TEMA 07 Células B. Subpoblaciones. Reord. Repertorio. Activación PDF

TEMA 7. Células B Subpoblaciones de cB Genes de inmunoglobulinas. Reordenamiento Mecanismos de generación del repertorio de células B2 Activación de células B Ags timo dependientes e independientes Reconocimiento encadenado Activa...

TEMA 7. Células B Subpoblaciones de cB Genes de inmunoglobulinas. Reordenamiento Mecanismos de generación del repertorio de células B2 Activación de células B Ags timo dependientes e independientes Reconocimiento encadenado Activación de cB por células Th foliculares específicas Cambio de isotipo o switching en células B activadas Secreción de anticuerpos por células B plasmáticas Activación y diferenciación de cB en los centros germinales Ontogenia de cB Co-expresión de IgM e IgD en células B maduras no estimuladas Selección negativa de cB inmaduras  SUBPOBLACIONES DE CÉLULAS B CELULAS B1 Mac1+ CD23- CD5+ (?) ORIGEN: cels se generaron En estadios iniciales del desarrollo (fetal) en vida fetal, Dejan de producirse después del nacimiento. señales las Proceden de c. madre distintas de las c B2 mantienen 5% de las cB totales viables en localizaciones RENOVACIÓN: Autorrenovación en tejidos linfoides periféricos en respuesta a IL-10 y al ag que reconocen CELULAS B2 O CONVENCIONALES Mac1- CD23+ CD5-. ORIGEN: Producción contínua en la m ósea RENOVACIÓN: Se reemplazan en m ósea  GENES DE LAS INMUNOGLOBULINAS. REORDENAMIENTO Repertorio de anticuerpos: distintas espeficidades de anticuerpos que un individuo puede producir (>109) La información para generar ese repertorio está presente en el ADN de cada individuo. Para generar ese repertorio se necesitaría 1/3 del genoma. Dicho repertorio se genera durante la maduración de las cB en la médula ósea Organización de los genes de Igs en línea germinal: similar en todas las especies El reordenamiento = recombinación somática de segmentos génicos SOLO ocurre en c productoras de abs Nº de regiones o segmentos génicos Cromosoma humano V (familias) D J Los locus de la cadena H de Igs cromosoma 14 65 (7) 27 6 Los locus de la cadena k de Igs cromosoma 2 40 (7) 0 5 Los locus de la cadena l de Igs cromosoma 22 30 (8) 0 4 exones que codifican para Fc de mu, locus de la cadena pesada codifican para IgM En med ósea estadios para formación cel B, segmentos variables (V) precedidos por un péptido líder, que guía a pt a RE reordenamiento al azar entre segmentos V,D,J L: Señal de inicio de la traducción y péptido líder. 60-90 pb. 20-30 aas altamente hidrofóbicos V: Exones de regiones variables. Familias de segmentos idénticos en un 70-80%. Duplicación. Incluye HV1 y HV2. 300 pb. 100 aas D: Exones de regiones de diversidad J: Exones de regiones de unión. D y J incluyen CDR3 la región de mayor contacto con el antígeno C: Exones de regiones constantes NEW Recombinación y maduración de células B https://www.youtube.com/watch?v=-f05_ahwmfY GENES DE LAS INMUNOGLOBULINAS. REORDENAMIENTO The Nobel Prize in Physiology or Medicine 1987 was awarded to Susumu Tonegawa "for his discovery of the genetic principle for generation of antibody diversity" Diferencias genómicas en DNA nuclear en células linfoides versus células no linfoides compatibles con recombinación. Southern blot Reordenamiento de segmentos génicos  GENES DE LAS INMUNOGLOBULINAS. CONSTRUCCION DE INMUNOGLOBULINAS VL = V+J REORDENAMIENTO VH = V+D+J REORDENAMIENTO SECUENCIAL UNICAMENTE en células somáticas de linaje B y en un orden preciso Recombinación somática de la cadena pesada m que acaba expresándose en el citoplasma de linfocitos pre B si el reordenamiento es productivo se obtiene 1. Reordenamiento de D y J en cadena pesada cadena pesada (silenciamiento de reordenamiento en el otro cromosoma) 2. Reordenamiento VDJ en cadena pesada si no resulta productivo, se reordena en el otro cromosoma 3. Unión de Cµ por procesamiento si no resulta en ninguno de los 2, no se da cél B Recombinación somática de la cadena ligera k o l que se ensambla con m para expresar en membrana IgM 1. Reordenamiento de V y J en cadena ligera 2. Unión de C por procesamiento  GENES DE LAS INMUNOGLOBULINAS. REORDENAMIENTO el proB temprana no reordenamiento productivo EXCLUSION ALELICA: sólo se expresa la cadena pesada y ligera de uno de los dos cromosomas heredados MECANISMO GENES DE LAS INMUNOGLOBULINAS. REORDENAMIENTO maquinaria de recombinación reconoce secuencias que forman parte de los segmentos SECUENCIAS DE SEÑAL DE RECOMBINACION (RSS) El reordenamiento está guiado por secuencias flanqueantes en el ADN. Escisión. Ligación Heptámero (CACAGTG) - espaciador (12 ó 23) – nonámero (ACAAAAACC) Regla 12/23. Violando la regla 12/23 existen uniones D-D en cadena pesada Zonas del genoma NO ACCESIBLES en células no B PROTEÍNAS IMPLICADAS: Recombinasas (RAG1 y RAG2) específicas de cB. ADN ligasa IV, ADN -PK, heterodímero Ku 70-Ku 80 secuencias de recombinación asociadas a segmentos: heptámero + espaciador de 12/23 nuc no conservados + nonámero se produce recombinación siguiendo la regla 12-23 siempre se da entre secuencias con espaciador de 23 y otra con espaciador de 12 (nunca 12-12 o 23-23)  GENES DE LAS INMUNOGLOBULINAS. REORDENAMIENTO secuencias codificantes - dentro del exón, forma parte de él. secuencia RSS. Secuencias señal de recombinación (RSS). se puede perder pauta de lectura, por eso algunos reordenamientos no resultan productivos Heptámero - espaciador (12 ó 23) - nonámero. las V siempre tienen 23 Regla 12/23. las D siempre tienen 12 las J siempre tienen 23 Flecha roja: heptámero + nonámero + espaciador de 12 nts Flecha azul: heptámero + nonámero + espaciador de 23 nts señales que dentro de exones que se encuentran en regiones que co para saber que no se recombinan J con J, J23 y D12 En cadena pesada VH y JH flanqueados por 23RS DH flanqueado doblemente por 12RS primeros exones que hay después de segmentos V,D,J está mu - por eso se forman IgM En cadena ligera k: Vk flanqueada por 12RS Jk flanqueada por 23RS En cadena ligera l: Vl flanqueada por 23RS Jl flanqueada por 12RS Cell Vol 116,299-311.2004 (308) MECANISMOS DE GENERACION DEL REPERTORIO DE ANTICUERPOS PRE ENCUENTRO CON EL AG 1. EXISTENCIA DE MULTIPLES SEGMENTOS GÉNICOS QUE SE COMBINAN AL AZAR Cadenas ligeras k : 40 segmentos génicos de Vk y 5 segmentos génicos de Jk: 200 cadenas ligeras distintas Cadenas ligeras l: 30 segmentos génicos de Vl y 4 segmentos génicos de Jl: 120 cadenas ligeras distintas 320 cadenas ligeras totales Cadenas pesadas H: 65 segmentos génicos de VH, 27 de DH y 6 de JH : 11000 cadenas pesadas distintas recombinasa reconoce secuencia nonámero, separador o heptámero pero en estas regiones corta al azar. En cada cel B corta algo diferente. Forma hairpin en extremos que ha cortado para evitar degradación -> apertura hairpin y transferasa nuclear añade nucleótidos al azar, hasta que se de un mínimo de hibridación entre ambas cadenas. Entonces se unen por complementariedad y se sigue alargando, ligasa las une. Mucha variabilidad ->región hipervariable. 2. DIVERSIDAD COMBINATORIA DE CADENAS H Y L Combinación de distintas regiones V de cadenas pesadas y ligeras: 320*11000 = 3.2 106 3. DIVERSIDAD EN LA UNION DE SEGMENTOS GENICOS Recombinación imprecisa. Imprecisión en la rotura Diversidad de unión de nucleótidos añadidos (P: secs palindrómicas) y (N: secs sin molde). TdT REORDENAMIENTOS NO PRODUCTIVOS: 2 de cada 3 SISTEMA MUY FINAMENTE REGULADO Control de la expresión de RAG-1 y RAG-2 Accesibilidad de segmentos génicos, promotores y enhancers se puede dar codón de stop-> no productivo MECANISMOS DE GENERACION DEL REPERTORIO DE ANTICUERPOS POST ENCUENTRO CON EL AG MADURACION DE LA AFINIDAD POR HIPERMUTACION SOMATICA Hipermutación somática de las regiones CDR de segmentos V reordenados En respuesta a ags proteicos dependientes de cTH (TD) Ocurre en los centros germinales Mayor número de mutaciones con el tiempo Mayor número de mutaciones en IgG que IgM Mayor número de mutaciones en inmunizaciones secundarias y terciarias Tasa de mut: 10-3/par de bases/división celular ó 1/región V/división celular Puntos calientes de mutaciones en motivos RGWY (R-purina; Y-pirimidina; W_A ó T) Enzima implicada: AID (Activation induced cytidine deaminase) Mutaciones que den lugar a pérdida de actividad: muerte celular HIPERMUTACIÓN SOMÁTICA: asociada a cambio de isotipo, en segunda exposición a antígeno inserción e regiones hipervariables cambios en regiones hipervariables pueden hacer que se pierda afinidad por el epítopo - muerte AID: reconocimiento región consenso introduce mutaciones en el genoma de esa cel B En tercera inmunización, más hipermutación. Genes mutados por AID que si no se reparan pueden dar lugar a linfomas EFECTOS NO DESEADOS DE LA ACTIVACIÓN DE AID (682) La actividad de AID tiene como efecto colateral la edición de otros genes diferentes de los de las inmunoglobulinas IgM e IgD se coexpresan en cels B maduras Hasta 300 genes descritos mutados por AID. pq emplea por splicing alternativo la región constante de D se unen a la misma landa, por lo que tienen la La mayoría de estos cambios son reparados por los sistemas de reparación celular misma región variables Una pequeña proporción de estos cambios escapa al control de los sistemas de reparación dando lugar a linfomas Se han identificado 21 dianas de AID que aparecen mutadas de forma recurrente en linfomas ACTIVACIÓN DE CB. AGS TIMO DEPENDIENTES Y TIMO INDEPENDIENTES ANTÍGENOS TIMO INDEPENDIENTES (TI) RESPUESTAS IGM DE BAJA AFINIDAD 1ª Señal: Antígeno unido a la Ig 2ª Señal: Células accesorias no derivadas del timo (TI-II) o el propio antígeno vía TLRs por ejemplo (TI-I) Tipos de antígenos TI: TI-I como el LPS bacteriano, Brucella abortus TI-II como el polisacárido de pneumococo, flagelina polimerizada de salmonella, dextrano, ficoll conjugado con hapteno (estructuras muy repetitivas) ANTIGENOS TIMO DEPENDIENTES (TD) 1ª Señal: Antígeno unido a la Ig. Amplificación de la señal: correceptores de Ig 2ª Señal: Moléculas liberadas por células T cooperadoras (TH2).  ACTIVACIÓN DE CB POR CTH FOLICULARES ESPECIFICAS (602, 642) RECONOCIMIENTO ENCADENADO O COOPERACION CB-CT Las cT cooperadoras (helper) foliculares que activan células B en los centros germinales reconocen el mismo antígeno ETAPAS Reconocimiento y captura del antígeno por células B Internalización mediada por receptor del complejo BCR-antígeno Degradación/procesamiento del antígeno en vesículas endocíticas Reconocimiento de péptidos antígenicos por moléculas MHC-II Presentación del complejo Ag-MHCII a células T - endocitosis mediada por receptor - cel B actúa como cel pres de antig - en sus MHC II expresa péptido antigénico que el BCR a reconocido no es el mismo el epítopo que reconoce BCR al que presenta MHC. Viene de los mismo, pero no tiene que ser el mismo - secrección ciotq  CÉLULAS T HELPER FOLICULARES ACTIVACIÓN DE CB POR CTH FOLICULARES ESPECIFICAS DESCRITAS EN EL AÑO 2000 cel t helper en folículos se llaman cel t foliculares ACEPTADAS DESDE 2009 COMO LAS RESPONSABLES DE LA ACTIVACIÓN DE CÉLULAS B EN FOLICULOS DE CGS señales de supervivencia de cel t folículo a cel B (613) NIVELES DE COOPERACIÓN CÉLULA T FOLICULAR – CÉLULA B CAMBIO DE ISOTIPO O SWITCHING EN CÉLULAS B ACTIVADAS (421) en cambio de isotipo no cambia región variable, sólo cambia región constante de la cadena pesada por splicing alternativo. Reconocen recombinasas recuencias switch. SECUENCIAS NO CODIFICANTES - INTRÓNICAS Se trata de un proceso de recombinación somática mediada por secuencias de ADN repetitivo: regiones switch (S) Las secuencias de “switch” se encuentran en regiones intrónicas y contienen repeticiones de las secuencias GAGCT y GGGGGT Diferencias con la recombinación de segmentos génicos de la región V: Todos son productivos (localización intrónica) Las enzimas y señales implicadas son distintas Es un fenómeno que ocurre tras la estimulación antigénica Las c B maduras pasan de coexpresar IgM e IgD a expresar IgG, IgE o IgA con la misma especificidad. Se trata de un proceso regulado por cTH y sus citoquinas Rgión de switch mu y región swith epsilon recombinan, eliminación de toda la región si hubiese recombinado con gamma - IgG- podría recombinar más tarde con epsilon para dar IgE  CAMBIO DE ISOTIPO O SWITCHING EN CÉLULAS B ACTIVADAS (421) Las células cooperadoras TH2 que reconocen el complejo ag-MHCII en la superficie de cB sintetizan moléculas efectoras que sinergizan en la activación de cB. MOLÉCULAS LIBERADAS: CD40L: familia del TNF. Se une a CD40 en la membrana de la cB. Necesario para el cambio de isotipo. IL4: sinergiza con CD40L para inducir la proliferación de cB. Inducen el cambio de isotipo IL5: Inducen el cambio de isotipo IL6: Inducen el cambio de isotipo CAMBIO DE ISOTIPO: Diferentes citoquinas median el cambio a distintos isotipos Regulan el procesamiento alternativo del mRNA transcrito desde los sitios de switch (región 5´intrónica de cada gen C de la cadena pesada, con excepción de Cd. Zonas con secuencias repetidas)  CAMBIO DE ISOTIPO O SWITCHING EN CÉLULAS B ACTIVADAS (715) En presencia de citocinas como IL4, IL13, IL10 e IL21 se produce el cambio de isotipo de IgM a IgG1, IgG4 o IgE Las respuestas positivas para IgG4 se observan a menudo tras exposiciones repetidas o prolongadas a ciertos tipos de antígenos como antígenos alimentarios, parásitos, proteínas terapéuticas o ciertos autoantígenos. Estas células B presentan un patron de expresión de receptores de quuimiocinas que favorecen su salida de los CGs y su entrada en los tejidos Además está permitido el cambio de isotipo de IgG1 a IgG4 pero no de IgE a IgG4  SECRECIÓN DE ANTICUERPOS POR CÉLULAS B PLASMATICAS Todas las cB naive empiezan secretando IgM tras su activación Tras su activación parte de las cB se diferencian a células plasmáticas que producen la forma secretada de IgM, a la vez que CAMBIAN DE ISOTIPO NO DE ESPECIFICIDAD tras la estimulación por diferentes citoquinas Las formas de inmunoglobulina de membrana y secretada se forman por procesos de “splicing” alternativo de los dominios citoplasmático y TM (25 aas) de anclaje a la membrana. Las formas de Igs de membrana son siempre monoméricas Cada cB puede sintetizar simultáneamente Ig de membrana y secretada Raramente se produce la forma secretada de IgD cadena pesada anclada en mb pq exones regiones condificantes y justo después exón región transmb y otro exón para colacitoplasmática. si por splicing transcrito no tiene región transmb, pt no tiene reg transmb cuando se diferencia a plasmática se da este splicing alternativo - secreción Ig ACTIVACION Y DIFERENCIACION DE CB EN LOS CENTROS GERMINALES FOCO PRIMARIO O FOLÍCULO PRIMARIO: Las cB que unen ag han sido atrapadas en la zona T de los tejidos linfoides secundarios donde se activan gracias a cT cooperadoras. FOLÍCULO SECUNDARIO: Las cB comienzan a proliferar, diferenciarse…formando un folículo secundario en un centro germinal. En el centro germinal pueden distinguirse diferentes zonas: Zona oscura: centroblastos: cB proliferando: HIPERMUTACION SOMÁTICA (1base/1000/división) Zona clara: centrocitos: cB maduras con poca proliferación que morirán a menos que su Ig de superficie encuentre una cT cooperadora. Las cB maduras que han superado la selección abandonan el centro germinal para convertirse en c memoria o c plasmáticas. Manto: cB no específicas de ag En el centro germinal experimentan: Hipermutación somática Selección de las cB de mayor afinidad Diferenciación a c plasmáticas Diferenciación a c memoria de las cB de mayor afinidad Diferencias entre cB resting y célula plasmática ACTIVACION Y DIFERENCIACION DE CB EN LOS CENTROS GERMINALES (642) ORGANIZACION DE LOS CENTROS GERMINALES (518) proliferación cambio isotipo cel B activada tras reconocimiento del antígeno (1º señal) secreción anticuerpos 2 señal cels T helper SHM: somatic hypermutation CSR: class-switch recombination puede perderse la especificidad - no recibe señales de supervivencia, si no de pérdida de viabilidad órgano linfoide 2ario Centros germinales  ONTOGENIA DE CÉLULAS B2 DESARROLLO DE CB reord cadena pesada DONDE Y CUANDO En los islotes hematopoyéticos del hígado fetal (semana 8-9 de gestación) Posteriormente en la médula ósea mu en citoplasma, sintetiza en citoplasma receptor pre B pseudocadena ligera ESTADÍOS DE DIFERENCIACIÓN mediante receptor que simula cadena lig recibe señales de proliferación tiene cadenas Igalfa Ig beta Se definen por el reordenamiento y expresión secuencial de los genes de las cadenas H y L de las Igs y por la expresión de determinadas proteínas de superficie reord cadena ligera EN LA MEDULA OSEA… reord cadena ligera, con cadenas pesadas iguales y ligeras diferentes expresa Diferenciación hasta cB inmaduras (IgM). Selección negativa. Tolerancia. Producción diaria contínua. cuando tiene IgM en mb sufre selección negativa (sólo se da este proceso cuando tiene ig DESPUES…. de mb) Colonización de órganos linfoides periféricos: cB que no entran en los folículos (vida media 2-3 días) cB que entran en los folículos (vida media 3-8 semanas) FINALMENTE… Activación y memoria en órganos periféricos ONTOGENIA DE CÉLULAS B2 PROTEÍNAS REGULADORAS DEL REORDENAMIENTO CON EXPRESIÓN DIFERENCIAL CONCEPTOS EXCLUSIÓN ALÉLICA (sólo uno de los alelos de Ig de los padres se expresa). EXCLUSIÓN ISOTÍPICA (cada clon de cB sólo produce un tipo de cadena ligera) CO-EXPRESIÓN DE IgM E IgD EN CÉLULAS B MADURAS NO ESTIMULADAS La coexpresión de ambos isotipos de abs se debe a procesos de splicing alternativo. Ambas Igs, IgM e IgD, tienen la misma especificidad, reconocen el mismo antígeno Fc pseudogen epsilon tras selección negativa que ocurre por las IgM en mb, coexpresa IgD que se cree que es un marcador de maduración (si presenta IgD ya puede ser expulsado) SELECCIÓN NEGATIVA DE CÉLULAS B INMADURAS SELECCIÓN NEGATIVA O INDUCCIÓN DE TOLERANCIA POR: DELECION CLONAL (apoptosis) si reconocen ags multivalentes propios (643) ANERGIA (inactivación) si reconocen ags solubles monovalentes propios mecanismos por tolerancia en periferia mecanismos que aseguran que aunq sea cel B autorreactiva, no haga nada en el cuerpo - cel que se escapa a selección negativa EDICIÓN DEL RECEPTOR: Los linfocitos B inmaduros que reconocen antígenos propios con elevada avidez y van a ser delecionados, pueden reeditar su receptor utilizando una cadena ligera diferente que permita la expresión de un BCR que no reaccione frente a lo propio mecanismo cels anérgicas que no responden a pt toleranceia propia aunq son autorreactivas central (????) en médula ósea SI QUIERES SABER MAS….GENES DE LAS INMUNOGLOBULINAS. REORDENAMIENTO Pero, ¿cómo es posible que el reordenamiento ocurra secuencialmente en los loci adecuados cuando la maquinaria de recombinación está presente de forma ubicua? (668) Modelo: locus Igh Técnica: Chromosome Conformation Capture (3C). Fijación de cromosomas La cromatina está organizada en TADs (Topologically Associating Domains) con el fin de minimizar interacciones inapropiadas entre genes, compartimentalizándolos Compartimentalización. Estadio pre-pro-B Existen 3 sub-TADs en el locus variable de Igh: uno contiene los segmentos DHJH, los otros dos contienen los segmentos VH. La región IGCR1 une factores de transcripción CTCFs que guían el inicio de la recombinación de segmentos D con J. Localización nuclear. Estadio pre-pro-B La región VH se localiza en la periferia nuclear como corresponde a regiones de cromatina inactivas, mientras los segmentos DH y JH se encuentran más próximos al centro del núcleo. Contracción. Estadio pro-B. Los segmentos VH se colocan próximos a los DH y JH para favorecer la recombinación. El factor de transcripción PAX-5 regula este proceso. Tras la recombinación el loci se relaja  SI QUIERES SABER MAS….GENES DE LAS INMUNOGLOBULINAS. REORDENAMIENTO Pero, ¿cómo es posible que el reordenamiento ocurra secuencialmente en los loci adecuados cuando la maquinaria de recombinación está presente de forma ubicua? (668) Exclusión alélica Proceso regulado por: modificación de histonas, accesibilidad de la cromatina, localización nuclear, actividad transcripcional y DNA looping tras el emparejamiento de alelos Emparejamiento de alelos Previo a la acción de RAG RAG provoca que un alelo se proyecte fuera de su posición habitual en el cromosoma siendo este el primer alelo reordenado. El proceso del reordenamiento génico OBJETIVOS Identificar las cadenas polimórficas y monomórficas que constituyen el BCR Identificar algunos marcadores moleculares de células B Entender las diferencias existentes entre las subpoblaciones B1 y B2 de células B Entender el reordenamiento de segmentos génicos en cB Explicar los mecanismos responsables del repertorio de cB antes y después del antígeno Explicar cómo se produce el cambio de isotipo en cB Explicar por qué el BCR esta formado inicialmente por IgM e IgD Describir la secuencia de diferenciación de los linfocitos B hasta su fase madura y virgen en relación con los reordenamientos y procesamiento del ARN que sufren Describir los procesos de selección clonal negativa de células B Explicar el mecanismo de exclusión alélica Conocer la distribución anatómica de las células B REFERENCIAS 308 Unraveling V(D)J recombination: insights into gene regulation Cell 116,299-311. 2004 421 Class-switch recombination: Interplay of transcription, DNA deamination and DNA repair Nature Reviews Immunology 4, 541-552. 2004 518 Germinal Centres: role in B cell physiology and malignancy Nature Reviews Immunology 8, 22-33, 2008 584 The importance of natural IgM: scavenger, protector and regulator Nature Immunology Vol 10, N11, 778-786. 2010 625 The early history of B cells. Nature Reviews Immunology 15, 191-197. 2015 642 The who, how and where of atigen presentation to B cells Nature Reviews Immunology 7, 505- 518. 2007 643 Mechasnisms of central tolerance for B cells Nature Reviews Immunology 17, 281-294. 2017 668 Genome organization in immune cells: unique challenges Nature Reviews Immunology 19, 448-455. 2019 715 The unique properties of IgG4 and its role in health and disease Nature Reviews Immunology 23, 763-778. 2023 GENES DE LAS INMUNOGLOBULINAS. REORDENAMIENTO RECONOCIMIENTO. ROTURA. ESTABILIZACIÓN. REPARACION IMPRECISA Cell Vol 116,299-311.2004 (308) https://www.youtube.com/watch?v=bzXAKX6j-hg