Ingineria Tisulară - Tesut Osos PDF

INGINERIA TISULARĂ – TESUT OSOS Curs X-XI Prof. Dr. Ing. Mariana IONIȚĂ Dr. Ing. George Mihail VLASCEANU  IT a materialului osos Osul = tesut inalt specializat, adaptat solicitărilor me...

INGINERIA TISULARĂ – TESUT OSOS Curs X-XI Prof. Dr. Ing. Mariana IONIȚĂ Dr. Ing. George Mihail VLASCEANU  IT a materialului osos Osul = tesut inalt specializat, adaptat solicitărilor mecanice prin modelare şi remodelare Trei funcţii fundamentale  funcţia de suport structural  funcţia de echilibru mineral  funcţia de hematopoeză ECM mineralizata - rigiditate, rezistenta, dar si un anumit grad de elasticitate Celule - osteoblaste, osteocite, osteoclaste https://ww.bing.com/images/search?view=detailV2&id=AD2DAAE330692FE97F451349AA2CED4E263E66AA&thid=OIP.CpG3LVfQwJv95Z1QzLPeowHaET&mediaurl=https%3A%2F%2Fwww.prstemcell.org%2Fimages%2Farticle%2Fst ructura-osului.jpg&exph=346&expw=595&q=os+spongios&selectedindex=0&ajaxhist=0&vt=0  IT a materialului osos Matrice organica – 35 % - 95% colagen tip I, 5% PG si proteine non- colagenice); Matrice anorganica – 65 % - depozite de saruri, in principal Ca si fosfati sub forma de hidroxiapatita). Cortical sau spongios (trabecular). https://ro.pinterest.com/pin/140948663313505864/  IT a materialului osos Cele mai comune cauze ale distrugerii osoase sunt: o Traumele; o Infectiile; o Bolile degenerative (osteomielita, osteoporoza);  IT a materialului osos Defectele osoase: o Lipsa tesutului osos dintr-o anumita zona a organismului in care ar trebui sa existe, in mod normal si care rezulta in formarea unei pseudoartroze; o Metode de reconstructie osoasa: decorticarea, excizia si fixarea, grefarea osului spongios, metoda de reconstructie prin transport intern de os (metoda Ilizarov), ingineria tisulara. https://ourorthopaedics.blogspot.com/2010/01/83-ilizarov-external-fixator.html  IT a materialului osos grefarea osoasa, stabilita în 1800 înlocuia lipsă de material osos cu autogrefă sau alogrefa  IT a materialului osos Matrice biocompatibila și biodegradabila introdus într-un defect osos pentru a induce vindecarea oaselor scaffolduri goale scaffolduri complexe - sisteme de livrare sau purtatoare de celule, factori de crestere, medicamente https://free3d.com/3d-model/sponge-spongy-bone-structure-3574.html  IT a materialului osos Factori importanți implicați în proiectarea de scaffold-uri pentru reconstructii osoase  IT a materialului osos Procesabilitate, ușor de realizat în forme neregulate de constructii care se potrivesc cu defectele in oase.  IT a materialului osos Bioceramicile Biopolimerilor Polimeri sintetici Polimer sintetic / biopolimeri Materiale compozite Polimeri și ceramică ( biosticle ) Polimeri-nanotuburi de carbon ( CNT ) Compozite biopolimer - grafena  IT a materialului osos Bioceramicile Stiff or Scaffold Composition Pros Cons Moldable Hydroxyapatite native inorganic Ca10(PO4)6(OH)2 brittle & resorbs slowly stiff (HA) bone matrix Beta-Tricalcium native bone significantly less bone laid Phosphate Ca3(PO4)2 calcification stiff down than β-TCP resorbed (β-TCP) minerals highly moldable & Calcium sulphate CaSO4·2H2O not native bone material moldable easily shaped composed of native not as much known about Octacalcium Ca8H2(PO4)6.5H2O bone minerals, material as traditional stiff Phosphate osteoinductive calcium phosphate customizable & Advanced can be generated new & underdeveloped variable moldable nanomaterials desired technology characteristics  IT a materialului osos Biopolimerilor chitosan , colagen sau fibrină biocompatibilitate , biodegradabilitate, bioadezivitatea, activitate antibacteriană , etc prelucrabilitate precara , proprietăți mecanice și costuri ridicate. Polimeri sintetici procesare excelenta, biocompatibili și biodegradabili cu rata de degradare modulabila proprietati mecanice previzibile și reproductibile provoca reacții inflamatorii persistente, nefiind compatibil sau capabil să integreze cu țesuturile gazdă.  IT a materialului osos Polimer sintetic / biopolimeri. fabricate în varietate de forme ( hidrogeluri, filme, fibre, bureți, și micro- , nano -particule) de obicei, aceste materiale prezintă modulul lui Young de 1.8-4 GPa iar modulul lui Young pentru pentru os variază pana la aproximativ 17 GPa în direcție longitudinală la aproximativ 10 GPa în plan transversal. amestecurile polimer sintetic - biopolimer necesită schimbări chimice semnificative în structura lor pentru astfel de aplicații. Totuși efectuarea acestor modificări chimice implica adesea utilizarea unor compuși care pot induce citotoxicitate.  IT a materialului osos Materiale compozite Polimeri și ceramică ( biosticle ) au capacitatea de a se degrada in vivo sunt candidații ideali pentru scaffold-uri care se degradează treptat, în timp ce noul tesut este format Polimeri-nanotuburi de carbon ( CNT ) Datorită funcționalităților acestora CNT pot furniza urmărire mai bună a celulelor, conductivitatea electrică, livrarea de factorii de crestere sau medicament, și consolidarea mecanică a scaffold-urilor. Rugozitate modulabila.  IT a materialului osos Citotoxicitatea CNT catalizatorul metalic folosit la fabricarea CNT pentru aplicații biomedicale, în special cele care implică plasarea în interiorul corpului, se confruntă cu problema toxicitatea legată și de inserție CNT dintre bistratul lipidic al membranei celulare, ceea ce conduce la perturbarea membranei si moartea celulelor  IT a materialului osos Compozite biopolimer - grafena conductivitate electrică si termica bună excelente proprietati mecanice capacitate de ranforsare superioara CNTs  IT a materialului osos Grefarea osoasa, stabilita în 1668 sau 1800 Autogrefă osoasa – “gold standard” Avantaje Osteoconductiv (arhitectura / suportul ideal) Osteoinductia (factori de crestere / biomolecule) Osteogeneza (celule, vase de sange ) Dezavantaje surse reduse morbiditatea zonei de prelevare  IT a materialului osos Alogrefa osoasa Avantaje Osteoconductiv / Osteoinductiv Dezavantaje riscul de transmitere a bolilor (risc transmitere HIV 1:1500000, hepatita C 1:60000) poate declansa un raspuns imun din partea organismului Minimizarea riscului alogrefelor - prelucrare- fizica (congelare / liofilizare) sterilizare fizica - radiatie gama sterilizare chimica - oxid de etilena  IT a materialului osos Alogrefa osoasa Stare naturala -activitate antigenica ridicata, timp limitat pentru a testa imunogenitate / boli Stare congelata din stare naturala – mai puțin antigenic, timp de testare pentru boli (reglementate strict de către FDA), pastreaza proprietatile biomecanice, eficiente ca grefe structurale Deshidratate- mai puțin antigenic, timp pentru a fi testate pentru boli, pot fi păstrat la temperatura camerei până la 5 ani, proprietățiile mecanice potrivite se degradeaza.  IT a materialului osos Grefa osoasa - matrice osoasă demineralizată Matrice osoasă demineralizată (MOD) - este produsa prin extracția acidă din alogrefa (os cortical) MOD –proteine necolagenice, colagen de tip 1 (schela osteoconductiva), daca se adauga factori de creștere (osteoinductive). MOD este disponibil în mai multe forme - pulbere liofilizată, granule, gel, chit, și benzi. Capacitate de regenerare osoasa depinde de procesul de fabricație.  IT a materialului osos Substituenti de os hidroxiapatita coralina / hidroxiapatita Aprobat de FDA in 1992, este produs din schelet de coral marin, are structura asemănătoare de pori cu osul spongios. 2013, în revista Biomedical Materials- vindecarea osului a fost observată la fiecare dintre pacienți după patru luni, dar sa biodegradat complet după doi ani. Consens ? Blocuri de hidroxiapatita coraline pot rămâne vizibile pe radiografii de până la 10 ani.  IT a materialului osos Substituenti de os hidroxiapatita coralina / hidroxiapatita Încorporarea parțială a grefei de hidroxiapatită la un an post-operator  IT a materialului osos Substituenti de os Comercializate -ProOsteon de Interpore Cross Disponibil în dimensiuni diferite de blocuri și granule ProOsteon 500- Resorbție foarte lenta ProOsteon 500 R-Numai un strat subțire, resorbție mai rapida  IT a materialului osos Substituenti de os pe baza de colagen Aprobate de FDA în 1991 Xenogrefe constând din benzi poroasede colagen bovin, combinate cu hidroxiapatita. Matricea pe bază de colagen este osteoconductiva. Rezistenta la compresiune este mai mică decât cea a osului spongios, ele sunt cu succes utilizate ca grefa de suprafață Collagraft (Zimmer) Healos (Depuy)  IT a materialului osos Substituenti de os pe baza de fosfat de calciu - pastă injectabila - de 4 până la 10 ori rezistența la compresiune mai mare decat osul spongios - proprietati osteoconductive - util în cazul în care rezistența mecanică Vitoss (Orthovita) suplimentară este necesara ChronOS (Synthes) Conduit (DePuy) - studiile au demonstrat că 95 la sută din Cellplex TCP (Wright Medical) fosfatul de calciu este resorbit în 26-86 Various Their (Therics) saptamani  IT a materialului osos Substituenti de os pe baza de fosfat de calciu Injectabil  IT a materialului osos Substituenti de os pe baza de sulfat de calciu Se resoarbe în 4 până la 12 săptămâni, făcându-l cel mai rapid dintre produsele osteoconductive disponibile în prezent. Datorită ratei rapide de resorbție, sulfat de calciu este folosit pentru extinderea (extender) timpului de viata a grefei osoase. Proprietati mecanice slabe. Osteoconductiv. Osteoset, Calceon 6, Bone Blast, etc  IT a materialului osos Restaurarea structurii si functiilor in cadrul ingineriei tisulare osoase: o Scaffoldurile pentru substitutia osoasa o Prin combinarea cu proteine morfogenice osoase (BMP) se obtin efecte sporite de vindecare; o Grefele compozite constau de regula dintr-o matrice osteoconductiva si agenti bioactivi, care aduc proprietatile de osteoinductie si osteogeneza;  IT a materialului osos Proteine morfogenice osoase recombinante BMP-2 (Infuse) Medtronics BMP-7 (OP-1) Stryker Biotech BMP-9 Leaga receptorii prezenti la nivelul membranei celulelor stem mezenchimale, receptorii produc un semnal care determina transformarea celulelor in celule progenitoare specifice. Limitari- costuri extrem de ridicate, sarcina, cancer, imaturitate a oaselor.  IT a materialului osos Proteine morfogenice osoase recombinante BMP-2  0.75 mg/ml BMP-2  1.50 mg/ml BMP-2 Reducere de 44% riscului de pseudartroza la doze mari de BMP-2 fractură se vindeca mult mai rapid semnificativ mai puține intervenții esuarea datorata proprietatilor mecanice mai mici rata infecțiilor mai mica  IT a materialului osos Terapia celulara (TC) TC = in cadrul unui tesut, sunt aplicate celule, spre a le substitui pe cele distruse si a se recapata functiile si integritatea acestuia; IT= mai complexa, incluzand: molecule bioactive (osteoinductie), insamantarea unor celule si substituenti celulari in matrici 3D (raspuns la semnale, etc), suport nutritional adecvat (angiogeneza).  IT a materialului osos Celulele implicate in remodelarea osoasa: o Osteoblaste; o Osteoclaste; o Osteocite;  IT a materialului osos Restaurarea structurii si functiilor in cadrul ingineriei tisulare osoase: o Presupune izolarea, cultura si reimplantarea celulelor (necesita folosirea unui scaffold si/sauGF); o Cele mai potrivite celule sunt cele stem mezenchimale, avand ca principal avantaj faptul ca reprezinta o sursa celulara atat pentru repararea osoasa, cat si pentru cea cartilaginoasa; o cele stem mezenchimale – omogenitaea / heterogenitate.  IT a materialului osos Celulele stem : (A) se diferentiaza direct in celule specifice tesutului, substituindu-le pe cele afectate; (B) influenteaza indirect regenerarea tisulara, prin secretia de factori solubili, care promoveaza vascularizarea, proliferarea si diferentierea celulara; (C) moduleaza procesele inflamatorii.  IT a materialului osos Surse de celule stem: o Adulte mezenchimale, de provenienta: o Medulara (mediul de cultura trebuie sa fie bogat in fosfati); o Periostala (capacitate de mineralizare si neovascularizare mai buna si eficacitate in vindecare); o Adipoasa (liposuctie sau indepartarea chirurgicala a tes. adipos = considerate in general reziduuri medicale; necesita cresterea FA si a altor proteine osteogenice; rezultate slabe) o Pluripotent-induse: sursa autologa; se pot diferentia in osteoblaste sau CSA (prin inducerea unui fenotip mezenchimal); REGENERAREA CARTILAGIILOR- INGINERIE TISULARA  IT –Tesutul cartilaginos Ingineria tisulara – surse de celule factori de crestere factorul de transformare a cresterii beta- TGF-β factor de crestere insulinic (IGF) scaffold-uri IT –Tesutul cartilaginos  IT –Tesutul cartilaginos Cartilagiile articulare = cartilagii hialine compuse din ECM, o populatie celulara redusa si putine vase de sange, vase limfatice si nervi. Condrocitele → au activitate metabolica redusa (diviziune redusa sau lipsa); → sunt responsabile de mentinerea unicitatii compozitionale si organizatorice a matricii dezvoltate in perioada embrionara si postnatala. → dezvolta reteaua/scheletul macromolecular al ECM din 3 clase de molecule: colagen, PG si proteine non-colagenice; IT –Tesutul cartilaginos  IT –Tesutul cartilaginos Homeostazia cartilajului articular o Este compus din 4 regiuni distincte, care difera prin orientarea fibrilelor de colagen: - z. superficiala sau tangentiala (200μm) - fibrile dispuse tangential, paralel cu suprafata; - z. mijlocie sau tranzitionala – fibrile mai groase, organizate aleator; - z. profunda sau radiala – fibrilele sunt organizate in manunchiuri si orientate radial fata de suprafata; - z. cartilajului calcificat – localizata deasupra osului, compus din vezicule matriceale + vascularizatii si inervatii ale acestuia; contine colagen de tip X. Densitatea celulara scade de la suprafata spre profunzime. IT –Tesutul cartilaginos  IT –Tesutul cartilaginos Homeostazia cartilajului articular: o Condrocitele sunt capabile sa traiasca in conditii limitate de vascularizare, deci nutritie si oxigenare; o Contine o varietate de PG esentiali unei functionari normale: agregan, decorin, biglican, lumican. Sunt foarte importanti pentru protectia retelei de colagen; o In timpul vietii, este remodelat in mod continuu de catre condrocite; o ECM a fost divizata si ea in zone, in functie de distanta fata de celule. IT –Tesutul cartilaginos  IT –Tesutul cartilaginos Defectele cartilagiilor: o Boli degenerative (OA = osteoartrita); o Speciile reactive de oxigen → schimbari musculoscheletale normale, survenite in timp, dar care contribuie la dezvoltarea osteoartitelor; o Traumatismele.  IT –Tesutul cartilaginos Fisuri si clustere celulare in zona superficiala Metode de tratament: o Artroplastia; o Ingineria tisulara:  IT –Tesutul cartilaginos Artroplastia -principala metoda de tratament; -dezavantajele materialelor actuale: nu rezista la activitatile fizice ale pacientilor si sunt predispuse la cedare prin oboseala, isi pierd proprietatile sau se distrug in anumite conditii; Semnalele biologice trebuie sa fie transmise optim la nivelul ECM, astfel incat sa fie evitate procesele inflamatorii, in vreme ce procesele regenerative sa fie initiate si stimulate.  IT –Tesutul cartilaginos Ingineria tisulara: -se adreseaza mai mult populatiei tinere si in prezent este aplicata cu precadere in cazul leziunilor traumatice minore. - in cazul OA, situatia sta un pic diferit. In conditii de boli degenerative, tratamentul prin TE inca prezinta numeroase deficiente, explicate in general prin extinderea bolilor ce afecteaza articulatia OA. Astfel, TE ar trebui sa abordeze anumite fenomene, cum ar fi blocarea productiei de factori pro-inflamatori si inhibarea progresului degenerarii ce afecteaza atat tesutul cartilaginous, cat si pe cel osos.  IT –Tesutul cartilaginos Exista 2 metode principale de TE, dupa cum urmeaza: 1. Implantarea de condrocite autologe (ACI = Autologus chondrocite implantation); 2. Productia de tesut neocartilaginos.  IT –Tesutul cartilaginos 1. ACI: - reprezinta terapia celulara clinica dominanta in acest domeniu, din ultima decada; - condrocitele articulare sunt implantate sub un lambou periosteal (segment, fasie), dupa debridarea chirurgicala a leziunii (suprimarea bridelor care comprimă un organ); - rezultate excelente pe termen scurt-mediu; pe termen lung – neclar, exista controverse;  IT –Tesutul cartilaginos 2. Obtinerea de tesut neocartilaginos: Celule + biomateriale + sisteme de bioreactoare + GF;  IT –Tesutul cartilaginos Ambele metode presupun izolarea celulelor si inmultirea acestora in vitro. Degradarea enzimatica a ECM din timpul procedurii de izolare afecteaza celulele, fapt demonstrat prin modificarile de profil genetic exprimat de catre acestea. Dupa insamantarea/atasarea initiala, celulele incep sa prolifereze, devin fibroblast si adopta o morfologie poligonala. Modificarile fenotipice sunt acompaniate de comutari in expresia genelor, care includ pierderea de colagen de tip II, IX si XI si agregan, concomitent cu cresterea cantitatii de colagen tip I, III si V. O data cu prelungirea timpului de cultura, profilul markerilor de suprafata se schimba, devenind similar celulelor progenitoare mezenchimale. Prin insumarea acestor schimbari definim termenul “de- diferentiere”. Anti de-diferentiere: Au fost abordate o serie de metode de crestere a condrocitelor in suspensii si evitarea de- diferentierii, inclusiv pe suprafete plastice non-aderente, in agaroza sau geluri de alginat, insa desi condrocitele si-au pastrat capacitatea de a sintetiza ECM, rata de proliferare a fost afectata semnificativ. Promovarea re-diferentierii, prin: cresterea celulelor de-diferentiate in conditii 3D (ex: culturi micro-granulare si pe scaffolduri nat/artif), suplimentarea mediului, varierea presiunii oxigenului si stimularea mecanica.  IT –Tesutul cartilaginos Scaffoldurile: Aplicatiile variaza de la substitutia unor segmente periosteale din cadrul ACI pana la dezvoltarea sistemelor de eliberare controlata, care sa stimuleze capacitatea de regenerare tisulara si sa reduca procesele inflamatorii, asociate OA; Substitutia unor segmente periosteale - substitutia unor segmente periosteale din cadrul ACI => scaffolduri inalt poroase, care sa mentina celulele diferentiate in zona de interes sau sa incurajeze proliferarea condrocitelor, prin favorizarea migratiei celulare; Dezvoltarea sistemelor de eliberare controlata - trebuie avute in vedere: natura si tipul defectului de corectat (din care rezulta dimensiunea si forma substituentului) corelate cu conditiile articulare ale gazdei; in cazul OA, pe langa tesutul cartilaginos, solutionarea mai implica sinoviala si osul subcondral, intrucat si acestea sunt afectate de boala.  IT –Tesutul cartilaginos Scaffoldurile - Biomateriale o Polimeri naturali proteici: fibrina, colagen, gelatina; o Polimeri pe baza de carbohidrati: agaroza, alginat, chitosan; o Polimeri artificiali: Dacron® (PET), teflon (PTFE), fibre de C, poliesteruretani, ac. polibutiric, HA; o Combinatii ale claselor de mai sus: reticulare, modificari chimice, modificari geometrice, combinatii de matrici.  IT –Tesutul cartilaginos Bioreactoare = dispozitive ce permit controlul si reproductibilitatea parametrilor fizicochimici de cultura. In acest fel, este imbunatatita calitatea tesutului neoformat si sunt eficientizate procesele de obtinere.  IT –Tesutul cartilaginos 1. Bioreactoare pentru stabilirea si mentinerea culturilor 3D: Primul pas in generarea ex vivo a unei grefe de cartilaj presupune insamantarea celulelor condrogenice pe un scaffold poros, stabilind astfel mediul 3D si influentand uniformizarea straturilor celulare succesive. Tehnica cea mai comuna consta in simpla pipetare a unei suspensii celulare foarte concentrata (densa) pe suportul corespunzator, insa –fiind un proces manual si dependent de manipulator- prezinta lipsuri in ceea ce priveste controlul si reproductibilitatea. In acest sens, se pot utiliza bioreactoarele cu vas agitator pentru scaffoldurile subtiri si inalt poroase; in cazul celor cu grosime mare sau porozitate redusa insa, celulele nu pot penetra suficient in profunzime. Prin perfuzarea suspensiilor celulare direct prin pori (bioreactoare cu perfuzie) se obtin structuri celulare uniforme, cu proprietati superioare tehnicilor mentionate mai sus.  IT –Tesutul cartilaginos Bioreactoare cu perfuzie:  IT –Tesutul cartilaginos Bioreactoare pentru stabilirea si mentinerea culturilor 3D: Al doilea pas consta in mentinerea distributiei si viabilitatii celulare in regiunea interna, pe parcursul intregii perioade de cultura. Din cauza limitarilor de transfer de masa, structurile cartilaginoase obtinute prin metode statice sunt cel mai adesea neomogene (structura + compozitie) si contin o regiune centrala de necroza hipoxica si straturi dense de celule viabile in zona periferica. Bioreactoarele cu vas agitator sau rotativ faciliteaza transferul de masa spre/dinspre structurile condrocite+scaffold, marind concentratia de molecule specifice cartilagiilor, in zona centrala. Sistemele de bioreactoare care perfuzeaza mediul de cultura prin porii scaffoldului favorizeaza transferul de masa si promoveaza sinteza si retentia de GAG in ECM; de asemenea, distributia condrocitelor este uniforma, asa cum s-a putut observa si in imaginea de pe slide-ul anterior (dreapta jos).  IT –Tesutul cartilaginos 2. Bioreactoare pentru determinarea proprietatilor mecanice: Sarcinile ce actioneaza la nivelul articulatiilor joaca un rol critic atat in procesul de diferentiere a MSC in celule cartilaginoase, cat si in dezvoltarea si mentinerea proprietatilor structurale si functionale, pe toata perioada vietii. Strategie cheie in TE: prin incarcarea mecanica, utilizand diverse dispozitive, este stimulata diferentierea si dezvoltarea celulara in vivo (controlul magnitudinii, frecventei, forte continue/intermitente, etc). Totusi, in acest sens inca mai sunt multe de elucidat. Complicatiile se datoreaza in general faptului ca efectul stimulilor mecanici difera de la un tip de scaffold la altul.  IT –Tesutul cartilaginos 3. Bioreactoare pentru siteme controlate: Bioreactoarele enumerate anterior pot servi drept modele controlate in vitro pentru studiul interactiilor fiziopatologice dintre fortele fizice si factorii solubili, in cadrul dezvoltarii tesutului cartilaginos. Exemplu: Bioreactor ce aplica regimuri cotrolate de sarcini mecanice + citokine inflamatorii specifice, pentru inverstigarea raspunsului tesutului fata de mediul ce simuleaza conditiile unei articulatii osteoartritice. Acest tip de model este de obicei utilizat inainte de a se trece la modele mai complicate si mai costisitoare, cum ar fi testele pe animale. 4. Bioreactoare pentru productia tesutului cartilaginos: Una dintre provocarile majore in acest sens este trecerea de la productia de la scala de cercetare la productia la scala industriala, cu aplicabilitate clinica, care trebuie sa respecte cerinte precum: reproductibilitate, eficienta clinica, costuri acceptabile, etc. Bioreactoarele pot satisface aceste cerinte prin automatizarea si standardizarea tehnicilor de productie a grefelor tisulare, in sisteme inchise si controlate. IT –Tesutul cartilaginos  INGINERIE TISULARA OBTINEREA DE SCAFFOLDURI PRIN TEHNICI DE DECELULARIZARE noiembrie 2024  DECELULARIZARE. CONCEPT. Encyclopedia of Tissue Decelularizarea este îndepărtarea completă a tuturor componentelor celulare dintr-un țesut, păstrând în Engineering and Regenerative același timp matricea extracelulară, inclusiv vascularizația. Medicine, 2019 Decelularizarea este definită ca îndepărtarea chimică sau fizică a fazei celulare din țesuturi vii, creând un Organ Repair and scaffold acelular al țesutului original, care poate fi utilizat ulterior în regenerarea artificială a organelor și Regeneration, 2021 țesuturilor. Procesul de decelularizare are ca scop eliminarea tuturor materiei celulare și nucleare, minimizând orice Encyclopedia of Biomedical efecte adverse asupra compoziției, activității biologice și integrității mecanice a MEC rămasă pentru Engineering, 2019 dezvoltarea unui țesut nou. Decelularizarea este procesul de prelevare a unui organ, fie de la un donator uman, fie de la un model Nanoengineered Biomaterials for Regenerative Medicine, animal și sterilizarea acestuia până la îndepărtarea tuturor componentelor în afara rețelei de colagen; 2019 țesutul lipsit de celule rămas este clasificat ca scaffold natural. INGINERIE TISULARA  DECELULARIZARE. CONCEPT. Decelularizarea este procesul de îndepărtare a antigenelor celulare alogene sau xenogene dintr-un țesut, lăsând în urmă o MEC intactă care cuprinde un Comprehensive amestec de molecule structurale și funcționale utile Biomaterials II, 2017 în susținerea repopulării rețelei tridimensionale cu celule provenite de la pacientul cu necesar de transplant. https://www.brainkart.com/article/Transplant-Immunology-and-Types-of-Transplants_17989/ INGINERIE TISULARA  Decelularizarea NU este metoda de obținere a liniilor celulare folosite în studii in vitro. Cultura celulară primară este prima cultură obținută direct din țesut animal prin dezintegrarea mecanică și chimică sau prin metode enzimatice (enzime proteolitice) a MEC, fiind formată din celule cu creștere lentă care poartă toate caracteristicile țesutului sau celulelor originale. Culturile de celule secundare sunt obținute după ce culturile de celule primare sunt ulterior subcultivate pe o perioadă de timp în medii de cultură proaspete. Celulele culturilor de celule secundare au o durată de viață mai mare datorită disponibilității nutrienților corespunzători la intervale regulate de timp, putând supravietui unui număr important de pasaje. Liniile celulare prezintă de obicei caracteristici funcționale care sunt apropiate de celulele primare, dar genotipul și fenotipul celulelor pot fi modificate. INGINERIE TISULARA OBIECTIVELE METODEI D E C E L U L A R I Z A R E INGINERIE TISULARA Obținerea unui material complex cu caracteristicile structurale ale ECM este unul dintre principalele avantaje ale decelularizării. Wong, Eric. Cells: molecules and mechanisms. Axolotl Academic Publishing, 2009. INGINERIE TISULARA  https://journals.sagepu b.com/doi/full/10.1177 /20417314221105305 https://onlinelibrary.wil ey.com/doi/abs/10.100 2/ijch.201900052 INGINERIE TISULARA INGINERIE TISULARA TRIADA MATRICE EC INITIALA – TEHNICA – LINIE CELULARA INGINERIE TISULARA  Nu exista un protocol parametrizat pentru vreun tip de tesut/organ insa s-au observat ca anumite tehnici sunt mai adecvate pentru anumite geometrii ale esantioanelor initiale DECELULARIZARE DECELULARIZARE STRUCTURI 3D CU STRUCTURI PLANE (epitelii, VASCULARIZARIZATIE NATIVA endotelii) (plamani, ficat, rinichi…) ETAPA FINALA OBLIGATORIE PENTRU ORICE STRUCTURA DECELULARIZATA INGINERIE TISULARA  TEHNICI SI AGENTI DE DECELULARIZARE 1. METODE CHIMICE 2. METODE FIZICE 3. METODE ENZIMATICE surfactanti cicluri inghet/dezghet tripisina *anionici, cationici, zwitterionici ultrasonare lipaze tratament acid/bazic stres mecanic nucleaze (DNase, RNase) METODE HIBRIDE: combinatii de 1/2/3 PARAMETRI (foarte) VARIABILI temperatura de lucru concentratia de agent activ sau intensitatea stimulilor fizici durata de expunere INGINERIE TISULARA DECELULARIZARE ORGAN / DECELULARIZARE CULTURI CELULARE INGINERIE TISULARA MEC decelularizat pentru ingineria țesutului pulmonar, hepatic și renal INGINERIE TISULARA Decelularizarea ajută la punerea în evidență a structurării MEC (model rinichi). (A) Rinichi decelularizați în DSS. Matrice marcata colorimetric pentru diverse componente ale ECM: verde = COL5; albastru = COL4A1; roșu = WGA (proteoglicani). (B) Fibre din glomeruli, cortex și joncțiunea corticomedulară ar vizualizate în 3D. (C-F) Imagini confocale reprezentative din diferite zone ale rinichiului. Scale bar: 100µm. INGINERIE TISULARA VALIDAREA PROTOCOLULUI PRIN TEHNICI DE STAINING https://www.nature.com/articles/s41596-019-0225-8 INGINERIE TISULARA DECELULARIZARE STUDII CLINICE Gonfiotti, Alessandro, et al. "The first tissue- engineered airway transplantati on: 5-year follow-up results." Th e Lancet 383. 9913 (2014): 238- 244. INGINERIE TISULARA DECELULARIZARE. MODELE VEGETALE Gershlak, Joshua R., et al. "Crossing kingdoms: Using decellularized plants as perfusable tissue engineering scaffolds." Bi omaterials 12 5 (2017): 13- 22. INGINERIE TISULARA https://www.youtube.com/watch?v=gQwJ-nUrY-E Alte linkuri “utile”: https://youtu.be/U08O03veX2k https://youtu.be/VM02I_bjgro INGINERIE TISULARA  INGINERIA TISULARĂ – TESUT CARDIOVASCULAR Curs VIII Prof. Dr. Ing. Mariana IONIȚĂ UNSTPB, Facultatea de Inginerie Medicală  IT cardiovasculara Bolile cardiovasculare (BCV) sunt afectiuni ale inimii şi ale vaselor de sânge care includ bolile coronariene -boli ale vaselor de sânge care irigă muşchiul cardiac; boli cerebrovasculare -boli ale vaselor de sânge care irigă creierul; boli arteriale periferice- boli ale vaselor de sânge care irigă braţele şi picioarele. Bolile cardiovasculare sunt principala cauza de deces în țările dezvoltate (1 din 3 decese în Statele Unite în 2008). Modificarile in dieta si obiceiuri sunt cauzatoare de BCV si mortalitate în țările în curs de dezvoltare. Acest grup de boli constituie o povară pentru autoritățile naționale (in 2010, 503,2 miliarde). În mod particular boli cardiace coronariene determina decesul a 3,8 milioane de bărbați și 3,4 milioane de femei la nivel mondial iar in Statele Unite.  IT cardiovasculara Inima = organ complex, care pompeaza aprox. 7000 litri de sange pe zi, in toate tesuturile din organism. Tesutul cardiac cuprinde: o cardiomiocite = elemente contractile, care formeaza fibrele musculare orientate variat in cadrul peretelui ventricular; aceste fibre sunt organizate, la randul lor, in lamine miocardice cu grosimea de 4-6 miocite si separate intre ele de colagen extracelular; o celule musculare netede; o celule fibroblaste; o nervi; o vase de sange si componente ale matricii extracelulare (interstitiu cardiac si colagen). La o contractie ventriculara de numai 15%, inima ejecteaza o fractie sangvina de 60%.  IT cardiovasculara 10-20% din totalul celulelor de la nivelul tesutului cardiac sunt elemente contractile 1% sunt inlocuite anual de celule progenitoare la varsta de 25 ani 0,5% sunt inlocutie anual de celule progenitoare la varsta 75 de ani 20-40% dintre pacienti resping tesutul cardiac transplantat 70 % reduc activitatile curente Rata de succes este sub 70 % in primii cinci ani Structura Torrent-Guasp, 2006  IT a tesutului cardiac Infarct miocardic coronarian  Lipsa de oxigen si nutrienti, si stagnarea metabolitilor;  Metabolismul aerob se transfoma in glicoliza anaeroba (reduce fuctia contractila);  La 20-40 de minute de cand fluxul sanguin este oprit incepe apoptoza celulara;  Alte celule isi incetinesc metabolismul pentru a rezista conditiilor dure pana la restabilirea fluxului sangvin;  Remodelare ECM colagenul de tip I este inlocuit cu colagenul de tipul III. IT a tesutului cardiac Modificarile cauzate de infarct miocardic coronarian 1. Scaderea cantitatii de colagen duce la subțierea pereților și dilatarea ventriculară, precum și realinierea fasciculelor de miocite. 2. După faza inflamatorie si resorbția țesutului necrotic, există o creștere a depunerii de colagen în zona afectata care duce la formarea țesutului cicatricial. 3. În timpul remodelării se produce o modificare a compoziției colagenului, fracția de colagen de tip I este redusă de la 80% la 40%, iar colagenul III este crescut  IT cardiovasculara Practicile clinice tintesc in general spre limitarea severitatii si potentialelor complicatii/extinderi ale infarctului miocardic acut (datorat ocluziilor venoase prin ateroscleroza coronariana sau trombotica, in ~80% din cazuri), prin: o restabilirea imediata a perfuziei venoase cardiace si a aportului de oxigen necesar; o reducerea/evitarea traumelor. Abordare farmacologica Anticoagulante, substante trombolitice → eliminarea ceagurilor; Insa orice medicament Vasodilatatoare (nitrati) → dilatarea vaselor de sange; prezinta reactii adverse, Aspirina → evitarea agregarii plachetelor; necesita stabilirea unui Beta-blocanti → reducerea ritmului cardiac; orar, prezinta anumite Morfina → atenuarea durerilor. costuri → eficienta redusa  IT cardiovasculara Abordare chirurgicala Angioplastia comuna (cateter + balon sau Reperfuzia = proces complex, care stenturi vasculare ) poate induce apoptoza prin → restabileste diametrul lumenului si permite schimbarile de micromediu induse fluxului sangvin sa irige zona de infarct. (se elibereaza substante toxice) Toate aceste metode traditionale: o limiteaza distrugerile cauzate de episodul acut o nu regenereaza tesutul distrus o nu anuleaza modificarile ventriculare ulterioare care au loc (continutul de colagen de tip I este redus de la 80% la 40%, iar cel de tip III devine mai abundent; forma ventriculilor se modifica din eliptica in sferica → se reduce fractia de ejectie; etc).  IT cardiovasculara Noi tendinte: oCardiomioplastia (a); oStraturile celulare (b); oGelurile injectabile (b); oScaffoldurile (b); oDispozitive de “imbracare” a inimii (c). Regenerative_Medicine_and_Tissue_Engineerin g.pdf  IT cardiovasculara Terapia cu celule genralitati: o Se implanteaza celule pe sau in miocardul patologic; o Realizata in combinatie cu biomateriale (organizare 3D, protectie, stimuleaza si mentin cresterea celulara, mentin celulele in zona de interes, etc) si molecule bioactive, in scopul recuperarii tesutului lezat; o Prin implantarea biomaterialelor (injectabile, geluri, etc) in peretele ventricular, grosimea acestuia creste si, tinand cont de legea lui Laplace, stress-ul in acest tesut este redus (efect secundar benefic). o Permite vindecarea tesutului afectat.  IT cardiovasculara Cardiomioplastia (C) o a evoluat de la c. dinamica (acoperirea inimii cu muschiul latissimus dorsi, care sa sustina bataile inimii si sa evite remodelarea ventriculara); o c. celulara (injectarea celulelor de diverse origini direct la nivelul inimii);  IT cardiovasculara Cardiomioplastia celulara oCelulele injectate trebuie sa: induca angiogeneza, inhibe apoptoza, ajute la regenerare, activeze mecanismele de vindecare, formeze un nou tesut muscular contractil in zona distrusa; oMetode de implantare celulara: ointracoronariana (cel. trebuie sa migreze prin vasele de sange si sa se stabileasca in zona de interes); odirecta, la nivelul tesutului ischemic, prin injectie intra- sau endo-miocardica. o Ambele tipuri de cardiomioplastie prezinta limitari dpdv al restabilirii functiei cardiace si al celulelor utilizate. o Posibile limitari?  IT cardiovasculara Cardiomioplastia celulara - Problematica Teste in vivo versus teste clinice? Celule din surse autogene sau alogene? Tehnica de implantare versus tipul de celula folosita in procesul de regenerarea cardiaca; -la 50-70 minute dupa injectarea intracoronariana de MSC-BM doar 1.3-2.6 % din celule raman la nivelul muschiului cardiac (schimbarile de compozitie determina o adeziune scazuta a celulelor). -bataile inimii indeparteaza celulele injectate la nivel cardic sau pierderea se poate face prin orificiul ramas dupa ce dispozitivul de injecatre a fost indepartat (modularea viscozotatii solutiei de injectare) -asiguarea unei rate de supravietuire a celulelor mai ridicata (in prezent 10%).  IT cardiovasculara Cardiomioplastia celulara: o Tipurile de celule implicate: autologe sau alogene o Celule stem embrionice –(ESC) etica, imunosupresoare, riscul generarii de teratoame → aplicatiile clinice sunt limitate (etic- risc); o exista protocoale bine stabilite pentru metodele de diferentiere a ESC in cardiomiocite dar si in alte tipuri de celule necesare regenerarii. o Celule stem pluripotent induse - fibroblasti tratati cu factori virali; nu prezinta problemele etice intalnite la ESC; pot fi de natura autologa; limitari ce tin strict de factorii virali, care pot induce malignitate, si riscul de producere a teratoamelor datorate pluripotentei);  IT cardiovasculara Cardiomioplastia celulara: Tipurile de celule implicate: autologe sau alogene? Celule stem adulte -autologe pot fi inmultite si diferentiate in cardiomiocite in vitro fara sa puna probleme de etica sau imunogenitate, nu sunt disponibile imediat. 1. maduva osoasa: pot fi diferentiate in vivo in cardiomiocite (mecanism necunoscut in totalitate) sau in vitro cu suplimentarea mediului de cultura; pe modele animale, neovascularizatia si functiile inimii au fost imbunatatite; clinic, au fost inregistrate beneficii temporare, iar prin tratarea cu GF pot fi prelungite efectele si rata de supravietuire. datroita formei si dimensiuni nu pot fi distribuite intracoronarian (produc microinfarct) 2. tesut adipos: studii privind combinarea acestora cu geluri peptidice si inglobate in matrici polimerice 3D (suport pt ventriculul dilatat + prelungirea efectelor pozitive), dar mecanismul procesului nu este pe deplin cunoscut. IT cardiovasculara Cardiomioplastia celulara: 3. Celule stem cardiace - nediferentiate, regasite la nivelul inimii si care se pot diferentia in celule endoteliale, musculare netede, cardiomiocite; responsabile de refacerea normala a tesutului ; sursa limitata (in particular pentru provenienta umana); pot fi izolate din biopsii si extinse in vitro; aplicate in studii in vivo si clinice au reprezentat suportul potrivta pentru refacera miocadica. IT cardiovasculara Straturile celulare - metoda propusa ca urmare a unei pierderii masice a tesutului muscular in cazul unui infarct micardic (50 g) Straturile celulare – crescute pe suport de sticla crescute pe suporturi polimere o In cazul culturilor celulare crescute pe sticla se aplica tratament enzimatic in scopul detasarii celulelor; se pierd proteine si receptori celulari, conexiunile electromecanice, celulele sunt astfel lezate. → alternativa: straturi celulare detasate prin metode care permit conservarea conexiunilor electromecanice intercelulare; celulele sunt mentinute in propria ECM, fiind pastrate proteinele membranare celulare si influentele ECM asupra maturarii si supravietuirii acestora. IT cardiovasculara Straturile celulare - Culturi pe substraturi acoperite cu poli(N-izopropilacrilamida) Poli(N-izopropilacrilamida) este un polimer hidrofob la 37° C si de care celulele se ataseaza; la temperaturi reduse, poli(N-izopropilacrilamida) sufera o tranzitie in stare hidrofila, iar monostratul celular poate fi indepartat. o Prezinta superioritate in termeni de functii cardiace, retentie celulara, rata de proliferare si densitate vasculara.  IT cardiovasculara Straturile celulare - Culturi pe substraturi acoperite cu poli(N-izopropilacrilamida) 50 g de tesut nu poate fi inlocuit cu un strat celular Obtinem un start celular mai gros? Suprapunem mai multe starturi celulare? S-a observat o buna adeziune si semnalizare elecromecanica intre mai multe starturi celulare (2-3 minute) Lipsa vascularizarii impiedica patruderea oxigenului, nutrinetilor daca sunt suprapuse prea multe straturi (maxim 3) Implantarea de 3 straturi succesiv a produs obtinerea unui strat celular cu grosimea de 1 mm.  IT cardiovasculara Gelurile injectabile: o Trebuie sa fie proiectate astfel incat sa poata fi injectate prin proceduri minim invazive, pe baza de cateter; o La locul implantarii, trebuie sa se autoasambleze si sa vindece cat mai rapid, fara sa elibereze factori toxici; o Adopta forma cavitatii in care sunt injectate si pot creste grosimea si rigiditatea peretelui ventricular; o Ajuta la mentinerea celulelor in zona de interes, simuland un mediu 3D propice acestora si protejandu-le de conditii ostile (consecinte ale infarctului)-precum hipoxia, specii reactive de oxigen sau anumite citokine; o Pot reprezenta sisteme de eliberare controlata (medicamente, GF, etc);  IT cardiovasculara Caracteristicile Gelurilor injectabile ideale o biodegradabil, non-imunogen, non-citotoxic, antitrombogenic; o sa prezinte proprietati mecanice adecvate, complianta a.i. sa permita contractarea normala; o sa transmita stimulii mecanici catre celule; o sa induca angiogeneza (cel putin sa nu perturbe activitatea angiogenica normala); o sa fie capabil sa livreze celule si molecule bioactive.  IT cardiovasculara Gelurile injectabile: o Biomateriale gelifiante in situ naturale: o fibrina, Matrigel, acidul hialuronic, colagenul, gelatina; o chitosanul – polizaharida cationica naturala, solubila in solutii acide, dar dupa neutralizare formeaza un gel; polimer capabil sa purifice / absoarba speciile reactive de oxigen produse in conditiile ischemice si sa recruteze citokine cu rol primordial in chemotactismul celulelor stem; polimer capabil sa imbunatateasca micromediul pentru celulele stem prelevat din tesutul adipos. o keratina din par – mai mult de 30 tipuri de GF sunt implicate in morfogeneza parului; o parte din acestia raman in keratina si pot fi folositi in repararea cardiaca. Pudra de keratina liofilizata se poate auto-asambla la aditia apei, formand geluri. Implantat in inimi ischemice de sobolan, gelul de keratina permite infiltrarea celulelor miocardice si endoteliale si promoveaza angiogeneza, fara a provoca inflamatii; o alginatul – copolimer bloc, polizaharida incarcata negativ, obtinuta din alge marine si care gelifiaza in prezenta ionilor de Ca.  IT cardiovasculara Gelurile injectabile: o Biomateriale gelifiante in situ (sintetice): o Hidrogeluri termosensibile (prezinta tranzitii sol-gel dependente de temperatura), de ex. cele pe baza de N-izopropilacrilamida (polimer non- biodegradabil, dar care prin copolimerizare cu polimeri degradabili devine biodegradabil) + acid acrilic, etc; (Degradare in vitro caracterizata de o pierdere de masa de 85% in 5 luni, implantat in vivo (model animal – sobolan) a conservat contractilitatea si zona ventriculara, iar dupa aprox. 8 saptamani, in zona adiacenta s-a format un strat de celule musculare cu fenotip contractil.)  IT a tesutului cardiac oCardiomioplastia (a); oStraturile celulare (b); oGelurile injectabile (b); oScaffoldurile (b); oDispozitive de “imbracare” a inimii (c).  IT a tesutului cardiac Fibroina Celule Scaffold Factori de mezenchimale Hidrogel fibroina crestere Patch-urile ajuta la dezvoltarea vaselor de sange noi si elibereaza proteine care stimuleaza repararea tesutului cardiac  IT a tesutului cardiac Scaffoldurile: o Folosirea biomaterialelor pentru obtinerea unor “plasturi” ex vivo si implantarea acestora in zona epicardica, pe tesutul afectat de infarct (pot fi pre- incarcati cu celule, GF, medicamente); o Biomateriale implicate: o naturale: colagen, gelatina, fibrina, alginat, matase, tesuturi decelularizate; o sintetice: PLA, PU. Poroase 3D, anizotropie structurala, proprietatilor mecanice similare tesutului cardiac, transfer de masa constant, ghidarea coloniilor de cardiomiocite.  IT a tesutului cardiac Dezvoltarea / Soarta celulei este controlata de 3 factori Stimuli fizici (presiunea fizica exercitata de celula din vecinatate); Stimuli chimici (semnalizarea chimica de la celule vecine sau indepartate); Stimuli electrici. IT a tesutului cardiac Scaffoldurile: o Stimularea electrica o aplicarea unor campuri electrice externe asupra culturilor celulare (stem: embrionare, adulte) contribuie la diferentierea celulelor in cardiomiocite si la dezvoltarea unor proprietati de conductivitate si contractilitate; o foarte important: materialul electrozilor (carbonul → cele mai bune rezultate), amplitudinea si frecventa; o scaffoldurile polimerice limiteaza comunicarea electrica a cardiomiocitelor, ceea ce conduce la restrictia contractiilor sincrone ale tesutului → solutie: incorporarea unor nanofire electroconductive in scaffold. IT a tesutului cardiac Scaffoldurile: o Stimularea mecanica: o Stressul mecanic influenteaza semnificativ proliferarea celulara, sintetizarea si organizarea ECM; o Functiile contractile sunt imbunatatite, histologic se observa caracteristicile unui tesut cardiac adult; o Celulele se aliniaza, se alungesc si formeaza jonctiuni de interconectare; o Se obtin structuri organizate similar miocardului, in mare parte datorita faptului ca, prin solicitarile mecanice de intindere ale scaffoldului, favorizeaza transferul de nutrienti si oxigen, creandu-se astfel un micromediu adecvat. IT a tesutului cardiac  IT a tesutului cardiac Dispozitive de “imbracare” a inimii: o Scopul acestei metode nu este acela de a regenera tesutul ischemic, este de a evita extinderea efectelor adverse de remodelare, aparute in urma infarctului miocardic; o Este aplicat un material de invelire, ce ofera o rezistenta mecanica si care trebuie sa limiteze sau sa induca regresia dilatarii ventriculare.  IT a tesutului cardiac Dispozitive de “imbracare” a inimii: o a fost propusa o varietate de retele sintetice: o Bistrat membranar: polipropilena (PP) pe o parte, care faciliteaza cresterea si dezvoltarea tisulara (cel putin limiteaza dilatarea ventriculara) si politetraflouretilena (PTFE) pe cealalta parte, care previne adeziunea elementelor din vecinatate. o Rezultate benefice dpdv al proceselor de remodelare, materialele nu sunt biodegradabile, pt a avea un efect permanent). o Disponibile comercial: - Marlex; - Merseline; - Paracor.