Génétique Avancée CM2 PDF

[email protected] MAJ 04/11/2024  Partie II La PCR et techniques dérivées, l’électrophorèse MAJ LORN Da 2024-2025 | SEMESTRE 3 | MODULE SVHS3UE04 | GÉNÉTIQUE AVANCÉE 2 04/11/2024  1. PCR « cl...

[email protected] MAJ 04/11/2024  Partie II La PCR et techniques dérivées, l’électrophorèse MAJ LORN Da 2024-2025 | SEMESTRE 3 | MODULE SVHS3UE04 | GÉNÉTIQUE AVANCÉE 2 04/11/2024  1. PCR « classique » en point final 2. L’électrophorèse 3. Amplification de l’ARN (RT-PCR) 4. PCR quantitative (qPCR) ou PCR en temps réel Le plan 5. PCR multiplexe 6. PCR nichée (nested PCR) 7. PCR digitale en micro compartiments (PCR numérique) 1. PCR « classique » en point final PCR : Polymerase Chain Reaction PCR = ACP (Amplification en Chaîne par Polymérase) La PCR est une technique de réplication ciblée in vitro. La PCR permet d'obtenir d'importantes quantités d'un fragment d'ADN spécifique et de longueur définie à partir d'un échantillon complexe et peu abondant. Million de copies en quelques heures Cela suffit en général pour une utilisation ultérieure. Etapes d’un cycle de PCR 1 cycle de PCR = 3 étapes : 1. Dénaturation : les 2 brins d’ADN séparés par chauffage 3. Elongation : la Taq polymérase complète 2. Hybridation : la synthèse du brin d’ADN à 2 amorces constituées de courts partir des amorces. fragments d’ADN complémentaires à la séquence d’intérêt s’hybrident sur les brins séparés d’ADN.  Etapes d’un cycle de PCR 1 cycle de PCR = 3 étapes After n cycle => 2n copies https://antisensescienceblog.wordpress.com/2013/12/04/a-cornerstone-of-molecular-biology-the-pcr-reaction/ Réactifs de la PCR Réactifs nécessaires (5 éléments) : Taq polymérase Désoxyribonucléotides triphosphates (dNTPs) Amorces PCR master mix Tampon de PCR : Mg2+ Eau stérile + Fragment d’ADN à amplifier Limiter les erreurs de pipetage et les pertes de réactifs Réactifs de la PCR Tampon de PCR Taq polymérase (= ADN polymérase) qui apporte un environnement qui doit être résistante à la T °C pour chimique suffisant pour une DNA pouvoir rester intacte pendant le activité et une stabilité optimale processus de dénaturation de l’ADN de l'ADN polymérase. Buffer Désoxyribonucléotides triphosphate (dNTP) qui représentent les briques de construction nécessaire à l'ADN polymérase pour synthétiser un nouveau brin d’ADN H2O : pour compléter le volume de réaction MgCl2 : fournit les ions Mg2+ nécessaires comme cofacteur pour la polymérase. Réactifs de la PCR DNA 2 amorces (primers) qui sont complémentaires des extrémités 3’ des brins sens et anti-sens de l’ADN cible. Buffer Amore est un court fragment d'ADN simple brin. une longueur de 18 à 30 nucléotides (oligonucléotides). « l’ADN poly peut uniquement se lier et procéder à l’élongation d’un double brin d’ADN et sans les amorces l’élongation est impossible. » Optimisation de la réaction PCR Amorces (primers) Dans la mise au point de la réaction PCR, le choix des amorces est crucial. Elles vont avoir un double rôle : en s'hybridant à l'ADN matrice, elles délimitent la région d’ADN à amplifier (étape 2 du cycle) et avec leur extrémité 3'OH libre, elles servent d’amorce pour l’ADN polymérase (étape 3 du cycle). Optimisation de la réaction PCR Amorces (primers) Les amorces s’hybrident aux extrémités de la séquence à amplifier, ce qui implique que les séquences de nucléotides des extrémités de la région ADN amplifiée doivent être connues. Optimisation de la réaction PCR Amorces (primers) Pour faciliter le choix des séquences des 2 amorces, des logiciels d’analyse de séquences permettent de vérifier les points suivants :  des T°C de demi-dénaturation (Tm) comparables. Les amorces doivent s’hybrider à l'ADN matrice dans les mêmes conditions de T°C.  des séq. qui ne soient pas complémentaires entre elles (en particulier dans la région 3’)  des séq. qui ne contiennent pas de séquences répétées inversées (pas de repliement intra-moléculaire). https://rnbio.upmc.fr/bio-mol_pcr2  Optimisation de la réaction PCR T°C de demi-dénaturation (Tm) ou T°C de fusion de l’ADN (Primer melting T°C (Tm) en anglais) Tm est la T°C à la quelle une moitié du duplex d’ADN se dissocie pour devenir un simple brin et indique la stabilité du duplex. https://www.labce.com/spg2095622_melting_temperature_tm Optimisation de la réaction PCR T°C de demi-dénaturation (Tm) Pour calculer le Tm d’une amorce < 30 nucléotides, on utilise la relation suivante : Tm = 2(A + T) + 4(G + C) = …°C En général, Tm = 52 et 58 °C produisent les meilleurs résultats. Par exemple, Calculez la Tm cette amorce : GACTGCGTTAGGATTGGC Optimisation de la réaction PCR Critères de design des amorces de PCR ‐ Taille : 16 – 26 nucléotides ‐ Guanine-cytosine (GC) % : 40-60 % ‐ ∆Tm si possible < 2 °C ‐ Faible formation de dimères : Self dimer : dimère FF ou RR Hairspin : Cross dimer : dimères FR ‐ Extrémité 3’pauvre en GC (5 derniers nuclé.) : limite les élongation non spécifiques ‐ Spécificité pour la séquence cible vérifiée par alignement de séquences Optimisation de la réaction PCR Températures Les trois étapes d’un cycle PCR sont effectuées à des T°C différentes afin de contrôler l’activité enzymatique : 1. Dénaturation est réalisée à 92-95 °C, pour une dissociation complète des 2 brins d’ADN. Cette T °C est fixe. https://rnbio.upmc.fr/bio-mol_pcr2 Optimisation de la réaction PCR Températures Les trois étapes d’un cycle PCR sont effectuées à des T°C différentes afin de contrôler l’activité enzymatique : 2. Hybridation Cette T °C est variable. se fait à une T°C : Ta (annealing T°C) qui sera définie selon la nature des amorces. Cette T°C va déterminer la stabilité des hybrides une fois que l’appariement amorces/matrice est réalisé. https://rnbio.upmc.fr/bio-mol_pcr2 Optimisation de la réaction PCR Calcul de la T°C d’hybridation (Ta)  Ta devra être calculée pour chaque nouvelle PCR.  Ta dépend de la séq. en bases des oligonucléotides amorces.  Ta est légèrement inférieure (environ de 5°C) au Tm. Ta = Tm - 5°C *** Si les 2 amorces ont des Tm différents, il faudra prendre le Tm le plus faible pour calculer la Ta, afin de favoriser l'hybridation des 2 amorces. Optimisation de la réaction PCR Températures Les trois étapes d’un cycle PCR sont effectuées à des T°C différentes afin de contrôler l’activité enzymatique : Cette T °C est fixe. 3. Elongation ou polymérisation est à 72 °C, T°C de « travail » de l’ADN polymérase thermorésistante utilisée. Au cours de cette étape, les brins complémentaires d’ADN sont synthétisés à partir des extrémités 3’OH libre des amorces hybridées. https://rnbio.upmc.fr/bio-mol_pcr2 Cycles de T°C de la PCR La réaction est d'abord chauffée à 95 °C pour faire fondre (dénaturer) l'ADN en brins séparés. La réaction est finalement chauffée à 72 °C, T°C à laquelle l'enzyme Taq réplique l'ADN amorcé (élongation). La réaction est ensuite refroidie à ~50 °C, T°C à laquelle les amorces trouveront des régions complémentaires en base dans l'ADN, auxquelles elles se colleront (anneal). https://www.mun.ca/biology/scarr/PCR_simplified.html Cycles de T°C de la PCR Appareil : Thermocycleur Un thermocycleur permet d'automatiser la réaction PCR en programmant des cycles consécutifs de montée et de baisse de T°C. Bloc chauffant Microplaque PCR Clavier pour la programmation des cycles  Produit PCR After n cycle => 2n copies https://www.khanacademy.org/science/ap-biology/gene-expression-and-regulation/biotechnology/a/polymerase-chain- reaction-pcr Cinétique de la PCR Une PCR peut être divisée en 3 phases : Vérification des résultats de PCR Le résultat d'une PCR = mélange de fragments d’ADN de tailles différentes La taille des fragments d’ADN dépend de la distance séparant les amorces. Faire migrer le mélange réactionnel sur un gel d'agarose. Rechercher la présence d'un fragment correspondant à la taille attendue Vidéo 1 : PCR (Polymerase Chain Reaction)  2. Electrophorèse Electrophorèse Technique de séparation des ADN/ARN la plus utilisée : ÉLECTROPHORÈSE en gel d’AGAROSE ̶ molécules de 1 à environ 20-60 kb ̶ gels d’agarose les plus résolutifs peuvent permettent de séparer des molécules de 4 pb de différence en gel d’ACRYLAMIDE − petites molécules (d’une 10-100aine de pb, < 2 kb) − permet séparation de molécules différents d’une seule pb (un seul nucléotide)  utile notamment pour le séquençage − aussi et surtout utilisé pour séparer les protéines (SDS-PAGE) en CHAMP PULSÉ (PFGE = Pulsed Field Gel Electrophoresis) − très grosses molécules > 20-60 kb (chromosomes entier) Electrophorèse sur gel agarose Principe général de l’électrophorèse sur gel Technique analytique ou séparative, permettant de séparer des macromolécules chargées (ions) en fonction de leur taille (et de leur charge) en les faisant migrer au travers d’un gel poreux baignant dans un tampon conducteur, sous l’effet d’un champ électrique. Principe Les résultats d'une réaction PCR sont souvent visualisés (rendus visibles) à l'aide d'une électrophorèse sur gel. L'électrophorèse sur gel est une technique qui consiste à déplacer des fragments d'ADN à l’aide d’un courant électrique à travers une matrice de gel, ce qui permet de séparer les fragments d'ADN en fonction de leur taille. https://www.khanacademy.org/science/ap-biology/gene-expression-and-regulation/biotechnology/a/polymerase-chain-reaction-pcr Électrophorèse en gel d’agarose Séparation des acides nucléiques en fonction de leur TAILLE (longueur en pb) Basée sur le fait que les acides nucléiques sont des anions (groupement phosphates chargés négativement en condition de pH 7-8) Technique simple et utilisée en routine pour séparer des fragments d’ADN/ARN Electrophorèse d’ADN Les pores du gel fonctionnent comme un tamis, permettant aux petites molécules de se déplacer plus rapidement que les grosses. Electrophorèse d’ADN Les fragments d’ADN migrent Migration des fragments d’ADN de façon inversement entre les particules de gel selon proportionnelle à leur taille : le gradient électrique : les plus gros fragments migrent les ADN/ARN sont globalement peu tandis que les petits négatifs, déplacement vers le fragments migrent beaucoup pôle + Applications  Vérification efficacité digestion par enzymes de restriction  Vérification/identification taille amplicons de PCR  Génotypage  Cartes de restriction  Séparation de fragments pour isolement et purification d’un fragment particulier  Etc. Structure et composition de l’agarose L’agarose est un biopolymère naturel extrait des algues rouges (origine marine). Agarose = polymère d’agarobiose (origine marine) AGAROSE Formation du gel d’agarose Formation du gel d’agarose Refroidissement Refroidissement Polymères d’agarobioses formant des mailles emprisonnant des molécules d’eau → « gel » d’agarose Quantité d’agarose La taille des mailles/pores du gel dépend du % d’agarose. % agarose + élevé % agarose + faible Quantité d’agarose Le % d’agarose du gel définie sa résolution. Gels de 0,5 – 2,0 % d’agarose  + le gel est concentré en agarose, + ses mailles sont serrées → meilleur pouvoir de séparation des molécules + petites  - le gel est concentré en agarose, + ses mailles sont lâches → meilleur pouvoir de séparation des molécules + grosses Tampon de migration Tampon conducteur : Tampon TAE (Tris Acétate EDTA) ou TBE (Tris Borate EDTA) Tris (base) + Acide acétique ou acide Borique (acide faible) EDTA : chélateur d’ions bivalents, comme le Mg2+, qui sont des cofacteurs des nucléases  effet « tampon » = maintien du pH  8  protège l’échantillon malgré fluctuations des conditions environnementales et internes. Ions en solution aqueuse  « électrolytes », conductivité Tampon de migration Quand utiliser le TAE ou le TBE ? Acides nucléiques migrent plus vite dans le TAE que le TBE.  meilleure séparation des fragments de taille > 3 kb avec le TAE  meilleure séparation des fragments de petite taille (< 2 kb) avec le TBE - Le TBE a une meilleur pouvoir tampon  mieux pour les « runs » longs - Le TBE contient du Borate qui inhibe de nombreuses enzymes (les ligases,…)  Le TAE est donc plus adapté pour le clonage moléculaire. - TAE aussi plus adapté si on veut extraire l’ADN du gel d’agarose. Migration Migration en fonction de la taille sous l’effet d’un champ électrique homogène Cathode (-) Anode (+) Sous l’effet du champ électrique, les acides nucléiques (anions) se Ils sont freinés par le réseau de mailles du gel  + les déplacent vers l’anode (+). molécules sont encombrantes, moins elles migrent rapidement à travers les mailles du gel  grosses molécules auront migré moins loin quand on arrête le courant (sont vers le haut du gel). Migration La vitesse de migration dépend de la taille et de la conformation de l’ADN. Cas des plasmides Circulaire « ouverte » Linéaire Circulaire « super-enroulé » Migration La vitesse de migration dépend de la taille et de la conformation de l’ADN. Cas des plasmides Circulaire « ouverte » Linéaire Circulaire « super-enroulé » Révélation des ADN/ARN sur le gel d’agarose Naturellement ADN et ARN incolores  besoin d’un colorant pour les visualiser Bromure d’Éthidium (BET, EtBr) = agent intercalant de l’ADN, fluorescent sous UV (peu fluo à l’état libre, fortement fluo intercalé) BET se lie à l’ADN double brin par intercalation. Le BET, utile mais toxique ? Révélation des ADN/ARN sur le gel d’agarose Mais le BET est un CMR  alternatives moins toxiques : Gel Red = colorant fluorescent des acides nucléiques non cytotoxique (ne pénètre pas dans les cellules vivantes) Plus sensible que l’EtBr ou le SYBR® Safe *CMR signifie cancérogène, mutagène et reprotoxique. Marqueur de taille (ADN ladder en anglais) Un marqueur de taille ou une échelle d'ADN est un mélange de fragments d'ADN linéaires bicaténaires (2 brins) dont les tailles sont connues.  Marqueur de taille est placé dans le premier puits du gel.  Pour évaluer la taille des fragments dans les échantillons. Analyse du gel « Bande » dans le gels 1 bande = un grand nb de fgt d’ADN de la même taille ayant migré au même niveau. Analyse du gel La bande blanche peut être récupérée en coupant la bande sur le gel, en extrayant l’ADN de l’agarose et en le purifiant sur une colonne. « Bande » dans le gels Une colonne : fixation de l'ADN sur 1 bande = un grand nb de fgt d’ADN de la la colonne, lavage, puis élution de même taille ayant migré au même niveau. l'ADN purifié. Bilan électrophorèse en gel d’agarose Idéal pour la séparation de fragments d’ADN de grande taille (mais de l’ordre du kilobase, pas du mégabase) Vitesse et donc distance de migration en un temps donné dépendent de : Taille de l’acide nucléique Conformation de l’acide nucléique Concentration en agarose du gel (degré de réticulation du gel) Intensité/voltage du courant Conductivité du tampon de migration Séparation en fonction de la taille et de la conformation de l’acide nucléique Vidéo 2 : Electrophorèse d’ADN Electrophorèse sur gel de polyacrylamide SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulfate–PolyAcrylamide Gel Electrophoresis) Généralité : SDS-PAGE L’électrophorèse SDS-PAGE = électrophorèse en gel de polyacrylamide contenant du dodécysulfate de sodium Le SDS-PAGE est une technique consistant à faire migrer des protéines ou des fgt d'ADN dans un gel, sous l’influence d’un champ électrique, permettant ainsi leur séparation. Le SDS-PAGE est adaptée à la séparation de petits fragments. http://www.chimie-analytique.wikibis.com/electrophorese_sur_gel_de_polyacrylamide.php Généralité : SDS-PAGE Meilleure résolution pour la séparation des petits fragments d’ADN/ARN (qqs 100aines de pb) ou pour séparer des acides nucléiques de tailles ne différents que d’une ou qqs pb Gel de polyacrylamide La réalisation d'un gel de polyacrylamide se fait par polymérisation d'une solution d'acrylamide (qui forme des chaines) par du bisacrylamide qui lie ces chaînes entre elles (on parle de pontage). https://planet-vie.ens.fr/thematiques/manipulations-en-laboratoire/l-electrophorese Gel de polyacrylamide Polymérisation d’acrylamide et de bis-acrylamide, catalysée par l’ammonium persulfate (APS) et le N,N,N’,N’-tetramethylethylenediamine (TEMED) Concentration acrylamide & Ratio acrylamide/bis-acrylamide → Degré de réticulation, taille des pores du gel Gel de polyacrylamide En fonction de la conc. de départ de la sol. d'acrylamide, le réseau obtenu sera +/- réticulé, permettant la séparation de molécules +/- massives. % d’acrylamide Gamme de séparation en kDa 7,5% 45 - 400 10% 22 - 300 12% 13 - 200 15% 2,5 - 100 https://planet-vie.ens.fr/thematiques/manipulations-en-laboratoire/l-electrophorese Principe  La séparation est réalisée en conditions dénaturantes en raison de l’ajout de SDS (dodécylsulfate de sodium).  Le SDS est un détergent fort possédant une longue queue hydrocarbonée hydrophobe et une extrémité chargée négativement. SDS SDS Principe  Le SDS interagit avec les protéines par sa portion hydrocarbonée en liant leurs régions hydrophobes.  En se liant à la protéine, le SDS empêche son repliement et lui confère une charge nette négative. SDS Protéine  La structure native de la protéine est donc dénaturée, et une charge apparente négative est alors conférée à la protéine. Principe Les parties hydrophobes du SDS (noires) se fixent sur la et la SDS recouvrent. Protéine La charge nette est dominée par celle des molécules SDS, dont le nb est proportionnel à la longueur de la protéine. Procédure SDS-PAGE Le SDS se lie aux résidus Ajouter l'échantillon de protéine d'acides aminés et donne une sur SDS-PAGE : puit n°2 charge négative uniforme à la (L'échelle de protéines : puit N°1) protéine avec la chaleur, la Les bandes de protéines sont protéine est linéarisée. séparées par leur taille. 3. Amplification de l’ARN Reverse Transcription PCR (RT-PCR) Reverse Transcription PCR (RT-PCR) (ARN → ADN) https://study.com/academy/lesson/reverse-transcriptase-definition-function-structure.html Reverse Transcription PCR (RT-PCR) Transcription Inverse / Rétrotranscription : Processus par lequel une enzyme, la transcriptase inverse, polymérise un brin d’ADN par complémentarité de bases à partir d’une matrice ARN (soit processus inverse à celui de la transcription) Enzyme : Transcriptase Inverse (RT) : Reverse Transcriptase (en anglais)  Comprend au moins une activité ADN polymérase ARN-dépendante (ARN → ADNc simple brin)  Comprend souvent en plus une activité ADN polymérase ADN-dépendante (ADNc simple brin → ADNc double brin) Mais lors d’une RT-PCR, c’est plutôt l’ADN polymérase thermorésistante (ex: Taq) de la PCR qui fera le double brin d’ADNc au 1er cycle de PCR  Polymérisation 5’→ 3’ à partir d’une extrémité 3’OH → nécessite aussi AMORCES Types d’amorces pour la RT Amorces hexamères Amorces oligo-dT Amorces spécifiques - Une amorce d’hexamères aléatoires est un mélange d’hexanucléotides aléatoires. - Ces amorces vont, statistiquement, avoir une chance de se fixer sur l'ensemble des ARN présents dans la matrice. - L'amorçage aléatoire est très utilisé du fait de sa polyvalence. Procédure RT-PCR Brin d’ARNm est une matrice pour catalyser la synthèse du brin d’ADNc. ARN matrice Appariement ADNc synthétisé A avec T U avec A G avec C C avec G Etape 1: RT Etape 2 : PCR RT-PCR La RT-PCR se compose de 2 étapes : 1. Conversion de l'ARN en ADNc à l'aide de la transcriptase inverse «Synthèse d'ADNc» 2. Amplification de l'ADNc par PCR https://theory.labster.com/reverse-transcriptase-pcr/ RT-PCR Transcriptase inverse = ADN polymérase ARN dépendante, capable d'utiliser un brin d'ARN comme matrice pour catalyser la synthèse du brin d'ADN complémentaire (ADNc). PCR RT-PCR Si mesure de l’expression d’un gène → qPCR Bilan RT-PCR Rétrotranscription d’un ARN suivie d’une amplification par PCR  Exemples d’applications : Identification de virus à ARN Etude de l’expression d’un gène Le clonage des gènes https://slideplayer.fr/slide/14226762/ 4. La PCR quantitative (qPCR) ou PCR en temps réel PCR quantitative (qPCR) La qPCR permet de mesurer la quantité initiale d’une séquence d’ADN cible par la quantification du signal fluorescent en temps réel grâce à un marqueur fluorescent qui se lie à l’ADN cible. À la fin de chaque cycle d’amplification  quantité d’amplicon mesurée Cinétique complète de la PCR  quantification de la quantité initiale d’ADN cible Cinétique de la qPCR 3 2 1 Ct : Cycle threshold Cinétique de la qPCR : Ct (Cycle threshold) Rn : normalized reporter Ct (Cycle threshold) Ct (cycle threshold) = Cycle de seuil : nombre de cycles nécessaires pour enregistrer un signal significativement plus élevé que le bruit de fond. Le Ct correspond à l’intersection entre une courbe d’amplification et une ligne de seuil. https://slideplayer.fr/slide/14226762/ Technologies de détection  Tous les systèmes de qPCR reposent sur la détection et la quantification d’un émetteur fluorescent pendant le processus d’amplification.  L’augmentation du signal d’émission fluorescente est directement proportionnelle à la quantité d’amplicons produits durant la réaction.  Il existe 2 principes généraux pour la détection quantitative des amplicons : les agents se liant à l’ADN double brin (ex. SYBR Green I) ; les sondes fluorescentes. Technologies de détection  Le SYBR Green I est un composé organique aromatique C32H37N4S faisant partie des cyanines asymétriques (fluorophores).  Le SYBR Green I a la capacité de se lier aux acides nucléiques et d'émettre une fluorescence. Technologies de détection Le Sybr Green libre SYBR Green émet peu de fluorescence. Le colorant libre en solution émet peu de fluorescence (1). L’amorce s’hybride sur sa séquence cible. Durant l’étape d’élongation (3), une augmentation de la fluorescence est associée à la quantité de colorant se fixant à l’ADN Accroissement de la fluorescence double brin naissant (3). proportionnel à l’intégration du SybrGreen Technologies de détection Le Sybr Green libre SYBR Green émet peu de fluorescence. En temps réel, l’augmentation du signal de fluorescence est observée pendant l’étape d’élongation et l’émission fluorescente décroît complètement lorsque l’ADN est dénaturé au cycle suivant. L’amorce s’hybride sur sa séquence cible. L’émission de fluorescence est mesurée à la fin de chaque étape d’élongation pour chacun Accroissement de la des cycles par un système de lecture intégré à fluorescence l’appareil de qPCR qui permet de suivre proportionnel à l’intégration du l’augmentation de la quantité d’ADN amplifié SybrGreen durant la réaction. Technologies de détection 2. Les sondes fluorescentes Balises moléculaires (Molecular Beacons)  Les balises moléculaires sont des molécules en forme d’épingle à cheveux, dans lesquelles les bases de l’épingle sont le fluorochrome et l’extincteur (quencher en anglais). : extincteur Technologies de détection 2. Les sondes fluorescentes Balises moléculaires (Molecular Beacons) La boucle de l’épingle est constituée d’une séquence complémentaire à une séquence interne de la molécule amplifiée.  Technologies de détection Balises moléculaires La balise moléculaire passe sous forme relaxée avec proximité suffisante du Lorsque le fragment à amplifier est absent, la suppresseur qui inhibe l’émission de fluorescence balise moléculaire est sous forme d’épingle à du fluorochrome cheveux, et l’extincteur, près du fluorochrome, empêche ce dernier d’émettre son signal (1). L’amorce et la sonde s’hybrident sur leurs séquences Si la balise se lie à l’amplicon, l’extincteur et le cibles. L’éloignement du suppresseur permet l’émission fluorochrome s’éloignent, et il y a émission de de fluorescence du fluorescence (2). fluorochrome. La polymérase déplace la sonde qui retourne à La Taq polymérase en avançant va pousser la l’état libre. balise qui se décroche: extinction du signal (3). Vidéo 2 : Overview of qPCR Quantification de l’ADN cible par qPCR Quantification de l’ADN cible par qPCR Comment passer d’une fluorescence à un résultat ? 1. Détermination des Ct Rn : normalized reporter Rn = quantité de fluorescense mesuré pendant la PCR (= quantité du produit amplifié) https://slideplayer.fr/slide/14226762/ Quantification de l’ADN cible par qPCR Comment passer d’une fluorescence à un résultat ? 2. Comparaison des Ct Quantification absolue Quantification relative https://slideplayer.fr/slide/14226762/ Quantification de l’ADN cible par qPCR Comment passer d’une fluorescence à un résultat ? 2. Comparaison des Ct Ct inversement proportionnel au nb de copies d’ADN cible dans Quantification absolue l’échantillon https://slideplayer.fr/slide/14226762/ Quantification de l’ADN cible par qPCR Comment passer d’une fluorescence à un résultat ? 2. Comparaison des Ct Quantification absolue https://slideplayer.fr/slide/14226762/ Quantification de l’ADN cible par qPCR Comment passer d’une fluorescence à un résultat ? 2. Comparaison des Ct Quantification absolue Quantification relative https://slideplayer.fr/slide/14226762/ Quantification relative sans correction d’efficacité Quelques définitions  Contrôle endogène (ou gène de référence) : c’est un gène contrôle qui va être introduit avec les différents essais et dont la quantité est identique pour l’ensemble des échantillons. Exemple : gène GAPDH (Glycéraldéhyde-3-phosphate déshydrogénase)  Calibrateur : c’est un gène auquel les autres gènes vont être comparés ou c’est un échantillon auquel tous les autres sont comparés Calibrateur = échantillon «non traité» ou «temps zéro» Quantification relative sans correction d’efficacité Principe de la méthode des ΔΔCt : Le delta-delta Ct (ΔΔCt), la méthode de Livak, est la méthode la plus couramment utilisée pour analyser les données de la qPCR. Hypothèse : les efficacités du gène cible et du gène de référence sont égales à 100%. L’efficacité d'amplification = 100 % ou 2 ΔCt(échantillon) = Ct(gène étudié) − Ct(gène de réf dans échantillon) ΔCt(calibrateur) = Ct(gène étudié calibrateur) − Ct(gène de réf dans calibrateur) ΔΔCt = ΔCt(échantillon) − ΔCt(calibrateur) Quantification relative sans correction d’efficacité Principe de la méthode des ΔΔCt : Quantification Relative (RQ) : il s’agit de la comparaison par rapport au calibrateur dont la valeur est fixé à 1. RQ = 2-ΔΔCt  Le calibrateur est fixé à une valeur de 1. Les autres échantillons ont une valeur par rapport à ce calibrateur. Une valeur de 10 signifie que l’expression de ce gène est de 10X plus que le calibrateur. Une valeur de 0,1 signifie que l’expression de ce gène est de 10X moins que le calibrateur. Quantification relative sans correction d’efficacité Le gène de référence ou contrôle endogène corrige :  Variabilité de l’échantillon, pureté des gabarits  Possible dégradation du matériel, spécimen, échantillon  Variations de la quantité de départ/pipetage, etc.  Variations de l’efficacité de la synthèse de l’ADNc Le calibrateur : Normalise les différences de détection entre la cible et la référence ; hybridation des sondes, efficacité du FRET Permet de normaliser et comparer, via un point de repère constant, des expériences faites à différents moments. FRET : Fluorescence Resonance Energy Transfer Quantification relative sans correction d’efficacité  ΔCt(échantillon) = Ct(gène cible) − Ct(gène de réf dans échantillon)  ΔCt(calibrateur) = Ct(gène cible) − Ct(gène de réf dans calibrateur)  ΔΔCt = ΔCt(échantillon) − ΔCt(calibrateur)  RQ = 2-ΔΔCt Applications de la qPCR  Détections et quantifications microbiennes : bactéries, virus, mycètes, parasites (domaines médial, agroalimentaire, environnemental …)  Oncologie (RT-PCR quantitative)  Expression génique (RT-PCR quantitative) Expression génique : Ensemble des mécanismes conduisant, à travers la transcription de l'ADN en différents ARN et la traduction de l'ARN messager en protéines, 5. La PCR multiplexe PCR multiplexe Le multiplexage est un terme qui désigne le traitement simultané de plusieurs échantillons, généralement pour gagner du temps et de l'argent. Le terme de "PCR multiplexe" désigne une mise au point de la technique PCR autorisant l'amplification, en une seule réaction, de plusieurs segments d'ADN distincts. https://www.ens-lyon.fr/RELIE/PCR/faq/classchrono.htm PCR multiplexe Plusieurs couples d’amorces  plusieurs amplicons Contraintes :  Longueurs d’amplicons différentes  Design des amorces : - Tm proches pour toutes les amorces - Spécificité des couples d’amorces - Risque de formation de dimères Exemples d’applications : ▪ Identification de pathogènes ▪ Génotypage (recherche de SNP) SNP = single nucleotide polymorphism SNP est la variation (polymorphisme) d'une seule paire de bases du génome entre individus d'une même espèce, ou entre un individu et la séquence de référence de l'espèce. 6. La PCR nichée (nested PCR) PCR nichée Variante de la PCR qui augmente la spécificité de l'amplification de l'ADN en réduisant l'amplification non spécifique de l'ADN à l'aide de 2 séries d'amorces dirigées contre la même cible et de 2 réactions PCR successives. PCR nichée 1. L’ADN cible subit la 1ère PCR avec une 1ère paire d'amorces (external primers) et le produit de PCR pourrait contenir de l’ADN amplifié non spécifique. 2. Le produit de la 1ère réaction subit une 2nd PCR avec une 2nd paire d'amorces (internal primers) dont les sites d’hybridation sont localisés après l’extrémité 3’ de chacune des amorces utilisées dans la 1ère PCR. PCR nichée  Le produit de la 2nd PCR est plus court que le premier.  Si le mauvais locus a été amplifié par la 1ère PCR, il est peu probable qu’il soit amplifié par la 2nd paire d’amorces → spécificité augmentée. Bilan : PCR nichée  2 PCR successives  2 couples d’amorces  2ème amplicon interne au 1er donc plus petit  Spécificité accrue Exemples d’applications : ‐ Identification de virus à ARN - Amélioration de la spécificité de l’ADN amplifié www.abmgood.com  7. La PCR digitale en micro-compartiments (Digital PCR compartmentalization) PCR digitale en micro-compartiments  PCR digitale en micro-compartiments Chaque mélange de réactifs PCR et La cible nucléique est La fluorescence franchissant un seuil sera d’ADN cibles est aléatoirement spécifiquement amplifiée associée à un résultat de PCR positif. distribué dans plusieurs dizaines de comme dans une PCR standard. La fraction de réactions positives milliers de microréacteurs distincts. permettra d’estimer finement la quantité de cibles introduites initialement. PCR digitale en micro-compartiments Détecter le SARS-Cov-2  PCR numérique pour la détection de l'ARN viral du SARS-CoV-2  Test de diagnostic in vitro  Quantification absolue  3 gènes viraux ciblés : - COVID-19 (N gene) - COVID-19 (RdRP gene) - Sarbecovirus (E gene)  Amorces et sondes fluorescentes Détecter le SARS-Cov-2 N : gène de la protéine de M : gène de la protéine de membrane la nucléocapside E : gène de la protéine d'enveloppe ORF : cadre de lecture ouvert S : gène de la protéine du pic RdRp : gène de l'ARN polymérase ARN-dépendante Détecter le SARS-Cov-2  Cycles de PCR répétés  50 fois : obtenir un grand nombre de molécules d’ADN viral  La formation de produits de PCR visualisée à la fin de chaque cycle de PCR, en incorporant un signal fluorescent aux molécules d’ADN en cours de formation  Plus il y aura des molécules d’ADN formées, plus le signal fluorescent sera important et donc permettra de détecter la présence du virus Détecter le SARS-Cov-2 Détecter le SARS-Cov-2 Comment fonctionne le test de la COVID-19 ? 1. Un prélèvement nasopharyngés est effectué avec un écouvillon afin de recueillir des sécrétions éventuellement infectés par la coronavirus. Des crachats ou des sécrétions bronchoalvéolaires peuvent être prélevés. 2. Le SARS-Cov-2 a un génome constitué d’ARN, un acide nucléique. L’ARN du virus est recherché à partir d’une RT-PCR ; si le prélèvement est infectieux des fragments d’ARN viraux sont rétro-transcrits en ADNc qui est ensuite amplifié et mesuré. Vidéo : Coronavirus RT-PCR Des questions ?