Electroforesis - Past Paper - Sesión 20/01/2022 PDF

 Electroforesis Es una técnica Separativa que se emplea para separar ácidos nucleicos y las proteínas. La separación de las macromoléculas depende de 2 variables : carga y masa. Se separan en función de su velocidad de migración cuando se encuentran sometidas a l...

 Electroforesis Es una técnica Separativa que se emplea para separar ácidos nucleicos y las proteínas. La separación de las macromoléculas depende de 2 variables : carga y masa. Se separan en función de su velocidad de migración cuando se encuentran sometidas a la acción de un campo eléctrico→ la corriente eléctrica de un electrodo repele las moléculas al tiempo que el otro electrodo las atrae Sesión 20/01/2022 2 Sesión 20/01/2022 3  Electroforesis La mayoría de las biomoléculas: Poseen una carga eléctrica cuya magnitud depende del pH del medio en el que se encuentran. Como consecuencia, pueden desplazarse cuando se ven sometidas a un campo eléctrico hacia el polo de carga opuesta al de la molécula. También actúa la fuerza de fricción de el gel de agarosa través del cual pasa el ADN y hará que se separen las moléculas en función de su tamaño Sesión 20/01/2022 4  Electroforesis Por lo tanto, en una electroforesis, los ácidos nucleicos como tienen carga negativa migrarán hacia el polo positivo o el ánodo. El principio de la electroforesis consiste en la migración proporcional de las moléculas a través de un gel u otro tipo de matriz porosa, según su peso molecular o tamaño; movimiento generado por el campo eléctrico. Sesión 20/01/2022 5  Electroforesis Durante la electroforesis las macromoléculas son empujadas a través de los poros y su tasa de migración depende de ciertos factores: 1. Características del campo eléctrico(diferencia de potencial y gradiente entre los 2 electrodos) 2. Características de la molécula a separar (tamaño, carga y forma) 3. Características del medio(tamaño del poro, fuerza iónica del tampón, temperatura y viscosidad del medio) Sesión 20/01/2022 7  Electroforesis Como la mayor parte de la potencia que libera la electroforesis es en forma de calor, esto puede producir estos efectos perjudiciales: 1. Aumento de la tasa de difusión: de los iones de la muestra y el tampón→ ensanchamiento de las muestras 2. Formación de corrientes de convección (mezcla de muestras) 3. Inestabilidad térmica de las muestras: son sensibles al calor 4. Disminuye la viscosidad del tampón: por lo que se reduce la resistencia al medio Sesión 20/01/2022 8 Electroforesis La separación de acs nucleicos se puede realizar en gel de agarosa o de acrilamida. Los geles de agarosa se pueden hacera distintas concentraciones: Los geles más concentrados→ tamaño poro más pequeño por lo tanto separan mejor los fragmentos pequeños Los geles menos concentrados→ tamaño poro más grande por lo que separaran mejor los fragmentos grandes Sesión 20/01/2022 9  Componentes delaElectroforesis AGAROSA Polisacárido natural de cadena lineal que se extrae de algas Permiten una electroforesis rápida pero la resolución es limitada Obtención Suspensión de agarosa seca en polvo en un tampón acuoso se hace hervir la muestra hasta que se disuelve la agarosa y forma una solución transparente. Se vierte en un molde para gel donde se ha colocado el peine para formar los pocillos en los que posteriormente se introducirán las muestras Sesión 20/01/2022 1 Componentes de la Electroforesis El peine puede ser: 1. Peine Fino→ bandas bien definidas 2. Peine grueso→ que nos dará bandas de menor resolución, se retira una vez solidificado el gel y con cuidado para que no se produzcan roturas. El gel se enfría a temperatura ambiente hasta solidificar y su densidad viene determinada según la concentración de la agarosa (mas agarosa mas denso) Una concentración de un 1% es suficiente por lo general Sesión 20/01/2022 11 Sesión 20/01/2022 12 Componentes de la Electroforesis 1.Tampón o Buffer de electroforesis Éste proporciona el medio para la transmisión de la corriente eléctrica y mantiene el pH sin variaciones mientras se realiza el proceso. Es decir aporta la fuerza iónica necesaria para que aumente la conductancia y el ADN migre. 2.Tipos de buffer para electroforesis de ADN bicatenario: EDTA +tris acetato (ph 8)→TAE Con EDTA + tris borato (ph 7.5-7.8)→TBE Sesión 20/01/2022 13 Componentesde LaeLectroforesisen geLde agarosa 3.ADN marcador o marcador de peso molecular Adn de tamaño conocido en las ranuras del extremo izquierdo y derecho del gel que nos servirá como guía ya que la distancia de migración depende del peso molecular. El marcador contiene un número determinado de fragmentos conocidos lo cual facilita el poder determinar el tamaño de ADN desconocido. Y la velocidad de migración variará según la concentración de agarosa Sesión 20/01/2022 13 Componentes de la electroforesis 4.Tampón o buffer de carga El cual contiene por regla general agua sacarosa y algún colorante como cianol de xileno o azul de bromofenol, se añade junto a la muestra de ADN con tres fines: 1. Aumentar la densidad de la muestra para que la muestra caiga uniformemente en el pocillo. 2. Añadir color a la muestra. 3. Incorporar un colorante que en un campo eléctrico se desplace hacia el ánodo a una velocidad previsible. Sesión 20/01/2022 15 Sesión 20/01/2022 16 Como se hace la Electroforesis Sesión 20/01/2022 17  Electroforesis Pasos: 1. Cargamos los pocillos con la muestra introduciendo un poco la punta de la pipeta en el pocillo. 2. Se cargan ADN marcadores d tamaño conocido y un control positivo y uno negativo 3. Se tapa la cubeta de electroforesis, se conectan los cables para aplicar el voltaje adecuado. 4. El ADN migrará al polo positivo o ánodo y podremos observarla migración de las muestras por el avance del colorante del tampón de carga. Sesión 20/01/2022 18 Visualización de los ácidos nucleicos Introduciendo bromuro de etidio en el propio gel, es una sustancia que se intercala entre las Bases Nitrogenadas del ADN y emite fluorescencia al iluminarlo con luz UVA Como es una sustancia tóxica y mutagénica se suele utilizar otros colorantes fluorescentes alternativos como el Safe View que no son nocivos. Una vez terminada la electroforesis se desconectan lo cables y se introduce el gel en un transiluminador UVA y se fotografía. Sesión 20/01/2022 19 Sesión 20/01/2022 20 Sesión 20/01/2022 21 A ver si lo has entendido