PDF - Técnicas de Electroforesis: Interpretación de Resultados

BIOLOGÍA MOLECULAR Y CITOGENÉTICA Técnicas de electroforesis. Interpretación de resultados 15  / 1. Introducción, contextualización práctica 3 / 2. Técnicas de electroforesis en ge...

BIOLOGÍA MOLECULAR Y CITOGENÉTICA Técnicas de electroforesis. Interpretación de resultados 15  / 1. Introducción, contextualización práctica 3 / 2. Técnicas de electroforesis en gel 4 2.1. Gel de poliacrilamida y agarosa 4 2.2. Marcadores de peso molecular 5 2.3. Tipos de detección 5 / 3. Colorantes 5 / 4. Caso práctico 1: “Colorantes de corrida” 6 / 5. Interpretación de resultados 6 / 6. Visualización 7 / 7. Fotografiado de geles de agarosa 7 / 8. Variantes de la electroforesis. Electroforesis bidimensional 7 8.1. Electroforesis de capilaridad y en campo pulsado 8 / 9. Factores que afectan a la migración del material genético 8 / 10. Caso práctico 2: “Electroforesis capilar” 9 / 11. Resumen y resolución del caso práctico de la unidad 9 / 12. Bibliografía 10 © MEDAC ISBN: 978-84-18864-26-1 Reservados todos los derechos. Queda rigurosamente prohibida, sin la autorización escrita de los titulares del copyright, bajo las sanciones establecidas en las leyes, la reproducción, transmisión y distribución total o parcial de esta obra por cualquier medio o procedimiento, incluidos la reprografía y el tratamiento informático.  Conocer los fundamentos de la electroforesis. Identificar las diferentes técnicas de electroforesis. Conocer su utilidad en el diagnóstico molecular. Aprender a interpretar sus resultados. / 1. Introducción, contextualización práctica La electroforesis es la técnica que se sigue a la PCR. En ella, se separan moléculas a través de un campo eléctrico, por el que estas se desplazan según sus cargas eléctricas. De esta manera, se consigue aislar el material genético de otras sustancias y, entonces, se puede valorar cuál es el ADN que hemos amplificado e interpretar nuestros resultados. Es crucial conocer y dominar esta técnica pues es muy empleada, ya que la PCR es la principal técnica de los laboratorios de biología molecular. A continuación, vamos a plantear un caso práctico a través del cual podremos aproximarnos de forma práctica a la teoría de este tema. Escucha el siguiente audio donde planteamos la contextualización práctica de esta unidad, encontrarás su resolución en el apartado Resumen y Resolución del caso práctico. Fig. 1. Resultados de una electroforesis. Audio Intro. “Análisis de los resultados de PCR” https://bit.ly/3f0wZ34  TEMA 15. TÉCNICAS DE ELECTROFORESIS. INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS Biología molecular y citogenética /4 / 2. Técnicas de electroforesis en gel Las técnicas de electroforesis en gel consisten en colocar el ADN sobre un gel que será sometido a una corriente eléctrica. Esto generará un campo eléctrico y las moléculas de ADN podrán moverse a través de este gel, atendiendo a su carga eléctrica y su tamaño. Como el ADN tiene principalmente una carga negativa, se desplazará hacia el polo positivo del campo eléctrico (el ánodo). Además, cuanto menor sea el tamaño de sus partículas más rápido lo hará, ya que experimentará menos resistencia con el gel. Aunque es muy empleada para separar moléculas de ADN o ARN, también se puede emplear con otras sustancias como las proteínas o aquellas que tengan carga eléctrica. Así, la estructura del aparato que realiza la electroforesis se compone de dos polos cargados eléctricamente, un ánodo (positivo) y un cátodo (negativo), un campo por el que se desplazan las moléculas compuesto por un gel (el más empleado es el de agarosa) y unos pozos que son oquedades donde se introduce el ADN. Fig. 2. Esquema de un equipo de electroforesis en gel. Audio 1. “Electroforesis” https://bit.ly/2yIQYCy Recuerda... Una muestra con carga negativa, como es el caso del ADN, se desplazará en el gel hacia el polo positivo. 2.1. Gel de poliacrilamida y agarosa Los geles de poliacrilamida y agarosa son los geles que se emplean en las electroforesis en gel. Serán el medio por el que se desplazarán las moléculas a separar, gracias a las interacciones electrostáticas que se generan en un campo eléctrico que afecta al gel en cuestión. El gel más empleado es la agarosa, que se obtiene a partir de algas y se procesa partiendo de hojas secas del mismo, que se pulverizan y calientan en una mezcla con agua y sales (solución amortiguadora), tras lo cual se deja enfriar y forma un gel sólido, blando y con poros en su interior por los que transcurrirán las moléculas. Tiene una resolución limitada, ya que los resultados se ven difusos, pero a cambio permite electroforesis rápidas. Como hemos comentado anteriormente, otro gel empleado es la poliacrilamida, que se obtiene al polimerizar acrilamida y bisacrilamida, que según la concentración que tenga de cada uno de sus componentes tendrá una porosidad concreta, aunque siempre menor que la agarosa. Fig. 3. Estructura molecular de la poliacrilamida.  TEMA15.TÉCNICASDEELECTROFORESIS.INTERPRETACIÓNDERESULTADOS /5 MEDAC · Instituto Oficial de Formación Profesional 2.2. Marcadores de peso molecular Al realizar una electroforesis en gel sabemos que los ácidos nucleicos tienen, en general, una densidad de carga eléctrica homogénea. La diferencia entre el desplazamiento de unos u otros será fundamentalmente por su tamaño: A menor tamaño, mayor desplazamiento por el gel. A mayor tamaño, este desplazamiento será menor. De cara a interpretar y analizar los resultados, obtendremos una imagen con diferentes marcas que se corresponden al punto máximo de desplazamiento de los ácidos nucleicos. Es decir, valoramos el punto final al que se han desplazado. Esto está directamente relacionado con su peso, pero no tenemos una medición directa de esta medida. Para solventar este problema, empleamos un patrón, una guía, que son los marcadores de peso molecular. Esto no es más que unas marcas ya hechas de fragmentos de ácidos nucleicos ya conocidos. De esta manera, solo debemos comparar la marca de nuestra muestra con la de los marcadores de peso Fig. 4. Esquema de resultados de electroforesis molecular para estimar el peso aproximado del ADN que estamos analizando. en gel, con marcadores de peso molecular. 2.3. Tipos de detección Se conoce como detección o revelado a la visualización de los ácidos nucleicos que se han desplazado por el gel de la electroforesis. Para llevar a cabo esta detección o revelado existen diferentes métodos, como son: Tinción: Colorantes convencionales o fluorocromos. Ensayo enzimático: Cuando la sustancia separada es una enzima, se añaden su sustrato y cofactor y se tiñe su producto. Autorradiografía: Se marcan con isótopos los ácidos nucleicos y después se detectan mediante una técnica conocida como autorradiografía en gel. Detección con sondas: Se emplean fragmentos pequeños de ácidos nucleicos con una secuencia conocida y que van marcados con moléculas radiactivas o fluorescentes, se unen a la parte del ácido nucleico de la muestra que nos interesa y después se visualizan. Fig. 5. Detección por tinción con fluorocromo y El método más empleado es el de la tinción. observación bajo luz ultravioleta. / 3. Colorantes Como hemos indicado anteriormente, a la hora de visualizar los resultados, la técnica más empleada es la tinción. En ella, como ya sabes, se emplean sustancias que impregnan de color las estructuras que queramos ver, diferenciándolas del resto.  TEMA 15. TÉCNICAS DE ELECTROFORESIS. INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS Biología molecular y citogenética /6 Del mismo modo que en técnicas anteriores, disponemos de dos tipos de colorantes: Los convencionales, que se unen a las estructuras y les proporcionan un color característico. Los fluorocromos, que se unen igualmente a las estructuras de interés y emiten fluorescencia para distinguirlas del resto. En el caso de las tinciones convenciones, en la electroforesis en gel es muy empleado el azul de Coomassie, para proteínas, mientras que respecto a los fluorocromos destaca el bromuro de etidio, aunque por su carácter tóxico y cancerígeno existen otras alternativas fluorescentes como el SYBR™ Green. Fig. 6. A la izquierda, tinción con azul de metileno; a la derecha, con bromuro de etidio. / 4. Caso práctico 1: “Colorantes de corrida” Planteamiento: En el laboratorio utilizamos múltiples tinciones para el proceso de electroforesis, pero no todas ellas sirven para marcar los ácidos nucleicos o las proteínas, sino que algunas tienen otras funciones. Nudo: ¿Para qué sirve cada tinción? Desenlace: A continuación vemos otras funciones que pueden desarrollar las tinciones utilizadas en el proceso de electroforesis: El azul de Coomassie para identificación de proteínas. El bromuro de etidio para identificación de ADN. El SYBR™, el GelGreen™ o el GelRed™ para identificación de ADN. El azul de bromofenol como frente de avance de la electroforesis. Fig. 7. Diferentes tinciones en electroforesis en gel. El Xileno-cianol y verde cianol para el seguimiento de la migración del ADN, es equivalente a moléculas de ADN de gran tamaño. / 5. Interpretación de resultados A la hora de interpretar el resultado obtenido en una electroforesis en gel debemos fijarnos en las bandas que hayamos obtenido. Cada pozo, donde introducimos una muestra, se corresponderá a una línea, y en ella aparecerá o no una banda. El resultado será correcto cuando aparezca una banda, que se debe corresponder con el ADN que estamos buscando. En el caso de encontrar diversas bandas en la misma línea habríamos amplificado ácidos nucleicos no deseados, por ejemplo, fruto de la contaminación de la muestra. Fig. 8. Diferentes tinciones en electroforesis en gel. Recuerda... Es importante que solo aparezca una marca en cada columna, reflejando que se ha analizado una molécula en particular.  TEMA15.TÉCNICASDEELECTROFORESIS.INTERPRETACIÓNDERESULTADOS /7 MEDAC · Instituto Oficial de Formación Profesional El resultado será positivo cuando tengamos la banda con el peso correspondiente al ácido nucleico que estamos buscando. El resultado será negativo cuando no tengamos una banda o no tengamos ninguna banda específica. / 6. Visualización Cuando se ha practicado la PCR, en la sala propia para ello, se pasa a la sala Post-PCR, como hemos visto en las unidades anteriores. En esta sección de laboratorio se llevan a cabo tanto la realización de la electroforesis como la lectura de sus resultados. Fig. 9. Esquema de las secciones y el flujo de trabajo de un laboratorio de biología molecular. Esta sala Post-PCR es habitualmente una sala oscura, ya que algunas de las técnicas de revelado se realizan con colorantes fluorescentes que precisan este tipo de habitación. A menudo comparten espacio con la microscopía de fluorescencia. Recuerda, además, que es una sala sucia, ya que en ella se manipula material con ácidos nucleicos, por lo que su presión debe ser negativa. / 7. Fotografiado de geles de agarosa Se realizan mediante un transiluminador de luz ultravioleta y un equipo de fotografía. Esto nos permite obtener una imagen de los resultados conseguidos mediante el proceso de electroforesis. Es como un revelado en fotografía. La luz ultravioleta que se emplea puede ser incidente o transmitida, siendo Fig. 10. Transiluminador ultravioleta. habitualmente de una longitud de onda de 302 nm, consiguiendo una mejor florescencia del complejo ADN-bromuro de etidio. El gel se introduce en el transiluminador ultravioleta y entonces, tras aplicarle esta radiación, se fotografía. Es importante recalcar, además, la toxicidad del bromuro de etidio, por lo que esta sustancia debe eliminarse en recipientes específicos. / 8. Variantes de la electroforesis. Electroforesis bidimensional A continuación, veamos algunas variantes de la electroforesis, como pueden ser: La electroforesis bidimensional. La electroforesis de capilaridad.  TEMA 15. TÉCNICAS DE ELECTROFORESIS. INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS Biología molecular y citogenética /8 La electroforesis en campo pulsado (estas dos últimas estudiadas en el siguiente apartado). Como su propio nombre indica, la electroforesis bidimensional emplea dos dimensiones diferentes para separar las proteínas. Esto le confiere mayor resolución, permitiendo una separación más fina de sustancias, por lo que es muy empleada a la hora de separar mezclas de proteínas complejas. Fig. 11. Esquema del proceso de electroforesis bidimensional. La primera dimensión con la que trabaja es la carga de la proteína, gracias a un gel con un gradiente de pH, separando las proteínas según su punto isoeléctrico (pH al que la proteína tiene una carga eléctrica de 0). La segunda dimensión es el peso molecular. De esta forma, cuando dos proteínas tienen diferente carga, pero igual peso o viceversa, este método consigue separarlas, mientras que una electroforesis monodimensional sería incapaz de hacerlo. 8.1. Electroforesis de capilaridad y en campo pulsado La electroforesis de capilaridad supone la separación de Fig. 12. Esquema de electroforesis convencional frente a campo pulsado. sustancias atendiendo a su carga eléctrica, pero a través de capilares mili o micrométricos. La principal ventaja de este método es que es posible monitorizar la electroforesis en el mismo capilar, donde la sustancia estudiada se va separando en sus diferentes componentes. En cuanto a la electroforesis en campo pulsado, esta es una modificación de la electroforesis convencional, donde en lugar de generarse una corriente eléctrica se generan dos, en direcciones opuestas, y que se van alternando durante el procedimiento. Esto se realiza porque las moléculas de ADN son muy grandes para atravesar los poros de los geles de agarosa convencionales, y al alternar las corrientes, las moléculas se van desplegando y finalmente se consigue que atraviesen los poros del gel. / 9. Factores que afectan a la migración del material genético Los principales factores que pueden afectar a la migración del material genético son: Tamaño del ADN. Su tasa de migración es inversa al log10 del número de pares de bases que contiene, siendo las moléculas mayores las que migran más lentamente. Concentración de agarosa. La concentración de agarosa y poliacrilamida determinará la densidad del Fig. 13. Diferentes conformaciones de plásmidos.  TEMA15.TÉCNICASDEELECTROFORESIS.INTERPRETACIÓNDERESULTADOS /9 MEDAC · Instituto Oficial de Formación Profesional gel, de sus poros y el tamaño de estos, por lo que según la concentración de estas sustancias la migración será mayor o menor. Conformación del ADN. Según la forma que tenga el ADN, puede interactuar más o menos con los poros del gel y realizar un desplazamiento que, a priori, no se corresponda con su masa molecular. Los plásmidos, por ejemplo, pueden presentar conformaciones muy diferentes. Voltaje aplicado. A medida que se incrementa la fuerza del campo eléctrico lo hace también la movilidad de las partículas. Composición del buffer de electroforesis. Es decir, de los reactivos y componentes del medio, que pueden variar las concentraciones de iones y, con ello, la conductividad del medio, siendo mayor a mayor concentración de iones. / 10. Caso práctico 2: “Electroforesis capilar” Fig. 14. Esquema de electroforesis capilar. Planteamiento: En el laboratorio se emplean diferentes técnicas de electroforesis, la cual, como ya conoces, es una técnica de separación de sustancias atendiendo a cómo se desplazan en un campo eléctrico según su carga iónica. Una de estas técnicas empleadas en laboratorio es la electroforesis capilar. Nudo: ¿Qué ventajas tiene la electroforesis capilar frente a otras técnicas analíticas? Desenlace: Las principales ventajas de este método son que ofrece mayor velocidad y facilidad frente a otros, como por ejemplo la cromatografía líquida. Además, la cromatografía líquida requiere reactivos tóxicos, mientras que la electroforesis capilar emplea soluciones de baja toxicidad. Por ello, se consolida como una técnica más segura y rápida, pudiendo realizar análisis en cuestión de pocos minutos. / 11. Resumen y resolución del caso práctico de la unidad ELECTROFORESIS EN GEL Separación Geles Resultados Detección o revelado Fotografía de sutancias Masa Agarosa Marcadores Tinción con Ensayo Detección Transiluminador Autorradiografía molecular de peso colorantes enzimático con sondas ultravioleta molecular Poliacrilamida Carga Azul de Equipo de Convencionales fotografía Una banda Coomassie si resultado correcto Bromuro de Fluorescentes SYBR(TM) etidio Fig. 15. Resumen de la unidad didáctica.  TEMA 15. TÉCNICAS DE ELECTROFORESIS. INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS Biología molecular y citogenética / 10 Una vez realizada la PCR, el siguiente paso es separar las moléculas de ácidos nucleicos del resto de componentes, principalmente de las proteínas, mediante la técnica de electroforesis en gel. Para ello, se ubican las muestras en un gel, normalmente de agarosa, que será sometido a un campo eléctrico con dos polos, uno negativo o cátodo y otro positivo o ánodo. Entonces, las moléculas de ADN migrarán hacia el polo positivo, por ser predominantemente de carga negativa, y lo harán en base a su peso y carga eléctrica. El desplazamiento será mayor cuanto menor sea el peso del ácido nucleico, siendo homogéneos en cuanto a la densidad de carga. Una vez se ha desplazado el material genético por el gel, se realiza una tinción convencional, principalmente con Azul de Coomassie o una tinción fluorescente, con bromuro de etidio, o alternativas menos tóxicas como el SYBR™ Green. Teñida la muestra, el último paso consiste en fotografiarla para tener un registro digital de la misma. A la hora de interpretar los resultados buscaremos una única banda por línea de electroforesis que se corresponda con el peso molecular adecuado al estudio que estamos realizando, comparando con los marcadores de peso molecular que habitualmente tienen los resultados de electroforesis en gel. Resolución del caso práctico inicial Una vez obtenidos los resultados de la PCR, procedemos a realizar una electroforesis en gel de agarosa. Colocando el material genético en sus pozos y aplicando la corriente eléctrica necesaria, el ADN migrará hacia una posición en concreto del gel. Entonces, realizamos la tinción del gel y observamos si la banda de ADN teñido se corresponde con el peso molecular esperado para el ADN que estamos buscando. / 12. Bibliografía Caparrós Mota M; Cuenca Pardo J. B; Sipán Sarrión M. C. (2016). Biología molecular y citogenética. Madrid, España: Paraninfo. Gómez-Aguado F; Lorenzo Luque M. I; Simón Luis F; Hernández Giménez B. (2015). Biología molecular y citogenética. Barcelona, España: Altamar. Mérida F. J; Moreno E. E. (2015). Manual para técnico superior de laboratorio clínico y biomédico. Módulo III: biología molecular y citogenética. Madrid, España: Editorial Médica Panamericana. Electroforesis en gel. Khan Academy. Disponible en: https://es.khanacademy.org/science/biology/biotech-dna-technology/dna-sequencing-pcr-electrophoresis/a/gel-electrophoresis Electroforesis de proteínas y de ácidos nucleicos. Uah. Disponible en: http://biomodel.uah.es/tecnicas/elfo/inicio.htm INS. Manual de procedimientos de electroforesis para proteínas y ADN. Serie de normas técnicas nº 38. Lima, 2003. Disponible en: https://bvs.ins.gob.pe/insprint/SALUD_PUBLICA/NOR_TEC/38.pdf ¿Qué es la electroforesis bidimensional? Universidad Autónoma de Barcelona. 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