Materiales Biocompatibles y Soporte para Cultivos Celulares PDF

**T.8 BIOMATERIALES Y SOPORTES PARA CULTIVOS CELULARES** **BIOMATERIALES Y SU RELACIÓN CON INGENIERÍA DE TEJIDOS** **1. Evolución histórica** Biomateriales: son todas aquellas sustancias y materiales de origen sintético o natural que se utilizan para fabricar dispositivos que reemplacen una parte...

**T.8 BIOMATERIALES Y SOPORTES PARA CULTIVOS CELULARES** **BIOMATERIALES Y SU RELACIÓN CON INGENIERÍA DE TEJIDOS** **1. Evolución histórica** Biomateriales: son todas aquellas sustancias y materiales de origen sintético o natural que se utilizan para fabricar dispositivos que reemplacen una parte o función de un sistema vivo de una manera segura, económica y fisiológicamente aceptable. Presentan una amplia versatilidad en sus aplicaciones como: Productos sanitarios (PS) (implantes, dispositivos, equipos de procesamiento) y en la Regeneración de Tejidos. David F. Williams, 1987: biomaterial es un material no viable o inerte usado en dispositivos médicos (PS) destinados a la interacción con los sistemas biológicos **2. Clasificación de biomateriales** **Biomateriales inteligentes** 1. Biomateriales inertes: los materiales pueden ser tóxicos 2. Biomateriales que interaccionan de forma activa con el entorno: liberación de factores para promover regeneración (señales de un único sentido) 3. Biomateriales que responden a un estímulo específico 4. Biomateriales que se adaptan a una situación fisiológica **Materiales** - Polímeros: Poliuretanos Siliconas Biomateriales fluorados Acrílicos - Metales: Titanium Nitinol (aleación de Níquel y titanio) Acero inoxidable - Cerámicos/vidrios: Hidroxiapatita Alúmina - Materiales naturales: Colágeno Ácido Hialurónico GAG Alginato - Combinaciones: materiales compuestos para mejorar propiedades específicas **Polímeros** Sustancias macromoleculares en las que se diferencian distintas unidades estructurales llamadas monómeros y que se repiten formando cadenas. - **Clasificación:** En función de su origen - Naturales: provenientes directamente del reino vegetal o animal. Ej: celulosa - Semisintéticos o artificiales: son el resultado de modificaciones mediante procesos químicos de ciertos polímeros naturales. Por ejemplo: derivados de celulosa (nitrocelulosa) - Sintéticos: son los que se obtienen por procesos de polimerización controlados por el hombre a partir de materias primas de bajo peso molecular. Ej: PLA y PLGA - En función de los monómeros: - Homo-polímero - Co-polímero - Ter-polímero - - No biodegradables - Biodegradables - **Polímeros Naturales** - Proteínas: colágeno, gelatina, fibrina, elastina, proteína de soja - Polisacáridos: quitosano, alginato, ácido hialurónico, sulfato de condroitina, almidón, celulosa, dextrano, polihidroxialcanoatos - Técnicas de obtención: - 1\. Extracción - 2\. Purificación (eliminar la antigenicidad) - 3\. Descelularización - Ventajas: Adhesión, catabolismo propio, factores de crecimiento, baja toxicidad - Desventajas: Respuesta inmunogénica, costes... - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - **Polímeros semi-sintéticos** - Estructura polimérica sintética + Molécula bioactiva - Presentan las características de ambos materiales - Ej: Hidrogel con PEG + Fibrinógeno: El polietilenglicol controla la densidad, dureza y degradabilidad del hidrogel y el fibrinógeno es el componente que aporta la bioactividad para la remodelación celular. Se usa para la regeneración de tejidos Ver tabla página 20 **3. Propiedades de biomateriales** Viene determinada por la microestructura Las moléculas que se encuentran en la superficie de la materia son las que entran en contacto con el microambiente: van a ser responsables de la reactividad y de la respuesta biológica. Se estudia: Rugosidad, capacidad para mojarse, movilidad, composición química, carga eléctrica, cristalinidad, heterogeneidad ante la respuesta biológica **Características de un andamio** 1. Propiedades físicas y mecánicas intrínsecas adecuadas Microarquitectura altamente porosa, con tamaños de poros definidos e interconectados y una alta relación entre la superficie y el volumen, lo que permite una mejor vascularización, transferencia de masa y crecimiento celular. 2. Biocompatibilidad El material debe generar el efecto deseado, ser seguro y causar el mínimo grado de inflamación tras su implantación. 3. Bioactividad La interacción entre el biomaterial y las células debe favorecer la adhesión y proliferación celular, facilitando el contacto entre células y su migración durante un periodo prolongado. 4. Imitación de la MEC Debe ser capaz de imitar el tejido nativo, proporcionando un entorno óptimo para la protección y nutrición celular 5. Bioabsorción El biomaterial debe ser bioabsorbido de manera controlada y en un tiempo adecuado para que el nuevo tejido pueda reemplazar el espacio inicialmente ocupado por el biomaterial 6. Versatilidad Los biomateriales deben ser adaptables a diferentes técnicas de fabricación. 7. Perspectiva traslacional El andamio debe ser reproducible, accesible y escalable para permitir su uso en aplicaciones de alta demanda, como la regeneración de tejidos grandes. **Propiedades físicas de la superficie del biomaterial** - Topografía (forma, tamaño y geometría del biomaterial): determina la orientación de las células, tensión, adhesión, polarización y migración. - Rugosidad (protusiones y depresiones; tiempo dependiente): El aumento de la rugosidad de la superficie reduce la proliferación y aumenta la diferenciación de los osteoblastos. Uso novedoso de shape memory materials. Se propone un valor de rugosidad crítico para cada tipo de biomaterial. - Diseñar biomateriales con rugosidad multiescala, tanto a nivel micro como nano, puede mejorar las respuestas celulares. Un gradiente de rugosidad en estas dos escalas facilita las interacciones entre diferentes tipos de células o proteínas en la superficie. - Cambios observados en células madre mesenquimales humanas (hMSC) cultivadas en sustratos de acero inoxidable con diferentes niveles de rugosidad. - El mismo valor de rugosidad en dos tipos diferentes de materiales puede afectar de manera diferente las respuestas celulares debido a las diferencias en su composición química. - Rigidez: Cantidad de fuerza que se requiere para realizar algunos cambios en la superficie del biomaterial y el entorno circundante. - La rigidez de la superficie de los biomateriales puede ajustarse alterando directamente la proporción del polímero y la solución de entrecruzadores o el tratamiento de temperatura y/o duración. - La mayoría de los enfoques sugeridos para la generación y/o regulación de la rigidez se limitan a diseñar materiales con rigidez estática para células dinámicas. **Propiedades químicas de la superficie del biomaterial** - Grupos funcionales y cargas: hidrofobicidad / hidrofiliocidad (humectabilidad) afecta a la adsorción de proteínas. Los grupos funcionales de la superficie pueden dirigir las funciones celulares mediante la conjugación covalente con los grupos funcionales de los lípidos, proteínas y glucanos en la superficie celular. Se propone usar superficies que contengan múltiples grupos funcionales para afectar simultáneamente diferentes vías biológicas - Carga iónica: utilización de diferentes iones en la superficie de los biomateriales para mejorar las interacciones célula-biomaterial y la interacción con el medio. - Ej: los iones de cobalto pueden interactuar con el grupo hidroxilo en el extremo carboxilo de la fibrilla de colágeno e inhibir la formación de enlaces estabilizadores esenciales dentro de la red de colágeno. Por lo tanto, la presencia de estos iones en las matrices de colágeno provoca cambios sustanciales en la forma en que las células interactúan con la matriz de colágeno. - Funcionalización superficial con biomoléculas para estimular y/o imitar funciones biológicas: La funcionalización superficial con proteínas, a través de los grupos funcionales presentes tanto en la superficie del biomaterial como en la proteína, tiene algunas ventajas, como sus efectos biológicos predecibles, la simplicidad de producción y análisis, y el bajo costo. - Respuestas biológicas a la energía libre interfacial de los biomateriales: determina cómo se forman las interacciones iniciales entre el material y el entorno biológico. La energía libre interfacial influye en qué proteínas se adsorben primero, su orientación y su bioactividad, afectando la respuesta inmune y la integración del biomaterial. **4. Funciones de biomateriales** Biomateriales generadores de oxígeno(OGBs): son materiales diseñados para proporcionar un suministro continuo y prolongado de oxígeno a los tejidos diseñados de manera gradual. Los OGBs se utilizan en diversas aplicaciones clínicas, como la regeneración de tejidos cardíacos, óseos y cutáneos, proporcionando un suministro de oxígeno sostenido y controlado para combatir la hipoxia. La degradación del hidrogel se activa en presencia de señales patofisiológicas asociadas con microambientes tumorales: condiciones reductoras La doxorrubicina (DOX) liberada induce apoptosis en células HeLa derivadas de cáncer cervical Mejora la especificidad de la muerte celular en células HeLa **HIDROGELES** **1. Hidrogeles** - Entramado entrecruzado - Dimensiones macroscópicas - Características hidrofílicas y/o anfifílicas - Insolubles por el entrecruzamiento (crosslink) **Características** - Biocompatible: seguros para su uso en el cuerpo humano sin reacciones adversas - Biodegradable - Permite la difusión de nutrientes y metabolitos - Soporte mecánico durante un determinado periodo de tiempo - Señales biológicas tanto temporales como espaciales para el desarrollo celular  Hidrogeles diseñados para: - Ser estables - Experimentar degradación hidrolítica - Imitar la degradación enzimática presente en la MEC nativa (péptidos susceptibles a proteasas) Hidrogeles sintéticos con señales de adhesión celular La mecánica de los hidrogeles puede controlarse fácilmente aumentando la densidad de entrecruzamiento o la hidrofobicidad relativa de la red. La organización celular y de la matriz es muy importante para el correcto funcionamiento de los tejidos. Los precursores de hidrogel se electrohilan y luego se entrecruzan en estado seco, hinchándose al colocarse en un entorno acuoso  La falta de control sobre los perfiles de liberación de GFs ha llevado al desarrollo de vehículos de entrega micro y nano dentro de los hidrogeles **Clasificación** - Natural (alginato, quitosano) o sintéticos (PEG, PVA, PHEMA) - Degradables (hidrólisis, enzimática) y no biodegradables - Entrecruzamientos físicos o químicos - Polímeros: Homo- , co- o block-copolymer o multi polymer - Interpenetrantes (IPNs) o semi-interpenetrantes - Carga iónica: Neutros (PHEMA, PVA), catiónicos, aniónicos, anfifílicos - Estructura Interna: amorfos, cristalinos (orden macromolecular de las cadenas poliméricas) o semicristalinos - Estructura externa: matriciales, films, membranas, microsferas, microscápsulas **Hidrogeles** - Los hidrogeles tradicionales pueden presentar inconvenientes como mecánicas débiles, propiedades estáticas y la incapacidad de replicar completamente aspectos del microambiente celular - Interpenetrantes (INP): incorporación de redes secundarias para mejorar las propiedades mecánicas de los hidrogeles. - Hidrogeles semi-IPN: formados por la interdigitación molecular de un polímero secundario en lugar de una red. - Hidrogeles de doble red: se componen de dos redes interpenetradas, donde la segunda red se forma en presencia de la primera. - Hidrogeles basados en host-guest (hospedador-huésped): Se utilizan moléculas que tienen cavidades hidrofóbicas capaces de atrapar moléculas huésped hidrofóbicas **Polímero natural** Hidrofílico, químicamente débil, alta velocidad de degradación, baja fuerza mecánica y poca durabilidad **Polímero sintético** Hidrofóbico, químicamente fuerte, baja velocidad de degradación, elevada fuerza mecánica y durabilidad **Propiedades** 1. Hinchamiento: un hidrogel tiene la capacidad de aumentar su volumen por la captación de agua cuando se pone en contacto con un medio acuoso o en respuesta a estímulos 2. Características superficiales: Adhesión celular, trombogenicidad y biocompatibilidad 3. Degradación: el hidrogel tiene que desaparecer a medida que el tejido se va desarrollando a. Degradación de las cadenas poliméricas, degradación del entrecruzante, degradación del enlace a la molécula b. Hidrolítica: hidrólisis en presencia de agua o no enzimática c. Enzimática: específicas que degradan enlaces o materiales específicos: proteasas **Sensibles a la Tª** Los polímeros termosensibles se caracterizan por presentar grupos hidrófobos, tales como el metilo, etilo y propilo. LCST (Lower Critical Solution Temperature): alrededor de los 32ºC. Pierden la solubilidad a medida que aumenta la temperatura, por lo que gelifican cuando se introducen en el cuerpo UCST (Upper Critical Solution Temperature): aumentan su solubilidad a medida que aumenta la temperatura Enredos (Entanglements): son conexiones físicas **Propiedades del hidrogel** Q: Relación de hinchamiento volumétrico: es la proporción entre el volumen del hidrogel hidratado y su volumen en estado seco. ↑ densidad, ↓ Q: Un mayor número de enlaces cruzados restringe la capacidad del hidrogel para absorber agua, limitando su hinchamiento D: Difusividad: D mide la capacidad de las moléculas para moverse a través del hidrogel. ↑ densidad, ↓ D: el tamaño de los poros se reduce, dificultando el paso de moléculas a través de ella G: Módulo de cizalladura: G mide la rigidez del hidrogel en respuesta a fuerzas de corte. ↑ densidad, ↑ G: mayor entrecruzamiento hace al hidrogel más resistente a deformaciones por fuerzas tangenciales E: Módulo Elástico: E representa la rigidez del hidrogel en respuesta a fuerzas de tensión o compresión. ↑ densidad, ↑ E: una red más densa restringe las deformaciones Compromiso entre la flexibilidad (Q) y movilidad (D) y la rigidez (G) y resistencia (E) de los hidrogeles El diseño de hidrogeles con propiedades óptimas implica ajustar cuidadosamente la densidad de entrecruzamiento para equilibrar estas características según la aplicación deseada **Síntesis** Componentes necesarios: Monómeros, tensioactivos, estabilizantes, iniciadores de polimerización Características para garantizar que la síntesis de hidrogeles sea eficiente, reproducible y sostenible, mientras que las propiedades finales del material (pureza, uniformidad y funcionalidad) sean óptimas: - Eficientes: alta conversión de los monómeros y precursores en el hidrogel final con una mínima pérdida de material - Elevado rendimiento - Los grupos funcionales en los monómeros o polímeros deben ser tolerantes a una amplia gama de condiciones - En condiciones moderadas o suaves: El proceso de síntesis debe realizarse a temperaturas, presiones y condiciones químicas que no sean extremas - Con una producción mínima de subproductos, lo que reduce la necesidad de purificación posterior - Entrecruzante con dos grupos terminales reactivos similares a los polímeros precursores 1. **Entrecruzamiento covalente** Entrecruzamiento de materiales de partida a través de reacciones químicas o de polimerización (inducida por luz UV, rayos gamma, rayos X o haces de electrones). Etapas de la polimerización: - 1\. Iniciación: formación de radicales (excitación) - 2\. Prolongación: reacción radicalaria (inhibición por oxígeno) - 3\. Finalización: neutralización de cadenas con radicales activos 2. **Uniones físicas** - Menos agresivas - No hay purificación - Adecuada para células y moléculas sensibles → se evita usar sustancias tóxicas o moléculas externas reactivas necesarias para iniciar la polimerización - Alginato: polisacárido formado por ácido β-D-manurónico y ácido α-L-glucurónico con uniones α(1→4) - Entrecruzado con un ion divalente: Ca2+, Ba2+, Mg2+ - Quitosano (quitina): polisacárido producido de la desacetilación de la quitina - Formado por unidades de glucosamina con restos de aminas primarias (+) - Se entrecruza con polianiones o moléculas aniónicas: TPP (Tripolifosfato), sulfato, citrato, Ca3 (PO4 )2 - Ej: entrecruzamiento con glicerofosfato para formar termogeles utilizados para la regeneración de cartílago y hueso - Hialuronato (HA): polisacárido formado por ácido glucurónico y N-acetil-glucosamina - Debido a la presencia de grupos carboxilato (-COO⁻) en el ácido glucurónico, el hialuronato lleva una carga negativa en condiciones fisiológicas - Esto lo hace capaz de interactuar con contraiones catiónicos o con polímeros que tengan carga positiva para formar diferentes estructuras funcionales, como hidrogeles iónicos (ionotrópicos) o complejos polielectrolíticos - Núcleo: unidades hidrofílicas en la parte externa - Flores: unidades hidrofílicas en la parte interna - Antígeno -- Anticuerpo: hinchamiento o colapso de hidrogeles - Polisacárido -- Proteína **SCAFFOLDS** Estructuras fibrosas en las que las fibras de diferentes tamaños y diámetros se colocan usando técnicas textiles (punto, tejido, trenzado) creando estructuras tridimensionales con propiedades mecánicas. **1. Scaffolds** **Ventajas** - Las nanofibras promueven la adhesión celular - Son porosos con poros interconectados - Se asemejan a las fibras de colágeno de la MEC: - Fibrillas de colágeno: 100 nm - Fibras de colágeno: 1 -- 100 μm - Alta versatilidad en cuanto a forma, tamaño y diámetro de las fibras - Técnicas de elaboración → técnicas textiles simples **Proporcionan:** - Estructura con propiedades mecánicas estables - Liberación controlada de sustancias - Facilita procesos críticos en la regeneración tisular: - Proliferación celular - Diferenciación celular - Guía del crecimiento celular **Características principales** 1. Biocompatible: a. No generar citotoxicidad o respuesta inflamatoria o inmunogénica b. Promueve: adhesión celular, motilidad, supervivencia, diferenciación 2. Interacción celular: características fisicoquímicas superficiales del polímero c. Capacidad de humectación d. Rugosidad e. Cristalinidad f. Carga g. Grupos funcionales (funcionalización) → LIGANDOS (RGD) 3. Rigidez: Forma del citoesqueleto celular y la funcionalidad de la célula. La rigidez determina la adhesión celular, proliferación y esparcimiento celular. Debería ser similar a la encontrada en el tejido natural. 4. Porosidad: tamaño de poro e interconexión interacción celular 5. Propiedades mecánicas: similares al tejido natural (tensión y elasticidad) 6. Degradación: Control temporal. Degradación superficial, en masa o enzimática Dependerá directamente de la composición polimérica 7. Facilidad en la manipulación y fabricación **Aplicaciones** Regeneración tisular: - Inducción tisular: scaffold sin células. Se liberan factores de señalización. Ej: Hueso, piel, ligamento. - Trasplante celular: scaffold + células - Prevascularización: scaffold + factores promotores angiogénesis (VEGF y bFGF) - Límite de difusión de oxígeno: 100-200 μm - Sistemas inyectables: polimerización in situ - Iniciación - Mínima invasividad Liberación de moléculas: factores de crecimiento, angiogénesis, hormonas, DNA, fármacos, citoquinas... **Composición Scaffolds** Polímeros Naturales: Quitosano, alginato, colágeno, seda, algodón y lana Polímeros Sintéticos - No biodegradables: poli etileno, poli propileno, poli tetrafluoroetileno, Nailon - Biodegradables: PLA, PGA y PLGA Técnicas: Extrusión, Hilado de fibras (Fiber spinning), Prototipado rápido (Rapid prototyping), Otras técnicas textiles **Fiber bonding (unión de fibras)** A través de procesos de fusión que mejoran las propiedades mecánicas del scaffold fibroso sin tejer que normalmente sufre deformaciones debido a las fuerzas contráctiles de las células - PGA-PLLA **2. Scaffolds microfibrosos** - Diámetro de las microfibras: 1-100 µm - Espacios intersticiales más grandes entre las fibras, proporcionando mayor porosidad macroscópica. - Adecuado para facilitar la penetración celular y vascularización **Aplicación biomédica** Elevada fuerza de tensión y elasticidad: tienen que ser capaces de transferir el estrés. - Reparación de heridas: suturas PGA y polipropileno - Ortopedia, reconstrucción y cirugías maxilofaciales - Aplicaciones en piel, tendones, manguito rotador, músculo y ligamento - Tejidos blandos: parches para la cicatrización - Cardiovascular: - Se desarrollan implantes cardiovasculares con una porosidad favorable, hemocompatibles y con buenas propiedades mecánicas - Injertos vasculares, válvulas cardíacas Sistemas asistentes del corazón - - - Musculoesquelético **3. Scaffolds nanofibrosos** - Diámetro de las nanofibras: 50-500 nm - Elevada porosidad (95%) lo que crea poros demasiado pequeños para el anidamiento de células grandes - Se pueden emplear formadores de poros (azúcar, sal, esferas de gelatina) durante el proceso de fabricación **Ténicas** - Separación de fases - Separación de fases inducido por temperatura - Pasos: - 1\. Se disuelve un polímero biocompatible y biodegradable en un disolvente. - 2\. Se provoca la separación de fases en la solución inducido por temperatura. - 3\. Formación de la estructura porosa: La fase rica en polímero solidifica, mientras que la fase rica en disolvente forma los poros. - 4\. Eliminación del disolvente. - - - - Auto-ensamblaje - Se produce la reorganización espontánea de las moléculas en una agregación con una estructura bien definida. - Compuesto por un péptido sintético basado en un motivo de péptidos autoensamblables, típicamente compuesto por 16 aminoácidos. Se forma una red similar a la estructura de la matriz extracelular, lo que permite un buen ambiente para el cultivo celular. - Los oligopéptidos son unidos unos sobre otros a través de uniones no covalentes sino iónicas, interacciones hidrofóbicas, fuerzas de Van der Walls o puentes de hidrógeno. - Se lleva a cabo en condiciones suaves evitando el uso de disolventes orgánicos → baja toxicidad - Fácil control de las características seleccionando las moléculas iniciales - Aplicación: neuronal, hueso, cartílago, vasos sanguíneos - Electrospinning - La técnica más usada, versátil (polímeros), simple, sencillo de modificar para obtener distintas fibras, bajo coste. Se pueden obtener injertos cutáneos, vasculares y dispositivos de administración de fármacos - Equipo: - 1.Reservorio con la solución polimérica → jeringa con una aguja de metal, conectada con la fuente de alimentación - 2\. Bomba de control del flujo → controla la cantidad de solución polimérica - 3\. Recolector: puede ser una superficie plana o un cilindro rotatorio - 4\. Fuente de alimentación energética → elevado voltaje para generar un campo eléctrico fuerte entre la aguja y el recolector - Una limitación inherente es la relativamente escasa infiltración celular en la profundidad de estos andamios. - Factores que afectan al proceso: - Extrínsecos: temperatura, humedad, etc (ambientales y fácilmente controlables en un laboratorio) - Intrínsecos: voltaje empleado, distancia entre la aguja y el recolector, conductividad, viscosidad polimérica (más complicados de controlar) - **Microestructura:** definida por la estructura física de las fibras y poros. Hace referencia a la morfología y diámetro de la nanofibra - Parámetros: - - - - - Macroestructura: definida por la arquitectura de la orientación al azar - Tejido sin tejer: la fibra polimérica es depositada al azar. Forma una estructura porosa con poros de varios tamaños - Nanofibras alineadas: colector rotativo para alinear las nanofibras electrohiladas. - Carga: ↑ carga ↑ alineación - Colector : ↑ velocidad giro ↑ alineación **4. Otras técnicas de síntesis de novo** **Bioimpresión tridimensional** Los biomateriales solos o combinados con células se depositan en capas siguiendo patrones predefinidos, con un ensamblaje ascendente para crear una estructura biológica en 3D. Es posible recapitular la estructura, composición y complejidad de los tejidos humanos. Tinta: polímeros, células o combinaciones de ambos Elevada resolución (5-50 μm), viabilidad celular, velocidades de impresión y bajos costes. Menor control de la direccionalidad de las gotas, encapsulación de células poco fiable (baja viscosidad del material), restricciones en las viscosidades de materiales que pueden utilizarse y limitaciones de la impresión vertical.  - Bioimpresión basada en extrusión: - Extrusión de filamentos cilíndricos continuos con sistemas neumáticos, accionados por pistones o asistidos por tornillos. - Dispensación continua de filamentos de polímero y/o hidrogel a través de una microboquilla (25-300 μm) de acuerdo con diseño digital 3D, mediante un movimiento controlado de los cabezales de impresión. - Bioimpresión basada en laser - Mejor integridad estructural pero peor resolución en comparación con inyección de tinta. Pueden utilizarse para formar scaffolds 3D porosos y tejidos de tamaño humano.