Materiali per l'ingegneria dei tessuti PDF

Il gene è una porzione di DNA che codifica la produzione di una proteina, contiene anche delle zone di controllo che segnalano dove, quando e quanta proteina produrre e segnali di stop della codifica. Le biotecnologie tradizionali fanno uso di microrganismi allo scopo di produrre quantità commercial...

Il gene è una porzione di DNA che codifica la produzione di una proteina, contiene anche delle zone di controllo che segnalano dove, quando e quanta proteina produrre e segnali di stop della codifica. Le biotecnologie tradizionali fanno uso di microrganismi allo scopo di produrre quantità commerciali di prodotti utili all'uomo, per migliorare piante e animali o svilupparne altri per usi specifici. Queste vengono usate per la produzione di cibi, bevande e per agricoltura. Le biotecnologie avanzate invece consistono nell'usare cellule, organismi, virus o enzimi modificati e vengono usate per modificare uno specifico gene o parti più estese del genoma in modo predeterminato, intenzionale e controllato sia di organismi semplici che di grande complessità. Modificazione genetica: fino a qualche anno fa veniva molto usate tecniche che lavoravano con DNA ricombinante, DNA modificato tagliandolo (tramite enzimi di restrizione) e riattaccandolo (ligasi) in modo da sostituire, eliminare o aggiungere un gene con sequenze provenienti anche da individui di specie diverse. Questa tecnica viene usata anche su plasmidi, cioè molecole circolari di DNA presenti in batteri o lieviti. Una tecnica sviluppatasi molto invece negli ultimi anni è la modificazione tramite sistema CRISPR, che è applicabile a cellule viventi e copia il meccanismo con cui i batteri reagiscono ai virus, che taglia porzioni di DNA e lo sostituisce con altre. Trasferimento genico (cosa faccio con il DNA modificato?): plasmide nudo-> posso trasferirlo ma funziona solo con alcuni tipi di cellule. Il plasmide modificato viene poi inserito nel cromosoma batterico tramite uno shock elettrico o termico vettori virali-> i virus sono in grado di infettare le cellule e indurle a esprimere il loro genoma e quelli ricombinati non sono in grado di replicarsi ma contengono le informazioni di interesse terapeutico. Non è facile però perché i virus infettano le cellule ma poi dovrebbero oltrepassare anche la membrana del nucleo. I virus a DNA possono essere batteriofagi o adenovirus; ci sono poi quelli a RNA come i retrovirus. Hanno alta efficienza di transfezione e una naturale ed evoluta capacità di infezione e rilascio endosomiale; c'è tuttavia il rischio di oncogenesi, possibili problemi di immunogenicità e alti costi di produzione. vettori non virali->vengono usate molecole sintetiche come polimeri oppure liposomi per trasportate il gene nel nucleo della cellula. I lipoplessi sono formati per interazioni elettrostatiche tra liposomi e DNA, mentre i poliplessi sono per le interazioni tra le cariche positive dei polimeri e il fosfato del DNA; i polimeri sono in grado di superare le barriere cellulari (sia la membrana cellulare che quella del nucleo). Hanno bassa efficienza di trasmissione ma non ci sono limiti sulle dimensioni del DNA, c'è la possibilità di modifiche chimico-strutturali, sono riproducibili con bassi costi di produzione e bassa o nulla immunogenicità CRISPR-> modifica cellule viventi senza necessità di un successivo trasferimento Il trasferimento genico è ostacolato da barriere extracellulari come la degradazione del DNA nel plasma e la bassa capacità di centrare il target e da barriere intracellulari come il trasporto attraverso varie membrane (cellulare, endosomiale e nucleare), l'azione lisosomica degradativa e il passaggio attraverso il citoplasma. I lipoplessi passano attraverso la membrana per fusione (si fingono parte di essa) mentre i poliplessi entrano per endocitosi; una volta entrati però vengono accolti da un ambiente acido creato dalla cellula per cercare di degradare il corpo estraneo ma i polimeri neutralizzano l'aumento del pH e vengono poi liberati dall'endosoma. I polimeri cationici possono essere sintetici (PEI-polietilenimina, PLL, PMAM) o naturali (chitosano, collagene) Dopo queste modificazioni si ottengono organismi transgenici, cioè organismi che contengono geni provenienti da altre specie e lo si fa per produrre cose utili all'uomo come enzimi la cui mancanza determina una particolare patologia; il gene per produrlo viene aggiunto nel DNA delle pecore nella regione che regola la produzione di proteine nel latte e si ottengono pecore transgeniche che producono latte con l'enzima all'interno. Altri esempi sono grano resistente all'attacco degli insetti o soia resistente agli erbicidi, o addirittura piante che contengono prodotti chimici come cotone colorato. Le biotecnologie possono essere usate per produrre materiali come proteine ingegnerizzate, anche che non esistono tramite geni sintetici, progettati per produrre specifiche sequenze amminoacidiche per controllare proprietà strutturali come domini fibrosi, siti di aggregazione, domini elastici o nano e microcapsule o proprietà biologiche (domini adesivi, siti catalitici, strutture in grado di legare il DNA). Un esempio è il biosteel Nexia, una fibra flessibile e molto resistente simile alla seta di ragno prodotta nel latte di capre transgeniche. Si possono anche usare nella terapia genica che consiste nella modificazione permanente o temporanea del patrimonio genetico di cellule o tessuti che sostituisce geni difettosi con quelli sani. Questa è difficile da applicare perché va conosciuto il gene esatto che causa il problema e è necessario avere metodi efficaci (il gene deve esprimersi a livelli terapeuticamente e l'espressione deve essere regolabile) di trasferimento genico e assenza di tossicità o effetti collaterali. Sono materiali che usano le proteine come materiale di base, vengono usati molto a contatto con il sangue. COLLE DI FIBRINA: l'idea è di usare coaguli sintetici come materiali e si ottengono riproducendo il passaggio da fibrinogeno a fibrina. La cascata della coagulazione viene replicata mettendo in una siringa calcio cloruro e trombina, nell'altra fibrogeno liofilizzato, fattore XIII, fibronectina e aprotinina (inibitore della degradazione del coagulo, meccanismo presente nel nostro corpo). Il comportamento dell'adesivo è influenzato da vari fattori. Tempo di polimerizzazione: determinato dalla concentrazione di trombina Foza di adesione del coagulo: direttamente correlata alla concentrazione di fibrinogeno Tempo di permanenza nel corpo (è un materiale degradabile): determinato dalla concentrazione di aprotinina (max 12 gg). Per farla si estrae del sangue dal paziente e lo si centrifuga, trasferendo poi il plasma nella siringa che verrà unita a un'altra con il preparato già all'interno. Si usa per fermare il sanguinamento in zone dove non sono necessarie grandi proprietà meccaniche, sfruttando un meccanismo fisiologico. Possono essere usate anche al posto delle suture, ad esempio, nel fissaggio di reti di contenimento per ernie. SETA: si usa un filamento serico, composto da fibroina e sericina, che ha però un effetto infiammatorio e va rimossa tramite il processo di sgommatura, cioè l'eliminazione con soluzioni alcaline o acide della sericina (T=100°C). Dopo di che c'è il processo di estrazione da cui si ottiene la fibroina rigenerata che può essere lavorata come polvere, membrana o gel. A livello molecolare è formata da glicina, alanina, serina e tirosina, presente in piccole quantità ma che conferisce proprietà importanti come la resistenza meccanica. La fibroina ha due forme cristalline: SILK I α-elica-> solubile in acqua e necessaria per le membrane ma instabile che tende a trasformarsi spontaneamente in SILK II β-sheet-> insolubile in acque e molto stabile Ha un'ottima combinazione di resistenza, elasticità e comprimibilità, è molto tenace, più di ogni altra fibra naturale e di molte sintetiche. In vivo si degrada in anni (degradazione a lungo termine), poiché il corpo umano non la produce e di conseguenza non ha meccanismi di degradazione; la resistenza a trazione viene mantenuta fino a un anno dall'impianto, ma dopo due non è più possibile rilevarne la presenza. Poiché le proprietà vanno sempre viste nel contesto, se consideriamo una scala di settimane possiamo considerarla non degradabile. Ci sono vari tipi di seta che possono essere usate per applicazioni diverse, come materiali di rivestimento per la guarigione delle ferite o biosensori (in forma di film), rilascio di farmaci (idrogelo), ingegneria dei tessuti (tessuto non tessuto); quella prodotta dal ragno della seta dorata ha resistenza a rottura superiore di quella dell'acciaio nonostante il peso inferiore a qualunque filato sintetico. L'allungamento a rottura è paragonabile a quello delle gomme, ha capacità di assorbimento dell'acqua e si degrada in tempi lunghi. COLLAGENE: composto da Gly-X-Y (solitamente prolina e idrossiprolina), tra molecole proteiche si stabiliscono legami H e ponti di reticolazione; più il materiale è reticolato più è rigido. Può essere usato come materiale da costruzione, isolabile da animali; con questo processo di ottiene una proteina che ha perso però molte proprietà meccaniche e per questo si reticola (chimicamente o fisicamente) come una rete 3D, anche per evitare una degradazione troppo rapida. Dei reticolanti molto usati sono le dialdeidi e in particolare la glutaraldeide, in cui il gruppo carbonile reagisce con dei gruppi amminici, soprattutto della lisina, rilasciando poi una molecola d'acqua. La reticolazione è una reazione chiave per il collagene e i tessuti collagenosi. Ha molti vantaggi: -biocompatibilità: essendo formato da amminoacidi è simile a ciò che si trova già nel nostro corpo, anche se le aldeidi non sono completamente sicure per il nostro organismo. -degradabile con prodotti di degradazione ben tollerati (amminoacidi) -riconoscimento e attivazione cellulare Tuttavia, ci sono anche dei lati negativi che costituiscono l'altro lato della medaglia dei biomateriali naturali: sono biocompatibili perché vengono ottenuti da organismi simili al nostro ma questo comporta il rischio della trasmissione di malattie; il materiale o i prodotti di degradazione possono attivare la risposta immunitaria e i residui dell'agente reticolante sono nocivi per il nostro organismo. Si usa soprattutto nell'ingegneria dei tessuti, per la cura delle ferite e per il rilascio controllato di farmaci (come anche la seta). I tessuti collagenosi vengono formati grazie al legame tra le aldeidi della glutaraldeide e la lisina. La detossificazione poi trasforma l'aldeide in un agente innocuo e rimuove i residui di reticolazione. Il pericardio bovino è un esempio di tessuto collagenoso: la membrana di pericardio viene usata per fare i foglietti valvolari ma solo dopo essere stata reticolata, per renderla più stabile e diminuire l'effetto immunogenico. Le valvole cardiache possono essere fatte da pericardio bovino, valvole porcine o da donatori cadaveri. Questo materiale è facilmente sagomabile e reticolabile e oltre alla ricostruzione e riparazione dell'area cardiaca (difetti del setto atrio-ventricolare, chiusura del pericardio, operazioni cardiache pediatriche) viene usato anche per la riparazione dei tessuti molli (ernie, difetti della parete addominale e toracica) e per rinforzare le linee di sutura dopo operazioni chirurgiche generiche. Inoltre, una volta reticolati e poi ritorti possono dare origine anche a fili di sutura riassorbibili, composti da collagene CATGUT; sono ottenuti da intestino di pecore o cape e eventualmente trattati con sali di acido cromico. Vanno mantenuti umidi fino all'utilizzo e si degradano completamente in tre mesi, anche se le proprietà di resistenza a trazione si perdono dopo circa sette giorni. Questo argomento è trasversale a tutti i materiali e a tutti i tipi di lavorazioni, poiché la sterilità di un dispositivo è necessaria per evitare l'insorgere di infezioni, ma anche per evitare contaminazioni nei test in vivo e in vitro. Sterilizzazione=distruzione o eliminazione di tutti gli organismi e microorganismi (batteri, lieviti, muffe, virus) viventi dal dispositivo. Il concetto di sterilità è diverso da quello di pulizia, che viene intesa come rimozione di polveri, grassi e residui di lavorazione. Le tecniche di sterilizzazione si basano sull'idea di degradare qualcosa di fondamentale per la vita dei microorganismi. Una problematica non trascurabile però è che i materiali polimerici sono organici e possono degradarsi anche loro durante il processo di sterilizzazione; per questo la scelta della tecnica non è facile. Una prima tecnica è la filtrazione in cui si usano filtri di circa 0.2 micrometri senza dover degradare nulla; funziona con il monomero di metilmetacrilato. Altre possibilità sono l' incenerimento, la bollitura, il vapore umido. STERILIZZAZIONE IN AUTOCLAVE si basa sull'uso di calore e vapore (=vapore secco) per denaturare termicamente o ossidativamente le proteine e degradare i lipidi (efficace). Le temperature variano tra i 121°-135°C e per questo non posso usarlo su tutti i materiali (polimeri hanno Tm basse) tuttavia è molto efficace perché il vapore raggiunge ogni superficie e distrugge componenti essenziali per la replicazione dei microrganismi. Il processo tipico dura dai 10 ai 15 minuti (veloce) dopo il raggiungimento della temperatura minima (121°) su tutte le superfici. Gli strumenti sono utilizzabili subito dopo il raffreddamento e per questo motivo viene usato negli ospedali per la sterilizzazione di dispositivi metallici. Il processo è semplice e non lascia residui tossici OSSIDO DI ETILENE (ETOX) lavora invece sugli acidi nucleici, alchilizzando i loro gruppi amminici. L'ossido di etilene è un gas (T ebollizione=11°C) molto tossico, mutageno e cancerogeno e per questo va fatto in centri specializzati (in Europa ci sono solo due). Essendo molto volatile diffonde con estrema facilità nei polimeri, raggiungendo sia le superfici che l'interno: per questo dopo il ciclo di sterilizzazione gli oggetti vanno tenuti un paio di giorni in armadi di aspirazione per evitare rimanga la presenza di residui e non sono quindi immediatamente utilizzabili. Inoltre, se puro è altamente esplosivo e infiammabile. Nonostante tutto è estremamente efficace, inattiva tutti i tipi di microrganismi, incluse le spore, reagendo con componenti vitali per il metabolismo e la riproduzione (acidi nucleici e proteine) con effetti termici trascurabili: tutto il processo avviene infatti a massimo 60°C e per questo posso usarlo sui materiali polimerici, a patto di prestare attenzioni alla possibile modificazione della struttura e delle proprietà di alcuni polimeri. Il processo è complesso e richiede fino a otto ore, più il tempo di aerazione con ventilazione forzata a 50/60°C. RADIAZIONI IONIZZANTI tramite raggi gamma e fasci di elettroni degradano i materiali ionizzando il DNA o creando radicali liberi che lo ionizzano e spezzando catene di proteine, portando alla morte cellulare tramite l'inibizione del metabolismo e della riproduzione. Hanno alta efficienza e effetti termici trascurabili , tuttavia è possibile la degradazione della struttura e delle proprietà di alcuni polimeri (funziona solo con UHMWPE). I fasci di elettroni sono elettroni accelerati e la penetrazione nel materiale dipende dall'energia della particella e dalla densità del materiale mentre le radiazioni gamma hanno una capacità di penetrazione dieci volte maggiore ma non sono facili da produrre (centri specializzati). Le radiazioni non vengono conservate dai materiali che sono quindi immediatamente utilizzabili, tuttavia, dato che sono onde, è possibile si formino zone d'ombra, rendendo la sterilizzazione non omogenea. Per risolvere questo problema è stata ideata la sterilizzazione a plasma, che consiste nell'esporre una superficie a un gas che è stato ionizzato da un campo di energia. Il plasma è un gas in cui sono presenti elettroni o cariche elettriche, ha alta energia e alte temperature, ma è possibile generarlo in condizioni di vuoto a energie e temperature minori applicando a un gas campi elettrici ad alta frequenza (plasma freddo/a bassa pressione) e ciò lo rende idoneo a essere usato per la sterilizzazione (T