación de bacterias (donde se ha conseguido separar bacterias específicas de una determinada colonia para estudiar la distribución de microorganismos de una población mixta). TEMA 16: ELECTROFORESIS CAPILAR 16.5 Modos de separación en Electroforesis Capilar ❑ Modos electroforéticos: 1. Electroforesis capilar en zona (CZE). 2. Electroforesis capilar de enfoque isoeléctrico (CIEF). 3. Isotacoforesis capilar (CITP). 4. Electroforesis capilar en gel (CGE) ❑ Modos Cromatográficos: 5. Cromatografía micelar electrocinética (MECK) 6. Electrocromatografía capilar (CEC) TEMA 16: ELECTROFORESIS CAPILAR 16.5 Modos de separación en Electroforesis Capilar ❑ Modos electroforéticos: 1.Electroforesis capilar en zona (CZE). POSIBLE INVERSIÓN DE FLUJO POR ADICIÓN DE ADITIVOS: CÁTODO ➜ ÁNODO TEMA 16: ELECTROFORESIS CAPILAR 16.5 Modalidades de la Electroforesis Capilar ❑ Modos electroforéticos: 2. Electroforesis capilar de enfoque isoeléctrico (CIEF) 1. Los solutos se separan en poliacrilamida metilcelulosa Detección base a sus Puntos 2.- Enfoque Isoeléctricos 1.- Carga Detección H3PO4 NaOH 2. Se aplica a la separación de Muestra Ánodo Cátodo proteínas y de compuestos con (Anfolitos) + - valores muy diferentes de sus puntos isoeléctricos (p.ej. 3.- Movilización Detección hormonas crecimiento). H3PO4 H3PO4 3. Se realiza en ausencia de Ánodo Cátodo FEO. + -  TEMA 16: ELECTROFORESIS CAPILAR 16.5 Modalidades de la Electroforesis Capilar ❑ Modos electroforéticos: 1.- Cationes y Aniones NO se pueden separar simultáneamente. 3. Isotacoforesis capilar (CITP). 2.- La separación se realiza a 1.- Carga Detección 2.- Separación Detección Intensidad de corriente constante 3 2 1 3.- La separación se realiza en Cátodo Tampón frontal Ánodo Muestra ausencia de FEO. Tampón terminal Muestra (aniones) 4.- La muestra se va a mover Isotacoferograma entre dos tampones de diferente conductividad (tampón frontal y Señal tampón terminal) 1 2 3 0.0 4.0 8.0 Minutos TEMA 16: ELECTROFORESIS CAPILAR 16.5 Modos de separación en Electroforesis Capilar ❑ Modos electroforéticos: 4. Electroforesis capilar en gel (CGE) ❑ El capilar se rellena con un gel que actúa como un tamiz molecular. ❑ Se realiza en ausencia de FEO. ❑ Separación se basa en la diferencia de los tamaños de las especies a separar ❑ Se emplea fundamentalmente para separar macromoléculas como proteínas y ácidos nucleicos. TEMA 16: ELECTROFORESIS CAPILAR 16.5 Modos de separación en Electroforesis Capilar ❑ Modos Cromatográficos: 5. Cromatografía micelar electrocinética (MECK) ❑ Se usa buffer y tensoactivos (sufractantes) cargados que Grupo catiónico hidrofílico permite formar micelas en una concentración micelar critica. Grupo aniónico hidrofílico 𝛍𝐞 ❑ Combina los mecanismos de separación de la 𝛍𝐞 cromatografía y de la electroforesis, separando solutos en base al reparto de éstos entre las micelas y el electrolito de separación. ❑ Separa analitos neutros y cargados ❑ Compuestos hidrofílicos eluyen con el FEO Cátodo Ánodo ❑ Compuestos hidrofóbicos eluyen con la micela Grupo hidrofóbico Clasificación de los surfactantes: Aniónicos (grupos sulfónicos o carboxílicos) Catiónicos (grupos de alquilamonio) Anfolíticos y no iónicos TEMA 16: ELECTROFORESIS CAPILAR 16.5 Modos de separación en Electroforesis Capilar ❑ Modos Cromatográficos: Detección 6. Electrocromatografía capilar (CEC) + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + ++ + + + + + + + + + + +++ ++ ++ + + + + + ++ + + + + + ++ ++ + + ++ + + + +++ + + +++ + + + + + ++ + ++ + + +++ + + ++ ++ + + ++++ + + + + + + + + + + + + + + ++ + + + + ++ + ++ + + + + ++ + + + + + + + ++ + + + + ++ + + + + ++ + + + + ++ ++ ++ + + + ++ + + + + + + ++++ ++ + + + ++ + + + ++ + + + + + ++ + ++ + + + + + ++ + + + + + + ++ + + + + + + +++ ++ + ++ + + ++++ ++ + + ++ + + + + + + ++ + + + + EOF ++ + + + ++ + + + ++ ++ + + + ++ + + + + ++ + + + + + + + + ++ ++ + + + ++ + + + + ++ + ++++ + ++ + + ++ + + + + ++ + + + + + + + + + + + ++ ++ +++ ++ + + + + + + ++ + + + + + + ++ + + + ++ + ++ + + + + ++ ++ ++ + + + + + ++ + + + + + + + + + + + + + + + + ++ + + ++ ++ + + + + ++ + + ++ ++ + ++ + + + + + + + + + + + + + ++ + + + ++ + + + ++ + + + ++ + + + ++ + + + ❑ Utiliza capilares de sílice rellenos con fase estacionaria ❑ Separa analitos neutros y cargados ❑ Se aplica un campo eléctrico a través del capilar ❑ Elevado poder de resolución porque combina los mecanismos de separación de HPLC en base al reparto y de la electroforesis en base a la migración de los analitos.