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Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR)

• La PCR es una técnica in vitro que amplifica el ADN, generando millones de copias idénticas a partir de una mínima cantidad de ADN molde.
• Originalmente diseñada para amplificar fragmentos cortos y únicos de ADN, la PCR tiene la capacidad de amplificar fragmentos grandes (hasta 35 kb) y tiene diferentes variantes.
• Permite amplificar varios fragmentos en una sola reacción (PCR múltiple).
• Facilita la amplificación de fragmentos de ARN (RT-PCR).
• Posibilita cuantificar la concentración de un ácido nucleico específico en una muestra (PCR cuantitativa o PCR a tiempo real).
• Las técnicas de PCR son rápidas y automatizadas.
• En comparación con técnicas de hibridación, requiere menos cantidad de muestras.
• Permite la cuantificación de secuencias concretas (PCR en tiempo real).
• Es una herramienta esencial en laboratorios de biología molecular.
• Tiene aplicaciones en biología, medicina, paleontología, diagnóstico y pronóstico de enfermedades, evolución, expresión génica, estudios filogenéticos, genotipado y medicina forense.

Bases Teóricas de la PCR

• Es es un proceso enzimático catalizado por una ADN polimerasa.
• Se basa en la replicación del ADN.
• Fue desarrollada por Kary Mullis en 1983 mediante ciclos secuenciales de replicación in vitro para obtener múltiples copias de ADN.
• Copias producidas sirven como moldes para posteriores ciclos, ampliando el número de copias.
• Ventaja principal: alta sensibilidad.
• Importante considerar la contaminación por factores como aerosoles, material no amplificado, microorganismos o material de PCR amplificado previamente.
• Para la correcta amplificación deben haber 2 factores:
  • Uso de cebadores específicos para copiar el fragmento de interés.
  • Uso de ADN Polimerasa termoestable para evitar la inactivación.

Cebadores o Primers

• Son oligonucleótidos monocatenarios complementarios a las regiones que delimitan o flanquean el fragmento a amplificar.
• Se diseñan en pares, complementarios a secuencias adyacentes en extremos y cadenas opuestas.
• El cebador que se une a la hebra molde con dirección 3'→5' se llama cebador F (forward).
• El cebador que se une a la hebra molde con dirección 5'→3' se llama cebador R (reverse).
• Son el sustrato para la actividad enzimática de la ADN polimerasa.
• Permiten la incorporación de nucleótidos con bases complementarias a la hebra molde.
• Los cebadores proporcionan pequeñas regiones de doble hélice.
• Definen la especificidad de la reacción, amplificando un segmento específico del ADN.
• Deben tener secuencias únicas para lograr una amplificación específica del ADN.
• El diseño de cebadores requiere conocer la región del ADN a amplificar.
• Los cebadores deben:
  • Tener una longitud de 18 a 30 bases.
  • Poseer una secuencia única en el genoma para asegurar la especificidad.
• Los cebadores de más de 30 bases aumentan la especificidad, pero disminuyen el rendimiento de la reacción.
• Composicion con un contenido de G+C entre el 40% y el 60%.

ADN Polimerasas Termoestables

• Cataliza la incorporación de nucleótidos en dirección 5'→3' a partir de una pequeña región con doble hélice, utilizando como molde ADN monocatenario y iones de magnesio (Mg2+).
• Presentan dos características diferenciales que las hacen propicias para su uso en la PCR.
• Primera caracteristica: Actividad polimerasa se realiza a una temperatura óptima de 70 a 75 ºC.
• Segunda característica: Mantiene la actividad polimerasa tras tiempos prolongados de incubación a 95 ºC (por encima de los 40 minutos),
• Hay distintos tipos de polimeras:
  • ADN polimerasas termoestables con actividad exonucleasa 5'→3', que es una actividad que no les permite corregir errores.
  • ADN polimerasas termoestables con actividad exonucleasa 5'→3' y 3'→5', es decir, con actividad de corrección
  • ADN polimerasas termoestables con actividad transcriptasa inversa, para sintetizar y amplificar ADNc a partir de ARN.

Ciclo Básico de una PCR

• El PCR se basa en la repetición secuencial de ciclos de replicación.
• Cada ciclo consta de 3 fases:
• Desnaturalización del ADN molde.
• Hibridación de los cebadores con el ADN molde.
• Extensión de los cebadores.
• La desnaturalización debe ser suficientemente larga a una temperatura suficientemente elevada (94-95 ºC durante 15-30 segundos) para garantizar la separación completa del ADN sin inactivar la ADN polimerasa.
• La hibridación de los cebadores con el ADN molde (annealing) se realiza habitualmente a una temperatura de entre 50 y 65 ºC.
• La Temperatura depende de la Tm de los cebadores - Tm + 5ºC.
• La temperatura óptima debe fijarse experimentalmente por cada pareja de cebadores.
• El tiempo estándar de la fase de hibridación oscila entre los 30 y 60 segundos.
• La extensión o elongación de los cebadores se realiza a la temperatura óptima de polimerización de la enzima.
• El tiempo de la fase de extensión está condicionada por la velocidad de polimerización de la enzima. La extension es de, aproximadamente de dos minutos para fragmentos de 1 kb.

Productos de Amplificación de la PCR

• La PCR produce varios tipos de productos, deseados y no deseados, en proporciones variables.
• Estudiar qué ocurre en los primeros ciclos de PCR con una única molécula de ADN nativa permite entender cómo se obtienen estos productos.
• En el primer ciclo:
  • La fase de desnaturalización inicial separa las cadenas de la molécula de ADN nativa.
  • En la fase de hibridación cada cebador se une a la secuencia diana.
  • Fase de síntesis de nuevas cadenas, que contienen fragmentos muy superiores ya que continua hasta la nueva fase de desnaturalización.
• Resultado despues del primer ciclo: 2 productos no deseados y 0 productos deseados.
• En ciclos posteriores se repite el proceso.
• En cada ciclo, el número de productos no deseados aumenta aritméticamente (2n), mientras que el número de amplicones aumenta exponencialmente (2n-2n).

PCR Convencional

• Es la forma más simple, en la que se amplifica un único fragmento de ADN, con un único par de cebadores y en un único proceso de amplificación a tiempo final.
• Es importante estudiar 4 aspectos:
  • La composición de la mezcla de reacción.
  • La preparación de la mezcla.
  • La programación del termociclador.
  • El análisis de los productos de la reacción.
• La mezcla de reacción contiene:
  • Tampón adecuado con el pH y la concentración salina.
  • Cloruro magnésico.
  • Desoxinucleótidos trifosfato.
  • Cebadores y ADN polimerasa.
  • ADN molde.
• Para preparar:
  • Es fundamental calcular los volúmenes de cada reactivo para obtener la concentración final deseada y completar el volumen con agua estéril (grado PCR).
  • Preparar la mezcla master que incluye todos los componentes excepto ADN molde.
• También:
  • Ajuste del volumen de reacción.
  • Establecer los controles positivos y negativos.
• Los negativos sirven para descarter problam y el positivo para verificar el exito de la PCR.
• La programación del termociclador para amplificar un fragmento de ADN incluye 3 etapas principales, que terminan con una incubación final:
  • Desnaturalización inicial,
  • Ciclos de replicación, con temperaturas y tiempos de incubación concretos.
  • Extensión final.

Análisis

• Termina con un último mantenimiento en incubación a 4ºC anulando la actividad de la enzima.
• Analisis mediante electroforesis en gel que permita ver:
  • Una única banda del tamaño adecuado confirma que ha funcionado correctamente.
  • Bandas de distinto tamaño indica productos no deseados.
  • Para fines únicos de detección, la banda especifica es suficiente.

Modalidades de la PCR Estándar

• Los intentos de reducir la creación de productos indeseados o la necesidad de fragmentos de amplificar hace que sea necesario:

• PCR con inicio en caliente.

• PCR de grandes fragmentos.

• PCR de alta fidelidad.

• En el periodo de preparación se intenta de evitar generar productos de amplificación ya que se podrian generar durante las fases de:

  • Mezcla de reacción,
  • Trasnporte al termociclador.
  • Ascendido de la temperatura.

• La PCR con inicio en caliente o Hot Start PCR, busca solucionar las malas amplificaciones.

  • Para preparar la mezcla de reacción, evitar añadir ADN polimerasa.
  • La adicion de la ADN polimerasa debe realizarse individualmente para cada tubo a 65ºC.
  • Aislar la ADN polimerasa de otros reactivos
  • Inactivación de lo ADN polimerasa bloqueándola con un anticuerpo o con un bloqueante termolábil.

• Modificales de la PCR Estándar:

  • Requiere aumentar el tiempo de extensión de cada ciclo.
  • Reducir los tiempos de desnaturalizacion.

• En los laboratorios se aplica en estos casos:

  • Para las aplicaciones de expresiones génicas/clonación , se utiliza una PCR alta fiabilidad para evitar mutaciones en los amplicones por incorporación de nucleótidos erróneos y ajustar el pH.
  • Para las aplicaciones con productos de PCR destinados a expresión génica, como la clonación, se requiere alta fidelidad.

Otras Técnicas de PCR

• A la PCR estandar tambien contamos con otras técnicas que nos permitan mayor especificidad o uso.
• Son:
  • PCR anidada (Nested-PCR).
  • PCR múltiple (Multiplex PCR).
  • PCR con transcripción inversa (Reverse Transcription-PCR).
• La PCR aninada se usa cuando el ADN está muy contaminado por las moleculas o compuestos de la solución.
• La PCR anidada o nested-PCR consiste en ejecutar 2 PCR acopladas donde el ADN de la primera PCR sirva como molde para la segunda.
• Para esto, se usan dos parejas de cebadores, los cebadores exteriores para la primera reacción del PCR, y los interiores, para la segunda.
• Amplifica la sensibilidad para cuando es bajo y aumentar especificidad.
• La PCR con transcripción inversa o RT-PCR, busca estudiar el ADN con transcripciones inversas, analizando moleculas ARNm.

PCR A Tiempo Real

• Se considera a La PCR estándar y sus variantes como reacciones a punto final donde no se conocen resultados.

• Ahora monitorean la amplificación con fluorescencia.

  • PCR estandar y sus variantes, consideradas rxns a pto final, hasta que terminan y analizan sus productos.
  • Empleo de productos fluorescentes para detectar amplificaciones y amplicones ciclo a ciclo.
  • Termociclador tiempo real, incorpora un lector de fluorescencia para medir la intensidad en tubos para detectar.

• Ventajas en tiempo real*

• Más rapidez en la detección de secuencias concretas.

• Más fiable,detección instrumental muy selectiva

• Minimiza la contaminación.

• Cuantificación, permite amplicones producidos, identificar ADN.

• Más importantes : la PCR cuantitativa y la detección de mutaciones mediante curvas fusión.

• PCR cuantitativa a tiempo real (qPCR)*

• Detecta mediante tecnología cuantitativa a tiempo real.

• Expresar en dos maneras:

  • Detectar la cantida exacta de la secuencia por unidadees como ug/ul), absoluto.
  • Expresar la secuencia ,relativo.

• *Curvas de fusión y detección de mutaciones

• Se detectan las mutaciones mediante las curvas de fusiones, mediante gráficas.

• Tres tipos:

  • Único pico fusión temperatura sonda: indica ADN molde sin mutaciones
  • Único pico fusión a menos temp fusion que sonda: indica mutación homocigosis
  • Dos picos fusión sonda y otras temperatura menor: indica mutacióm en heterocigosis -Detectado en genotipos que no podemos identificar fácilmente.