PCR Técnicas - Unidad 7. Técnicas de PCR PDF

BIOLOGÍA MOLECULAR Y CITOGENÉTICA UNIDAD 7 TÉCNICAS DE PCR Curso 2024/2025  ÍNDICE 1.Reacción en cadena de la polimerasa (PCR). 5.Otras técnicas de PCR....

BIOLOGÍA MOLECULAR Y CITOGENÉTICA UNIDAD 7 TÉCNICAS DE PCR Curso 2024/2025  ÍNDICE 1.Reacción en cadena de la polimerasa (PCR). 5.Otras técnicas de PCR. 5.1- PCR anidada. 2.Bases teóricas de la PCR. 5.2- PCR múltiple. 2.1- Los cebadores o primers. 5.3- RT-PCR. 2.2- ADN polimerasas termoestables. 2.3- El ciclo básico de una PCR. 6.PCR a tiempo real. 2.4- Productos de amplificación de la PCR. 6.1- Aplicaciones de la PCR a tiempo real. 3.PCR convencional. 3.1- La mezcla de reacción. 3.2- Preparación de las muestras. 3.3- Programación del termociclador. 3.4- Análisis de los productos amplificados. 4.Modalidades de PCR estándar. 4.1- PCR con inicio en caliente. 4.2- PCR de grandes fragmentos. 4.3- PCR de alta fidelidad. BIOLOGÍA MOLECULAR Y CITOGENÉTICA. Extracción y purificación de ácidos nucleicos  1. REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR) La reacción en cadena de la polimerasa o PCR, es una técnica in vitro de amplificación de ADN que permite obtener millones de copias iguales de una fragmento concreto de ADN, partiendo de una cantidad mínima de ADN molde. Aunque en un principio la PCR se diseñó para amplificar un único fragmento corto de ADN presente en una molécula mucho mayor, el desarrollo posterior de la técnica ha permitido amplificar fragmentos de gran tamaño (hasta 35 kb) y se han desarrollado diferentes variantes que permiten: o Amplificar varios fragmentos distintos en una única reacción (PCR múltiple) o Amplificar fragmentos de ARN (RT-PCR) o Cuantificar la concentración de una molécula concreta de ácido nucleico presente en una muestra (PCR cuantitativa, PCR a tiempo real).  1. REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR) Las ventajas de las técnicas de PCR y sus variantes sobre otras técnicas utilizadas en biología molecular son claras: o Como técnica de amplificación: es una técnica rápida y completamente automatizada, en comparación con las técnicas de clonación en vectores mediante tecnología de ADN recombinante. o Como técnica de detección: requiere mucha menos cantidad de muestras que las técnicas de hibridación y permite la cuantificación de secuencias concretas (PCR en tiempo real). Actualmente, esta posibilidad de conseguir altos niveles de amplificación en tiempos cortos y su mayor sensibilidad de detección han convertido a la PCR en la técnica básica de cualquier laboratorio de biología molecular.  1. REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR) Sus aplicaciones son innumerables en todos los campos de la biología, la medicina e incluso en paleontología. Algunos ejemplos son: o El diagnóstico y pronóstico de ciertas enfermedades. o La evolución y respuesta a tratamientos. o Los estudios de expresión génica. o Mutagénesis. o Estudios filogenéticos. o Genotipado. o Medicina forense…etc.  2. BASES TEÓRICAS DE LA PCR La PCR es un proceso enzimático, catalizado por una ADN polimerasa, basado en la replicación del ADN. La técnica fue ideada en 1983 por Kary Mullis, bioquímico norteamericano, cuya idea original consistió en repetir secuencialmente ciclos de replicación de ADN in vitro, de manera que a partir de una única molécula de ADN molde se obtuvieran múltiples copias. Este diseño repetitivo es la clave de la amplificación puesto que las copias nuevas obtenidas en cada ciclo sirven también de molde para sintetizar otras nuevas copias en los ciclos siguientes, produciéndose un aumento exponencial en el número de copias de cada ciclo de replicación sucesivo que se realice. La principal ventaja de la PCR, es su sensibilidad, pero también es la contaminación, que puede producirse por material no amplificado, como aerosoles, microorganismos ambientales, células de descamación, o material amplificado de PCR anteriores.  2. BASES TEÓRICAS DE LA PCR Ahora bien, para conseguir esto hay que solucionar dos problemas: 1. ¿Cómo conseguir que en cada ciclo de la técnica únicamente se copie el fragmento que nos interesa, entre una mezcla compleja de moléculas de ADN? ▪ Solución: Diseñar cebadores específicos que permiten la amplificación exclusiva de un fragmento concreto de ADN. 2. ¿Cómo conseguir que no se produzca la inactivación de la ADN polimerasa por la temperatura elevada que es necesaria en la fase de desnaturalización del ADN molde? ▪ Solución: Usar ADN polimerasas termoestables.  2. BASES TEÓRICAS DE LA PCR 2.1 CEBADORES O PRIMERS Los cebadores o primers son oligonucleótidos monocatenarios cuya secuencia es complementaria de las regiones que flanquean el fragmento que se quiere amplificar. se diseñan siempre por parejas y cada uno es complementario de una secuencia adyacente a la región de interés pero en extremos y cadenas opuestas: o El cebador que se va a unir a la hebra molde que tiene dirección 3´🡪 5´ se denomina cebador F o forward. o El que se va a unir a la hebra molde que tiene dirección 5´🡪3´se denomina cebador R o reverse.  2. BASES TEÓRICAS DE LA PCR 2.1 CEBADORES O PRIMERS El sustrato idóneo para la actividad enzimática de la ADN polimerasa es una molécula monocatenaria de ADN (molde) con una pequeña región en doble hélice, a la que se une y empieza a incorporar nucleótidos con bases complementarias a las de la hebra molde. En el caso de la PCR, esa pequeña región en doble hélice la proporcionan los cebadores, una vez que se unen a sus secuencias complementarias en las hebras moldes previamente desnaturalizadas. Un juego de cebadores, por lo tanto, define y delimita la región diana de una molécula de ADN que se amplificará y que será la comprendida entre ambos. Es decir, fijan la especificidad de la reacción, haciendo posible la amplificación exclusiva de un fragmento concreto de ADN de entre una mezcla compleja de moléculas. Por supuesto que para conseguir este objetivo, su secuencia debe ser única en el ADN que se estudia.  2. BASES TEÓRICAS DE LA PCR 2.1 CEBADORES O PRIMERS Para el diseño de los cebadores es necesario conocer la secuencia de bases de las dos regiones que flanquean el fragmento que se va a amplificar. En situaciones ideales deben cumplir una serie de requisitos en cuanto a: Longitud: está comprendida entre 18 y 30 bases. Se considera que el tamaño mínimo de un cebador para que sea específico es de 16 bases. La probabilidad de que una secuencia de menos de 16 bases se encuentre repetida en un genoma complejo en regiones distintas a la de interés es suficientemente elevada para desaconsejar su uso como cebador. En consecuencia: - Los cebadores con menos de 15 bases, aunque se unen muy eficientemente al ADN molde, carecen de especificidad y son responsables de la aparición de productos amplificados no específicos. - Los cebadores con una longitud superior a 30 bases dan más especificidad a la técnica, pero tienden a unirse peor al ADN molde y disminuyen el rendimiento de la reacción. Aún así, para algunas aplicaciones concretas se pueden usar cebadores de hasta 40-50 bases. Composición de bases: Los mejores resultados se obtienen con cebadores que tienen un contenido en G+C comprendido entre el 40% y el 60%. La distribución de dominios ricos en A/T y G/C debe ser equilibrada.  2. BASES TEÓRICAS DE LA PCR 2.1 CEBADORES O PRIMERS Secuencia: los cebadores no deben contener secuencias complementarias intra- e intermoleculares. - La presencia de secuencias complementarias intramoleculares puede dar lugar, por un lado, a la formación de estructuras secundarias en el cebador, del tipo de horquillas, que impidan su unión al ADN molde y, por otro lado, a la autodimerización del cebador, disminuyendo su concentración efectiva en la mezcla de reacción. - La presencia de secuencias complementarias intermoleculares entre ambos cebadores puede ocasionar la dimerización de estos, disminuyendo también su concentración efectiva. La ausencia de complementariedad entre los cebadores es especialmente importante en el extremo 3’ de ambos, para evitar la formación de dímeros que bloqueen la unión de estos extremos al ADN molde. Temperatura de fusión: La Tm de los cebadores debería estar en el rango de 52-65ºC, aunque no siempre es posible. En todo caso, la diferencia entre las Tm de los dos cebadores de una pareja debe ser inferior a 5ºC para que su eficiencia de unión al ADN molde a la misma temperatura sea similar.  2. BASES TEÓRICAS DE LA PCR 2.2 ADN POLIMERASAS TERMOESTABLES Para que la ADN polimerasa pueda sintetizar cadenas muevas de ADN es necesario que el ADN molde sea monocatenario. Esto hace que cada ciclo de PCR tenga que comenzar por una fase de desnaturalización por calor, lo que supone un problema para las ADN polimerasas convencionales puesto que son termolábiles, es decir, se inactivan a temperaturas elevadas. En los primeros experimentos para diseñar la técnica de la PCR, esta dificultad se superaba añadiendo enzima nueva en cada ciclo, lo que la convertía en una técnica costosa, larga, con alto riesgo de contaminación y difícilmente automatizable. El hecho que posibilito el desarrollo espectacular de la PCR en poco tiempo fue el descubrimiento de las ADN polimerasas termoestables.  2. BASES TEÓRICAS DE LA PCR 2.2 ADN POLIMERASAS TERMOESTABLES Las ADN polimerasas termoestables son enzimas aisladas de un grupo especial de arqueobacterias extremófilas (termófilas), con actividad polimerasa a temperaturas elevadas. Al igual que las ADN polimerasas bacterianas convencionales, estas enzimas catalizan la incorporación de nucleótidos en dirección 5´→3´a partir de una pequeña región con doble hélice utilizando como molde un ADN monocatenario y en presencia de iones magnesio (Mg2+), pero tienen dos características diferenciales que las hacen idónea para su uso en PCR: o Realizan su actividad polimerasa a una temperatura óptima comprendida entre 70 ºC y 75ºC. Esto permite hibridar los cebadores al ADN molde a temperaturas relativamente elevadas, fijando unas condiciones de alta rigurosidad, lo cual maximiza la especificidad de la reacción. o Tienen capacidad de mantener su actividad polimerasa tras tiempos prolongados de incubación a 95 ºC (por encima de los 40 minutos), lo que garantiza que la enzima no se va a inactivar durante las fases de desnaturalización del ADN.  2. BASES TEÓRICAS DE LA PCR 2.2 ADN POLIMERASAS TERMOESTABLES Tipos de ADN polimerasas termoestables. o Las ADN polimerasas termoestables se pueden clasificar en función de sus capacidades enzimáticas secundarias. o Estas pueden ser: ▪ Actividad exonucleasa 5´→3´, pero sin actividad exonucleasa 3´→5´. Esto hace que no sean capaces de corregir errores. ▪ Actividad exonucleasa 5´→3´y actividad exonucleasa 3´→5´. Son enzimas con actividad correctora, ya que detectan cuando se incorpora un nucleótido erróneo, lo eliminan y continúan la elongación de la cadena incorporando el nucleótido correcto. ▪ Actividad transcriptasa inversa. Algunas ADN polimerasas termoestables tienen la capacidad para utilizar ARN como molde, es decir, presentan actividad transcriptasa inversa en presencia de iones manganeso (Mn2+), por lo que pueden utilizarse para sintetizar y amplificar ADNc a partir de ARN.  2. BASES TEÓRICAS DE LA PCR 2.3 EL CICLO BÁSICO DE UNA PCR Como ya se ha mencionado, la PCR se basa en la repetición secuencial de ciclos de replicación. Cada ciclo consta de 3 fases: o Desnaturalización del ADN molde. o Hibridación de los cebadores con el ADN molde. o Extensión de los cebadores.  2. BASES TEÓRICAS DE LA PCR 2.3 EL CICLO BÁSICO DE UNA PCR FASE I. DESNATURALIZACIÓN La desnaturalización debe ser lo suficientemente larga y a una temperatura suficientemente elevada para garantizar la desnaturalización completa del ADN molde, sin prolongarse excesivamente para evitar la inactivación de la ADN polimerasa. Normalmente, la fase de desnaturalización se realiza a 94-95 ºC durante 15-30 segundos.  2. BASES TEÓRICAS DE LA PCR 2.3 EL CICLO BÁSICO DE UNA PCR FASE II. HIBRIDACIÓN La hibridación de los cebadores con el ADN molde (annealing) se realiza habitualmente a una temperatura de entre 50 y 65 ºC. El valor concreto depende de la Tm de los cebadores y suele estar comprendido en el rango Tm + 5ºC. Temperaturas de hibridación más elevadas que la Tm de los cebadores implican mayor rigurosidad y, en consecuencia, mayor especificidad. El inconveniente es un rendimiento menor. Temperaturas de hibridación más bajas que la Tm de los cebadores se pueden traducir en un mayor rendimiento de la hibridación, ya que los cebadores hibridan más eficientemente. El inconveniente es la posible aparición de productos no deseados por hibridación inespecífica de los cebadores. La temperatura óptima de hibridación de los cebadores debe fijarse de forma experimental para cada pareja de cebadores. El tiempo estándar de la fase de hibridación oscila entre los 30 y 60 segundos.  2. BASES TEÓRICAS DE LA PCR 2.3 EL CICLO BÁSICO DE UNA PCR FASE III. EXTENSIÓN La extensión o elongación de los cebadores por la ADN polimerasa copiando la hebra molde se realiza a temperatura óptima de polimerización de la enzima empleada. El tiempo de la fase de extensión está condicionado por la velocidad de polimerización de la enzima y la longitud del fragmento que se va a amplificar. Para enzimas con actividad correctora hay que considerar tiempos de extensión más prolongados, aproximadamente de dos minutos para fragmentos de 1 kb. 2. BASES TEÓRICAS DE LA PCR 2.3 EL CICLO BÁSICO DE UNA PCR  2. BASES TEÓRICAS DE LA PCR 2.4 PRODUCTOS DE AMPLIFICACÓN DE LA PCR Tras un número n de repeticiones de ciclo básico de PCR se obtienen varios tipos de productos de amplificación, unos deseados y otros no deseados, pero en proporciones muy diferentes. Para entender cómo se obtienen estos productos, vamos a estudiar que ocurre en los primeros ciclos de PCR a partir de una única molécula de ADN molde nativa. PRIMER CICLO DE PCR ▪ Fase de desnaturalización inicial: se separan las dos cadenas de la molécula de ADN nativa. ▪ Fase de hibridación: cada cebador se une a la secuencia diana. ▪ Fase de extensión: se sintetizan dos nuevas cadenas de ADN, que incluyen el fragmento que queremos amplificar pero que tienen una longitud muy superior, puesto que la ADN polimerasa continua replicando la hebra molde hasta que se inicia la fase de desnaturalización del 2º ciclo. ▪ Resultado final del 1º ciclo: 2 productos no deseados y 0 productos deseados.  2. BASES TEÓRICAS DE LA PCR 2.4 PRODUCTOS DE AMPLIFICACÓN DE LA PCR SEGUNDO CICLO DE PCR ▪ Se repite el proceso anterior. ▪ Resultado final del 2º ciclo: 4 productos no deseados y 0 productos deseados. TERCER CICLO DE PCR ▪ Se repite el proceso anterior. ▪ Resultado final del 3º ciclo: 6 productos no deseados y 2 amplicones. Los amplicones son productos deseados pues coinciden con el fragmento que queremos amplificar. CUARTO CICLO DE PCR ▪ Se repite el proceso anterior. ▪ Resultado final del 4º ciclo: 8 productos no deseados y 8 amplicones.  2. BASES TEÓRICAS DE LA PCR 2.4 PRODUCTOS DE AMPLIFICACÓN DE LA PCR ▪ Resultado final del 5º ciclo: 10 productos no deseados y 22 amplicones. ▪ Resultado final del 6º ciclo: 12 productos no deseados y 52 amplicones. ▪ Resultado final del 7º ciclo: 14 productos no deseados y 114 amplicones. Y así sucesivamente, de manera que, en cada ciclo, el número de productos no deseados aumenta aritméticamente (2n), mientras que el número de amplicones aumenta exponencialmente (2n-2n). Aunque el rendimiento de la técnica nunca es del 100%, es evidente que la PCR permite obtener millones de copias de cada molécula molde presente en la muestra original.  3. PCR ESTÁNDAR O CONVENCIONAL La PCR estándar, convencional o básica es la forma más simple de PCR, en la que se amplifica un único fragmento de ADN, con un único par de cebadores y en un único proceso de amplificación a tiempo final. Para entender bien su funcionamiento hay que estudiar en profundidad 4 aspectos: ─ La composición de la mezcla de reacción. ─ La preparación de la mezcla. ─ La programación del termociclador. ─ El análisis de los productos de la reacción.  3. PCR ESTÁNDAR O CONVENCIONAL 3.1 LA MEZCLA DE REACCIÓN La mezcla de reacción contiene todos los reactivos necesarios que deben estar presentes en el medio de reacción para que la PCR se desencadene de forma adecuada. Consiste en un tampón adecuado que contendrá disueltos todos los reactivos necesarios para la replicación del ADN. El tampón aporta pH y la concentración salina adecuados para la óptima actividad de la ADN polimerasa con un máximo de fidelidad. Los reactivos que se disuelven en el tampón son principalmente: ─ Cloruro magnésico. ─ Desoxinucleótidos trifosfato. ─ Cebadores, ADN polimerasa. ─ ADN molde. ─ En ocasiones, en función del resultado obtenido, pueden ser necesarios otros aditivos o potenciadores para optimizar la PCR.  3. PCR ESTÁNDAR O CONVENCIONAL 3.1 LA MEZCLA DE REACCIÓN CLORURO MAGNÉSICO (MGCL2) ▪ Las ADN polimerasas termoestables requieren iones de magnesio (Mg2+) como cofactor para desarrollar su actividad. ▪ Estos iones se aportan a la mezcla de reacción en forma de cloruro magnésico (MgCl2). ▪ La ausencia o una concentración excesivamente baja de Mg2+ libre en la mezcla de reacción determina la inactividad de la ADN polimerasa. ▪ Una concentración excesivamente alta determina una menor fidelidad en la replicación. DESOXINUCLEÓTIDOS TRIFOSFATO ▪ La mezcla de reacción debe contener los 4 desoxinucleótidos que componen las moléculas de ADN en forma de desoxinucleótidos trifosfato (dNTPs) para que la ADN polimerasa pueda usarlos como sustrato para incorporarlos a las cadenas en crecimiento. ▪ Los 4 dNTPs deben estar presentes en la misma concentración, pues en caso contrario disminuye la fidelidad de la enzima.  3. PCR ESTÁNDAR O CONVENCIONAL 3.1 LA MEZCLA DE REACCIÓN CEBADORES ▪ Los cebadores son claves para realizar una amplificación específica con éxito. ▪ La concentración final de cada cebador en la mezcla de reacción debe ser la misma y debe establecerse de forma experimental para cada pareja. ADN POLIMERASA ▪ La ADN polimerasa es otro reactivo clave para realizar una PCR con éxito. ▪ La elección de una u otra ADN polimerasa dependerá de la fidelidad requerida en la amplificación, de la longitud del fragmento que se va a amplificar y, en ocasiones, de la secuencia que se va a amplificar.  3. PCR ESTÁNDAR O CONVENCIONAL 3.1 LA MEZCLA DE REACCIÓN ADN MOLDE ❑ El ADN molde es un componente imprescindible de la mezcla de reacción, ya que contiene el fragmento de interés que se quiere amplificar. Normalmente se utiliza ADN purificado teniendo en cuenta tanto su calidad como la cantidad. ❑ Calidad del ADN molde. En condiciones ideales, el ADN molde para PCR debe cumplir los siguientes criterios de calidad: ▪ Alto grado de integridad, es decir, ADN de alto peso molecular, no degradado ni fragmentado y sin mellas. ▪ Cociente A260/A280 entre 1,7 y 2,0 lo que garantiza que no está contaminado con proteínas. ▪ Libre de contaminantes * que puedan inhibir la reacción de PCR, bien por inactivación de la ADN polimerasa, bien por secuestro del Mg2+ libre. ❑ Cantidad de ADN molde. La cantidad idónea para obtener los mejores resultados en una PCR dependerá de la complejidad del ADN que se estudia. Cantidades pequeñas se traducirán en bajo rendimiento y cantidades elevadas pueden potenciar la aparición de productos no deseados.  3. PCR ESTÁNDAR O CONVENCIONAL 3.1 LA MEZCLA DE REACCIÓN CONTAMINANTES OTROS ADITIVOS Y POTENCIADORES ✓ Son usados cuando el rendimiento de la PCR es bajo o aparecen amplificados productos no deseados. ✓ Normalmente, estos problemas son debidos a la presencia de contaminantes o a la naturaleza del ADN molde o de los cebadores y, más concretamente, a su secuencia. 3. PCR ESTÁNDAR O CONVENCIONAL 3.1 LA MEZCLA DE REACCIÓN  3. PCR ESTÁNDAR O CONVENCIONAL 3.2 PREPARACIÓN DE LAS MUESTRAS La preparación de las muestras requiere ajustar el volumen de reacción, elaborar la mezcla master (master mix) y establecer los controles positivos y negativos. I. Ajuste del volumen de reacción. ✓ Al diseñar una PCR, hay que decidir el volumen final de mezcla de reacción en el que se llevara a cabo la reacción. ✓ Normalmente este volumen es de 25 o 50 µl. ✓ Una vez fijado este parámetro (como todos los componentes de la mezcla de reacción, incluido el tampón, se suministran concentrados), hay que calcular los volúmenes de cada reactivo que se añadirá a la mezcla, dependiendo de la concentración final que queramos obtener. ✓ La diferencia entre la suma de los volúmenes de cada componente y el volumen final de la mezcla de reacción se completa con agua estéril grado PCR.  3. PCR ESTÁNDAR O CONVENCIONAL 3.2 PREPARACIÓN DE LAS MUESTRAS II. Mezcla master (master mix). ✓ Como las reacciones de la PCR se realizan en volúmenes muy pequeños y los componentes se suministran concentrados, las cantidades que se van a pipetear de cada uno de ellos son muy pequeñas (entre 0,5 y 5 µl), por lo que la posibilidad de introducir errores de pipeteo es elevada. ✓ Además, como normalmente se realizan múltiples reacciones simultáneamente, los posibles errores cometidos en cada tubo son distintos, por lo que las distintas PCR se realizaran en condiciones diferentes. ✓ Para evitar este problema y conseguir que la composición de la mezcla de reacción sea homogénea para todas las pruebas que se realicen simultáneamente, es preferible preparar una única mezcla de reacción, denominada mezcla master o master mix, que incluya todos los componentes, excepto el ADN molde. ✓ La cantidad de cada componente se calcula multiplicando la cantidad necesaria para una reacción por el número de muestras que se van a procesar simultáneamente +1 “INVITADO” (mejor que sobre y no que falte mezcla para el ultimo tubo) teniendo en cuenta que en el número de muestras hay que incluir los controles positivo y negativo de la técnica.  3. PCR ESTÁNDAR O CONVENCIONAL 3.2 PREPARACIÓN DE LAS MUESTRAS III. Control positivo y control negativo. ✓ Además de las muestras problema en las que tendrá lugar la reacción PCR, en cada tanda se prepara un control positivo y un control negativo de la técnica: ▪ Control positivo: es un tubo con la master mix al que se añade ADN molde control que contiene el fragmento que se quiere amplificar. ▪ Control negativo o blanco: es un tubo con master mix en el que se sustituye el ADN molde por un volumen igual de agua de grado PCR, de manera que no habrá ADN presente en la reacción. ✓ Una vez que las muestras y los controles ya están preparados, se llevan al termociclador para iniciar la PCR.  3. PCR ESTÁNDAR O CONVENCIONAL 3.3 PROGRAMACIÓN DEL TERMOCICLADOOR El termociclador es el aparato en el que se lleva a cabo la reacción de la PCR. Permite programar los ciclos repetitivos con varias temperaturas y tiempos de incubación para que se desarrollen de forma automatizada. La programación del termociclador para amplificar un fragmento de ADN mediante una PCR estándar incluye 3 etapas principales, que terminan con una incubación final para el mantenimiento de los productos de la reacción hasta su retirada de la máquina:  3. PCR ESTÁNDAR O CONVENCIONAL 3.3 PROGRAMACIÓN DEL TERMOCICLADOOR I. Desnaturalización inicial. ✓ Es la etapa que inicia la reacción de la PCR. Consiste en calentar la mezcla de reacción a 94-95ºC durante varios minutos para asegurar la completa desnaturalización de todas las moléculas bicatenarias de ADN presentes en la mezcla de reacción. II. Ciclos de replicación. Para esta etapa se programan: ✓ Las temperaturas y los tiempos de incubación de cada una de las fases del ciclo básico de PCR: desnaturalización, hibridación de cebadores y extensión. ✓ El número de veces que se va a repetir el ciclo, es decir, el número de ciclos de replicación. ✓ Este número va a depender del número inicial de copias del fragmento que se quiere amplificar en la muestra en estudio. ✓ Cuanto quemás abundante sea el fragmento se va a amplificar, menor número de ciclos de replicación serán necesarios para acumular una cantidad suficiente de amplicones. ✓ Típicamente, el número de ciclos oscila entre 25 y 40. Por encima de 40 ciclos aumenta considerablemente la probabilidad de que aparezcan productos no deseados inespecíficos y la ADN polimerasa pierde su actividad por el tiempo acumulado a temperaturas de desnaturalización.  3. PCR ESTÁNDAR O CONVENCIONAL 3.3 PROGRAMACIÓN DEL TERMOCICLADOOR III. Extensión final. ✓ Es la etapa que finaliza la reacción de PCR. Consiste en una incubación única a temperatura optima de polimerización de la ADN polimerasa durante 5-10 minutos, para asegurarnos que todos los productos de PCR están completos en forma de doble hélice. ✓ Mantenimiento. La programación del termociclador finaliza siempre con una última incubación a 4ºC sin límite de tiempo para mantener las muestras hasta que se retiren del termociclador, anulando la actividad de la enzima.  3. PCR ESTÁNDAR O CONVENCIONAL 3.3 PROGRAMACIÓN DEL TERMOCICLADOOR Ejemplo de programación del termociclador para la amplificación del polmorfismo Alu en humanos.  3. PCR ESTÁNDAR O CONVENCIONAL 3.3 PROGRAMACIÓN DEL TERMOCICLADOOR Ejemplo de programación del termociclador para la amplificación del polmorfismo Alu en humanos.  3. PCR ESTÁNDAR O CONVENCIONAL 3.4 ANÁLISIS DE LOS PRODUCTOS AMPLIFICADOS Una vez finalizada la reacción de la PCR se recuperan las distintas muestras amplificadas del termociclador y se analiza el resultado (detección de los productos amplificados) mediante una electroforesis en gel de agarosa junto un marcador de tamaños. La presencia de una única banda del tamaño adecuado indica que la PCR ha funcionado correctamente. La observación de varias bandas de distintos tamaños indica la presencia de productos de amplificación no deseados. Esto es debido a que durante la PCR se han amplificado inespecíficamente fragmentos de ADN distintos de la diana específica, por lo que habrá que repetir la reacción variando la programación del termociclador o la composición de la mezcla de reacción hasta conseguir un resultado especifico.  3. PCR ESTÁNDAR O CONVENCIONAL 3.4 ANÁLISIS DE LOS PRODUCTOS AMPLIFICADOS I. Resultado positivo. ✓ Cuando la PCR se realiza con fines exclusivos de detección, la observación de una banda especifica es suficiente para afirmar que la secuencia diana está presente en la muestra que se estudia u garantizar por tanto un resultado positivo. ✓ ¿Cómo descartar que no se trate de un falso positivo? ▪ Realizando un control negativo o blanco. Si en el control negativo o blanco se detecta alguna banda, ello indicaría contaminación de algún reactivo o pipeta que se hayan usado en la técnica, lo que invalida los resultados de la tanda.  3. PCR ESTÁNDAR O CONVENCIONAL 3.4 ANÁLISIS DE LOS PRODUCTOS AMPLIFICADOS II. Resultado negativo. ✓ La ausencia de banda especifica en una muestra problema indica, a priori, que la muestra no contiene la secuencia diana y, por tanto, el resultado es negativo. ✓ ¿Cómo descartar que un resultado negativo es debido a reactivos defectuosos o a que existan inhibidores de la PCR? ▪ Realizando un control positivo de la técnica. Si todos los reactivos funcionan bien, en el control positivo se observara la banda específica. En caso contrario hay algún problema en la master mix y se invalida la tanda. ▪ Para descartar la presencia de inhibidores en una muestra hay que realizar un control positivo de la muestra, consistente en una nueva PCR en la que se amplifica un gen control presente en la muestra. ❖ Si este control amplifica bien, se confirma que la muestra es apta para la PCR. ❖ Si el control positivo de la muestra no amplifica, la muestra no es apta para la PCR. 3. PCR ESTÁNDAR O CONVENCIONAL 3.4 ANÁLISIS DE LOS PRODUCTOS AMPLIFICADOS  3. PCR ESTÁNDAR O CONVENCIONAL 3.4 ANÁLISIS DE LOS PRODUCTOS AMPLIFICADOS Se analizan 6 muestras mediante una PCR para detectar la presencia de coronavirus. La PCR se realiza con cebadores específicos para amplificar un fragmento de 350 pb del genoma viral. Además simultáneamente, mediante una PCR múltiple, se amplifica un fragmento control conocido de 500 pb. Para observar los resultados se realiza una electroforesis en gel de agarosa. Indica qué es lo que podemos observar en cada uno de los pocillos y razona las respuestas, incluyendo el pocillo 1.  4. MODALIDADES DE LA PCR ESTÁNDAR La PCR estándar se utiliza mayoritariamente con fines diagnósticos, amplificando secuencias menores de 3,5 kb, para lo que las condiciones descritas hasta ahora para PCR estándar suelen dan buenos resultados. Sin embargo, el intento de minimizar la generación de productos no deseados o la necesidad de amplificar fragmentos de gran tamaño o con gran fidelidad para otras aplicaciones ha derivado en el desarrollo de variantes o modalidades de la PCR estándar adaptadas a cada necesidad, como: ✓ La PCR de inicio caliente. ✓ La PCR de grandes fragmentos. ✓ La PCR de alta fidelidad.  4. MODALIDADES DE LA PCR ESTÁNDAR 4.1 PCR CON INICIO EN CALIENTE (HOT START PCR) En el periodo de preparación de la mezcla de reacción, su transporte al termociclador y durante la rampa ascendente de la temperatura hasta alcanzar por primera vez la temperatura de desnaturalización, se pueden generar productos de amplificación no deseados. Para evitar la aparición de productos de amplificación no deseados, relacionada principalmente con la naturaleza de los cebadores, se ideo la PCR con inicio caliente o Hot Start PCR. La mayor parte de las polimerasas actuales son hot start.  4. MODALIDADES DE LA PCR ESTÁNDAR 4.1 PCR CON INICIO EN CALIENTE (HOT START PCR) Por lo tanto, la PCR con inicio en caliente se basa en evitar la actividad de la enzima a bajas temperaturas, lo que se puede lograr con varias estrategias: ✓ Preparando la mezcla de reacción sin ADN polimerasa. ▪ Añadimos la ADN polimerasa individualmente a cada tubo una vez que la temperatura esté por encima de 65 ⁰C. Esta metodología resulta engorrosa y aumenta el riesgo de contaminación. ✓ Aislando la ADN polimerasa del resto de los componentes de la mezcla hasta que se alcance una temperatura elevada. ▪ El aislamiento se consigue, por ejemplo, incluyendo la ADN polimerasa en el interior de una esfera de cera. ✓ Suministrando la ADN polimerasa inactiva bloqueándola con un anticuerpo especifico o modificándola químicamente con un bloqueante termolábil.  4. MODALIDADES DE LA PCR ESTÁNDAR 4.2 PCR DE GRANDES FRAGMENTOS El rendimiento de la PCR estándar suele disminuir drásticamente cuando se amplifican fragmentos mayores de 5 kb. La PCR de grandes fragmentos es una variante de la PCR estándar que permite aumentar el rendimiento cuando se amplifican fragmentos de entre 5 y 35 kb. El diseño de esta PCR afecta a la composición de la mezcla de reacción y a la programación del termociclador. ✓ La mezcla de reacción. ▪ Posee una mezcla de dos ADN polimerasas. Una mayoritaria (elevada concentración) sin actividad correctora. Otra minoritaria (baja concentración) con potente actividad correctora. ▪ Uso de aditivos. El glicerol, que estabiliza las ADN polimerasas. El DMSO, que favorece la desnaturalización. ▪ Concentraciones bajas de potasio en el tampón de reacción favorece la eficiencia de la amplificación de fragmentos largos. ✓ La programación del termociclador tiene como peculiaridades: ▪ Tenemos que aumentar el tiempo de extensión en cada ciclo (hasta 25 minutos). ▪ Tenemos que acortar los tiempos de desnaturalización (2-10 segundos) para minimizar la inactivación de las polimerasas.  4. MODALIDADES DE LA PCR ESTÁNDAR 4.3 PCR DE ALTA FIDELIDAD Para algunas aplicaciones a las que van a ser destinados los productos de PCR, como la expresión génica o clonación, se requiere una PCR de alta fidelidad. Las PCR de alta fidelidad son PCR realizadas en condiciones especiales para evitar introducir en los amplicones mutaciones puntuales por incorporación de nucleótidos erróneos. Las variaciones que se aplican en la mezcla de reacción son: ✓ Utilización de ADN polimerasas termoestables con actividad correctora. ✓ Favorecer las condiciones óptimas de mayor fidelidad ajustando el pH de la reacción y la concentración de Mg+2.  5. OTRAS TÉCNICAS DE PCR Además de la PCR estándar disponemos de otras técnicas que nos permiten una mayor especificidad de aplicaciones, entre ellas están: ✓ La PCR anidada (Nested-PCR). ✓ La PCR múltiple (Multiplex PCR). ✓ La PCR con transcripción inversa (Reverse Transcription-PCR).  5. OTRAS TÉCNICAS DE PCR 5.1 PCR ANIDADA (NESTED-PCR) La PCR anidada o nested-PCR consiste en la realización de dos reacciones de PCR acopladas, de manera que la segunda PCR utiliza como ADN molde los productos amplificados de la primera. Para ello se usan dos parejas de cebadores, los cebadores externos (para la primera reacción de PCR) y los cebadores internos (para la segunda reacción de PCR). Se usa para aumentar la sensibilidad en los casos en que el rendimiento de la PCR estándar es bajo (poca cantidad del producto amplificado) o para aumentar la especificidad en los casos en que no es posible evitar el acumulo de productos no deseados con una PCR estándar. 5. OTRAS TÉCNICAS DE PCR 5.1 PCR ANIDADA (NESTED-PCR)  5. OTRAS TÉCNICAS DE PCR 5.4 PCR CON TRANSCRIPCIÓN INVERSA (RT-PCR) La PCR con transcripción inversa o RT-PCR, permite amplificar y analizar moléculas de ARNm. Dado que las ADN polimerasas termoestables utilizan ADN como molde, para amplificar ARN mediante PCR es necesario realizar: ✓ Un paso previo de síntesis de ADNc mediante una retrotranscriptasa (RT) o transcriptasa inversa. ✓ Un segundo paso en el que una ADN polimerasa termoestable utiliza el ADNc como molde y lo amplifica. Estos dos pasos se pueden realizar en dos tubos independientes o en un mismo tubo.  5. OTRAS TÉCNICAS DE PCR 5.4 PCR CON TRANSCRIPCIÓN INVERSA (RT-PCR)  6. PCR A TIEMPO REAL https://www.youtube.com/watch?v=-bOV8X9zYBE La PCR estándar y sus variantes, al igual que los otros tipos de PCR estudiados hasta ahora se consideran reacciones a punto final. Es decir, el resultado de la reacción no se conoce hasta que no termina y se analizan sus productos mediante electroforesis. En la PCR a tiempo real, en cambio, se monitoriza el proceso de amplificación mediante el empleo de productos fluorescentes, de manera que la detección de los amplicones se realiza ciclo a ciclo. La PCR a tiempo real se realiza en un termociclador a tiempo real, que, además de las funciones típicas de un termociclador convencional, incorpora un lector de fluorescencia, de manera que puede medir la intensidad de fluorescencia en cada tubo de reacción en cualquier momento de la PCR.  6. PCR A TIEMPO REAL Las ventajas de la PCR tiempo real sobre la PCR a punto final son evidentes: ✓ Mayor rapidez en la detección cualitativa de secuencias diana en una muestra, ya que el resultado se puede obtener incluso antes de que termine la PCR. ✓ Resultados más fidedignos, puesto que la detección instrumental de fluorescencia es más objetiva y sensible que la tinción del ADN en un gel de electroforesis. ✓ Minimiza los problemas de contaminación, ya que tanto la amplificación como la detección se realizan en el mismo tubo cerrado. ✓ Dado que la intensidad de fluorescencia va a ser proporcional al ADN sintetizado, la PCR a tiempo real permite la cuantificación, tanto de los amplicones producidos, como del ADN diana inicial presente en la muestra.  6. PCR A TIEMPO REAL 6.1 APLICACIONES DE LA PCR A TIEMPO REAL Las aplicaciones más importantes de la PCR a tiempo real son la PCR cuantitativa a tiempo real y la detección de mutaciones mediante curvas de fusión. PCR cuantitativa a tiempo real (qPCR). ✓ La PCR cuantitativa a tiempo real, o qPCR, es una aplicación de la tecnología PCR a tiempo real que permite cuantificar la cantidad inicial de una molécula de ácido nucleico en una muestra. ✓ La cuantificación puede expresarse de dos maneras: ▪ Cuantificación absoluta. Las pruebas de cuantificación absoluta expresan el resultado final (cantidad de secuencia diana en la muestra) en unidades de concentración (como por ejemplo µg/µl) o en número de copias por unidad de volumen. ▪ Cuantificación relativa. Consiste en expresar la concentración de la secuencia diana en relación con la concentración de un gen de referencia que está presente en todas las muestras con un numero constante de copias.  6. PCR A TIEMPO REAL 6.1 APLICACIONES DE LA PCR A TIEMPO REAL Curvas de fusión y detección de mutaciones. ✓ Otra aplicación importante de las qPCR es la detección de mutaciones mediante curvas de fusión. ✓ La curva de fusión es la gráfica que se obtiene representando la fluorescencia frente a la temperatura. ✓ Tres tipos de curva de picos de fusión son posibles: ▪ Curva de un único pico de fusión a la temperatura correspondiente al punto de fusión de la sonda. Indica que el ADN molde no tiene mutaciones. ▪ Curva con un único pico de fusión a una temperatura menor al punto de fusión de la sonda. Indica la presencia de una mutación en homocigosis. ▪ Curva con dos picos de fusión, uno a la temperatura del punto de fusión de la sonda y otro a una temperatura menor. Indica una mutación en heterocigosis.