PCR: Reacción en cadena de la Polimerasa (2022) PDF

PCR: Reacción en cadena de la Polimerasa ¿Qué es la PCR? PCR→ Reacción en cadena de la polimerasa Es una técnica de amplificación de ADN que nos permite replicar una misma secuencia millones de veces en poco tiempo de un fragmento concreto de ADN. VENTAJAS QUE PRESENTA: -Puede realizarse en horas...

PCR: Reacción en cadena de la Polimerasa ¿Qué es la PCR? PCR→ Reacción en cadena de la polimerasa Es una técnica de amplificación de ADN que nos permite replicar una misma secuencia millones de veces en poco tiempo de un fragmento concreto de ADN. VENTAJAS QUE PRESENTA: -Puede realizarse en horas y es un proceso totalmente automatizado -como técnica de detección requiere poca cantidad de muestra y además es capaz de cuantificar secuencias concretas a tiempo real Sesión 20/01/2022 2 PCR PCR→ Reacción en cadena de la polimerasa Las aplicaciones q tiene son: Diagnóstico de ciertas enfermedades (covid) Evolución y respuesta a tratamientos. Estudios de expresión génica Medicina forense… Sesión 20/01/2022 3 Componentes de la PCR La PCR es un proceso enzimático, catalizado por una ADN polimerasa y basado básicamente en la replicación del ADN. Consiste en repetir secuencialmente los ciclos de replicación del ADN de forma que a partir de una única cadena de ADN molde se obtendrán múltiples copias, y a partir de cada copia nueva se generará la siguiente ya que nos servirá de molde. ¿Como conseguiremos que solo se nos copie el fragmento que queremos?→ Cebadores ¿Cómo conseguiremos que no se nos inactive la polimerasa por los ciclos de temperaturas? → Taq-polimerasa Sesión 20/01/2022 4 Componentes de la PCR ADN molde→cadena que se quiere replicar (amplificar) PRIMERS o Cebadores→es el factor más importante para que una PCR sea eficaz. Son oligonucleótidos de cadena corta y secuencia conocida, que será complementaria a las regiones que están ambos lados de la secuencia que queremos amplificar. Se utilizan 2 cebadores uno para cada una de las cadenas de ADN C. reverse C. forward Sesión 20/01/2022 6 PCR El cebador que se une en la hebra molde en dirección 3’→5’ :cebador F forward El cebador que se une en la hebra molde en dirección 5’→3’ :cebador R reverse Por lo tanto, un juego de 2 cebadores delimita la región de la molécula de ADN que se va a amplificar, fijan la especifidad de la reacción. Características de los cebadores: 1. Longitud entre 18-30 nucleótidos (por debajo pierden especificidad) 2. Composición de bases (mejore resultados si tiene mayor contenido en C-G) 3. Secuencias no deben tener secuencias complementarias (dímeros de cebadores) 4. Temperatura de fusión entre 52-65ºC Sesión 20/01/2022 7 PCR Sesión 20/01/2022 8 PCR Taq-polimerasa→ (por la bacteria tolerante al calor de la que se aisló (Thermus aquaticus). Es una ADN polimerasa que es estable y actúa eficientemente a altas temperaturas. Estas enzimas funcionan como la polimerasa normal, incorporan nucleótidos en dirección 5’→3’ a partir de Adn monocatenario. ¿Qué las diferencia para ser mejores para PCR? 1. Su actividad polimerasa optima es 70-75ºC 2. Mantiene su actividad polimerasa tras tiempos largos de incubación a 95ºC (desnaturalización) Sesión 20/01/2022 9 PCR Las polimerasas termoestables además de tener actividad polimerasa, tiene también actividad exonucleasa 5’→3’ y pueden tener o no actividad exonucleasa 3’→5’ que es la capacidad de reparar errores Tipos de taq-polimerasa según sean capaces de reparar errores: Con actividad exonucleasa 3’-5’ →es capaz de reparar errores Sin actividad exonucleasa 3’-5’→ No es capaz de reparar errores Actividad transcriptasa inversa→ puede utilizar ARN molde para sintetizar y amplificar ADN Sesión 20/01/2022 10  Componentes de la PCR Desoxirribonucleótidos trifosfatados o dNTP→( dATP, dCTP, dGTP,dTTP) son elementos químicos cargados positivamente necesarios para que funcione la polimerasa ya que esta los utilizara de sustrato para incorporarlos en las cadenas de nueva síntesis. Los 4 ha n de estas presentes en la misma concentración, ya que si no disminuye la eficacia del enzima. Cloruro de Mg → Optimiza la reacción. La taq polimerasa necesita iones Mg para desarrollar su actividad , la ausencia de ellos o una concentración muy baja harían que la polimerasa se inactivara. Una concentración demasiado elevada hace que disminuya la eficiencia de la actividad enzimática. Sesión 20/01/2022 11  Componentes de la PCR Agua libre de ADNasas y ARNasas (ultrapura) Buffer para mantener el PH (entre 8 y 9) Sesión 20/01/2022 12 PCR A toda esta mezcla de componentes se le llama master mix y es lo que introduciremos todo junto en el termociclador (el cual realiza la PCR) para amplificar la secuencia seleccionada Sesión 20/01/2022 13 Etapas deLa PCR 1ª Etapa→ Desnaturalización del ADN elevando la temperatura (95ºC) y se produce la separación de las 2 cadenas del ADN. No debe prolongarse mucho ya que la polimerasa se inactiva si es sometida a esta temperatura más de 40 min. 2ª Etapa→ Hibridación de los cebadores (annealing), se baja la temperatura a unos 50ºC-70ºC lo que permite que los cebadores se unan a su región complementaria de la cadena de ADN, esta es su temperatura media (tm) -Si la temperatura de hibridación es superior a la Tm de los cebadores, a más temperatura mayor especificidad, por lo tanto, disminuye la hibridación inespecífica y habrá una menor cantidad de productos génicos no deseados. - Si la temperatura de hibridación es menor a la Tm de los cebadores, estos hibridaran más eficientemente, aunque pueden aparecer productos no deseados por hibridación inespecífica Sesión 20/01/2022 14 ETAPAS DE LA PCR Tercera etapa→ Extensión o elongación en la cual se une la taq-polimerasa a los cebadores y a partir de ellos sintetiza las cadenas complementarias al fragmento molde. Vuelve a bajar la temperatura a 72ºC ya que es la temperatura optima de polimerización Los cebadores marcan el inicio de la replicación y por lo tanto la secuencia a amplificar https://www.youtube.com/watch?v=srScc8nyD jU Sesión 20/01/2022 15 Sesión 20/01/2022 16  PCR Todas estas reacciones se repiten en ciclos entre 30 y 40 veces dando lugar a una amplificación en cadena del fragmento de ADN Se utiliza el termociclador que es un sistema programable que enfia y calienta la reacción en periodos cortos de tiempo consiguiendo en cada fase la temperatura adecuada para que se produzca la replicación del ADN Sesión 20/01/2022 17 PCR Sesión 20/01/2022 18  Problemas que pueden surgir en la PCR 1. No se produce amplificación 2. Amplificaciones inespecíficas 3. Se forman dímeros de cebadores 4. Se produce contaminación ( hay que contar siempre con un control negativo muestras con todos los componentes menos el ADN y un control positivo muestra de ADN que se quiere amplificar.) Sesión 20/01/2022 19  Variantes de la PCR PCR multiplex→ Amplificación simultanea de varios fragmentos de ADN en un mimo tubo durante 1 sola reacción de PCR. PCR anidada→ doble PCR de forma que la segunda utiliza como ADN molde los productos de amplificación de la primera. PCR a tiempo real→ permite cuantificar y detectar la cantidad inicial de una molécula de ácido nucleico en una muestra. RT-PCR→ utiliza la transcriptasa inversa y es capaz de amplificar y analizar moléculas de ARN. Sesión 20/01/2022 20