Techniques d'analyse Support Cours (Partie 2) 24-25 - PDF

FACULTÉ DES SCIENCES DHAR EL MAHRAZ FÈS UNIVERSITÉ SIDI MOHAMED BEN ABDELLAH TECHNIQUES D’ANALYSE 2ÈME PARTIE PROF. MOUNIR TILAOUI FILIERES : BCG-BIOSCIENCES ET SCIENCES DE L’ENVIRONNEMENT...

FACULTÉ DES SCIENCES DHAR EL MAHRAZ FÈS UNIVERSITÉ SIDI MOHAMED BEN ABDELLAH TECHNIQUES D’ANALYSE 2ÈME PARTIE PROF. MOUNIR TILAOUI FILIERES : BCG-BIOSCIENCES ET SCIENCES DE L’ENVIRONNEMENT 0 SEMESTRE 3 / 2024-2025 III. Techniques de précipitation et de purification III.1. La précipitation La précipitation est une technique chimique au cours de laquelle un corps se sépare du liquide ou il était soluble, donnant un composé solide appelé un précipité. L’application de ce procédé est pour but de concentrer des molécules biologiques en solution et d’opérer un fractionnement des molécules biologiques selon leurs propriétés hydrosolubles. La technique de précipitation est utilisée en biologie surtout pour séparer et purifier les différents types de protéines. Les protéines sont des molécules sensibles à leur environnement et peuvent être facilement dénaturées, ce qui provoque des modifications structurelles et perdent temporairement ou définitivement leurs propriétés biologiques. Cette purification des protéines permet de : Ø Étudier les propriétés d’une protéine activité enzymatique, effet physiologique Ø Déterminer sa structure tridimensionnelle (tertiaire ou quaternaire) Ø Déterminer sa séquence en acides aminés 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Salting in A des faibles concentrations de 0,1 M à 0,3 M (faible force ionique), les sels favorisent la solubilité des protéines, c'est la solubilisation saline salting in Dans ce cas, Les sels lient directement les protéines et augmentent leur charge nette, ce qui favorise leur solubilité parce que les sels augmentent les interactions avec l’eau les sels augmentent la répulsion entre protéines (↓agrégation) Salting out A des grandes concentrations, les sels favorisent la précipitation des protéinés, on parle du dessalage (salting out). La précipitation par sel est parmi les techniques les plus utilisées pour purifier ou fractionner les protéines. Le dessalage d’une protéine, est une agrégation protéique qui implique des régions hydrophobes sur la surface d’une protéine. Au fur et à mesure que les ions de sels deviennent solvatés les molécules d’eau libres deviennent peu nombreuses. Il y aura une plus grande tendance pour la protéine de perdre des molécules d’eau autour des résidus hydrophobes et auront moins de surface hydratée, ce qui favorise l’agrégation, puisque les régions hydrophobes exposées ont une préférence à interagir entre elles plutôt qu’avec de l’eau. 10 III.2. Techniques Électrophorétiques L'électrophorèse est - avec la chromatographie - la principale des techniques utilisées en biologie pour la séparation et la caractérisation des molécules. Elle a quelques applications en chimie, mais est principalement utilisée en biochimie ou biologie moléculaire pour la séparation des protéines ou des acides nucléiques. La séparation des particules se fait en fonction de leur charge électrique et pour des charges identiques, en fonction de leur taille. Application d'électrophorèse q Déterminer le nombre de sous-unités d'une protéine et de déterminer leur masse molaire respective q Évaluer le degré de purification d'une protéine q Séparer des protéines pour les révéler par la technique du Western blot (réaction avec un ou des anticorps) q Séquencer l'ADN et de déterminer la taille de fragments d'ADN q Séparer des acides nucléiques pour les analyser par la technique du Northen blot (ARN) ou du Southern blot (ADN). La migration dépend : q De la charge de la protéine q De sa taille q Du support (gel plus ou moins réticulé, papier) q Dans la focalisation isoélectrique (électrophorèse dans gradient de pH) migration dépend uniquement du point isoélectrique (pI) q Dans l’électrophorèse SDS-PAGE, la vitesse de migration dépend de la taille de sous-unité (protéine dénaturée) q Du degré de réticulation du gel 11 Électrophores des acides nucléiques et des protéines Pour les acides nucléiques, les charges sont portées par les groupements phosphate du squelette. Tandis que les protéines, la situation est plus complexe et il existe différents types de groupements ionisables : Ceux pouvant acquérir une charge négative - Les fonctions acides carboxylique (-COOH) de l'acide glutamique, de l'acide aspartique et de l'extrémité C-terminale de la chaîne polypeptidique ; - La fonction thiol (-SH) de la cystéine - Les fonctions alcool (-OH) de la sérine, de la thréonine et de la tyrosine. Ceux pouvant acquérir une charge positive : - La fonction guanido de l’arginine - La fonction imidazole de l'histidine - La fonction amine (-NH2) de la lysine et de l'extrémité N-terminale de la chaîne polypeptidique - La charge nette d'une protéine dépend donc en général de sa composition en acides aminés et du pH III.2.3. Types d’électrophorèses A. Électrophorèse en veine liquide...première électrophorèse B. Électrophorèse sur gel d’agarose - Utilisée principalement pour la séparation des acides nucléiques (ADN et ARN) - Fragments à séparés de taille entre 0,2 et 50 kb - Séparation des molécules selon leur ratio charge / masse - Conjugue mobilité électrophorétique + effet filtration du gel (taille des pores limite vitesse de migration) 12 Un marqueur de taille ADN C’est un mélange de molécules d’ADN linéaires, de tailles connues et variées qui sont bien séparables sur un gel d’agarose par électrophorèse. Il sert de référence pour estimer la taille (inconnue) des molécules d'intérêt. 13 C. Électrophorèse SDS- PAGE C’est une technique de séparation et d’analyse de particules chargées par migration différentielles sous l’action d’un champ électrique. Dans ce type d'électrophorèse, la vitesse de migration est en fonction de la taille (l'effet de la charge est annulée). Le SDS se lie très fortement aux protéines en leur conférant une forme de bâtonnet. Les protéines lient environ une molécule de SDS pour deux résidus d’acides aminés La forte charge négative apportée par le SDS masque la charge intrinsèque de la protéine, bien que le rapport e/m reste identique. Par conséquent, l’électrophorèse de protéines en gel de polyacrylamide contenant du SDS les sépare en fonction de leur masse moléculaire, par effet de filtration sur gel : SDS- PAGE. Sodium dodecyl sulfate (SDS), a synthetic detergent La réaction de polymérisation en présence du TEMED et le persulfate d'ammonium. 14  SDS-PAGE Un gel d'achrylamide coloré par le bleu de coomassie Relation logarithmique entre la masse moléculaire d’une protéine et sa mobilité électrophorétique relative en SDS-PAGE 15 “Western blot” = “immunoempreinte” Révélation d’une protéine à l’aide d’un anticorps spécifique D. Focalisation isoélectrique Si un mélange de protéines est soumis à une électrophorèse dans une matrice ayant un gradient de pH et dont le pH augmente lentement de l’anode vers la cathode, chaque protéine va migrer jusqu’à l’endroit où le pH est égal à son point isoélectrique : E. Électrophorèse sur gel en deux dimensions (électrophorèse 2D) Le gradient de pH est obtenu en mélangeant des oligomères de faible mass (300-600 Da) qui portent des groupes amino et carboxyliques aliphatiques (ampholytes) formant ainsi un éventail de points isoélectriques 16 F. Électrophorèse capillaire C'est une technique récente qui commence à se développer et qui offre essentiellement les avantages de la rapidité́ , de la très grande résolution et, partant, de la très grande sensibilité de la détection. L'électrophorèse utilise un capillaire de silice de diamètre d'environ 50 μm et de longueur 1 m (rempli de tampon ou de gel), et des voltages enlevés (15 -30 kV). Ceci aboutit à des vitesses de migration très rapides des composés dans les capillaires et ceux-ci sont détectés par absorption UV, fluorimétrie ou conductimétrie directement sur le capillaire Application : Électrophorèse des protéines sériques q L’électrophorèse des protéines sériques est un examen simple, réalisé en routine qui permet de dépister et participe au suivi de nombreuses pathologies…syndromes inflammatoires, certains cancers, désordres physiologiques ou nutritionnels q Séparation des protéines sériques sous l’action d’un champ e1lectrique en tampon alcalin q Migration de la cathode vers l’anode q Vitesse de migration selon la taille des particules, la force ionique et la porosité du support q 6 fractions de protéines 17 III.3. La chromatographie C’est une technique d'analyse qualitative et quantitative dans laquelle l'échantillon contenant une ou plusieurs substances est entraîné par un courant de phase mobile, qui peut être liquide, gaz ou fluide supercritique, le long d'une phase stationnaire, qui peut être du papier, de la gélatine, de la silice, un polymère, de la silice greffée etc. Chaque substance se déplace à une vitesse donnée, dépendant de ses caractéristiques (polaire, non polaire, ionique, etc., et de celles des deux phases. La chromatographie est utilisée pour connaître la concentration de chaque composé d'un mélange (qualité et quantité) et même leur structure quand elle est couplée (GC-MS, LC-MS, LC-RMN, etc.). Principe La chromatographie repose sur l'entraînement d'un échantillon dissous par une phase mobile à travers une phase stationnaire. Celle-ci retient plus ou moins fortement les substances contenues dans l'échantillon dilué selon l'intensité des forces d'interactions de faible énergie (comme les forces de van der Waals, les liaisons hydrogène, etc.) réalisées entre les différentes espèces moléculaires et la phase stationnaire. Il existe de nombreux types de chromatographie ; on peut notamment les classer : Selon la nature de la phase mobile : La chromatographie en phase gazeuse (CPG ou GC en anglais) La chromatographie en phase liquide (CPL ou LC en anglais) ; La chromatographie en phase liquide à haute performance (CLHP ou HPLC en anglais) ; La chromatographie en phase supercritique ou fluide supercritique (CPS ou SFC en anglais). Selon le support de la phase stationnaire : La chromatographie sur colonne (regroupant notamment HPLC et CPG) ; La chromatographie planaire (qui recouvre chromatographie sur couche mince (CCM) et chromatographie sur papier) ; A. Séparation chromatographique Le mécanisme de la séparation chromatographique s’explique par les différences de répartition des molécules des composés d’un mélange entre deux phases non miscibles : l’une mobile et l’autre stationnaire. En chromatographie les constituants d'un mélange se partagent entre les deux phases : l’une phase mobile et l’autre stationnaire (figure 1) (où la répartition entre les deux phases peut être différente). Ce phénomène est dynamique, les molécules passant continuellement d'une phase à l’autre ; ce qui crée un état d'équilibre entre la phase mobile et la phase stationnaire pour un constituant en particulier. À ce moment le rapport des concentrations est égal au rapport des répartitions dans les deux phases ou coefficient de partage λ. λ = Cs/Cm où Cs = concentration dans la phase stationnaire et Cm = concentration dans la phase mobile Plus λ est grand, plus le composé est absorbé fortement dans la phase stationnaire et plus la rétention est grande et inversement. La valeur de λ dépend : - de la structure du composé qui détermine son affinité pour chacune des phases - de la nature de la phase stationnaire qui est un adsorbant ou un solvant pour chacun des composés - de la phase mobile, seulement si elle est un liquide, et donc un solvant pour chacun des composés - de la température qui affecte les pressions de vapeur et les solubilités 18 B. Classification des techniques chromatographiques selon les phases mobiles et selon les mécanismes de séparation C. Séparation en chromatographie d’adsorption En chromatographie d’adsorption, la répartition des molécules se fait entre la phase mobile et la surface de la phase stationnaire qui n’est pas liquide, donc qui ne joue pas le rôle de solvant. La figure 1 représente le mécanisme de l’adsorption et de la désorption. Figure 1. Répartition des molécules entre les deux phases dont l’une est solide. Ici les molécules sont adsorbées à la surface du solide. Les forces de Van der Waals, les liaisons hydrogène, etc., jouent aussi un rôle dans l’affinité qu’ont les molécules pour l’une ou l’autre phase. 19 La phase mobile La phase mobile peut être un gaz (gaz vecteur) ou un liquide (ou solvant). Si la phase mobile est un gaz elle ne sert qu’à entraîner les constituants à travers la colonne. Si la phase mobile est un liquide elle a un double rôle : celui d’entraîner les composés à travers la colonne et celui de solubiliser les constituants du mélange. D. Séparation en chromatographie de partage Différences de répartition des molécules des composés d’un mélange entre deux phases non miscibles ; l’une mobile et l’autre stationnaire constituée d’un liquide. Les différents composés d'un mélange sont entraînés par une phase mobile à travers une couche d'absorbant qui est fixe. Ils se déplacent plus ou moins rapidement selon leur répartition entre les deux phases décrites plus haut. Plus leur répartition dans la phase stationnaire est grande plus leur rétention est grande et inversement. L'affinité de chaque constituant pour la phase stationnaire dépend de sa solubilité dans cette phase et de sa polarité. Les forces qui entrent en jeu sont donc les forces de Van der Waals, les ponts hydrogène, etc. Figure 2. Répartition (elle peut être différente) des molécules d’un composé entre les deux phases Figure 3. Migration de trois composés en fonction de leur répartition entre les deux phases. Plus l'affinité des différents constituants pour la phase stationnaire est grande plus leur rétention est grande et inversement. Un constituant plus soluble qu'un autre dans la phase stationnaire est retenu davantage et migre plus lentement. 20 E. Grandeur de rétention et résolution 1. Le volume ou le temps de rétention Soit la séparation de deux composés par chromatographie de partage (figure 4). Un des paramètres les plus importants en chromatographie sur colonne est le volume de rétention qui s’exprime comme : Vr(ml) = tr(sec). D(ml/sec) où tr = temps de rétention et D = débit de la phase mobil Pour un soluté non retenu, ce volume devient : Vm(ml) = tm(sec). D(ml/sec) où V = volume mort ; tm = temps de rétention d’une substance non retenue sur la colonne (temps mort) ; D = débit de la phase mobile Le temps de rétention est habituellement utilisé à la place du volume de rétention et sa grandeur dépend : de la nature de la phase stationnaire de la nature de la phase mobile du débit de la phase mobile de la longueur de la colonne Figure 4. Chromatogramme typique montrant la séparation de deux constituants d’un mélange et les différents paramètres mesurables où : tm= temps de rétention d’une substance non retenue sur la colonne, tr= temps de rétention, tr’= temps de rétention corrigé par rapport à tm (tr’ = tr – tm), l= largeur du pic à la base, h= hauteur du pic, h’= hauteur corrigée du pic 21 2. Le facteur de capacité k’ Ce facteur s’apparente au coefficient de partage puisqu’il exprime le rapport de la quantité de soluté dans la phase stationnaire à la quantité de soluté dans la phase mobile. Ce facteur, sans dimension, peut être relié au temps de rétention. Il a l’avantage de ne dépendre ni du débit ni de la longueur de la colonne. Il est facilement calculé pour une substance dont le temps de rétention est tr par l’expression : 𝐭𝐫 − 𝐭𝐦 𝐊! = 𝐭𝐦 3. Le facteur de sélectivité a Il mesure la capacité de la colonne à séparer les maxima des pics. Plus elle est supérieure à 1, plus les temps de rétention sont éloignés. Ce facteur de sélectivité ou de séparation, sans dimension, est égal au rapport des facteurs de capacité de deux solutés dont on veut réaliser la séparation. Il s’exprime comme ceci : 𝐊′𝟐 (𝐭 𝐫𝟐 − 𝐭 𝐦 ) 𝛂= = 𝐊′𝟏 (𝐭 𝐫𝟏 − 𝐭 𝐦 ) Avec : K’2 = facteur de capacité du composé 2 ; K’1 : facteur de capacité du composé 1 ; Tr2= temps de rétention du composé 2 ; Tr1= temps de rétention du composé 1 ; tm=temps de rétention d’une substance non retenue. 4. La résolution R La résolution est une mesure de la qualité d’une séparation. Deux caractéristiques déterminent le degré de recouvrement des pics : a) la distance séparant les sommets de deux pics mesurée par tr2 - tr1; b) la largeur des pics à la base l. Figure 5. Résolution d’un chromatogramme a) les pics se recouvrent ; b) la distance séparant les sommets des pics est plus grande mais les largeurs à la base sont les mêmes qu’en a); c) la distance séparant les sommets des pics est égale à celle trouvée en a) mais les largeurs à la base sont plus petites qu’en b). Comme le montre la figure 5, la séparation idéale est réalisée en c) où la valeur de R est un peu plus grande que 1. Pour des valeurs de R beaucoup plus grande que 1, la séparation des pics n’est pas meilleure mais le temps de la séparation devient inutilement long. Si R = 1, les 2 pics se chevauche. Exprimée en termes de volume de rétention, la résolution est égale à 𝐕𝐫𝟐 − 𝐕𝐫𝟏 𝐑 = 𝟐, 0 𝐈𝟐 + 𝐈𝟏 22 Exprimée en termes de temps de rétention, la résolution est égale à 𝐭 𝐫𝟐 − 𝐭 𝐫𝟏 𝐑 = 𝟐, 0 𝐈𝟐 + 𝐈𝟏 5. Le nombre de plateaux théoriques N C’est un paramètre qui sert à mesurer la performance d’une colonne à distillation fractionnée. Autant il est souhaitable dans une distillation fractionnée d’avoir le plus de distillations simples possibles pour obtenir la meilleure séparation des constituants d’un mélange autant-il souhaitable que le passage d’une substance de la phase mobile à la phase stationnaire et inversement se fasse sur la distance la plus courte possible. Le nombre de fois que ce phénomène se passe correspond à un plateau théorique. 𝐭𝐫 𝟐 𝐭𝐫 𝟐 𝐍 = 𝟏𝟔 , 0 𝐨𝐮 𝐍 = 𝟓, 𝟓𝟒 , 0 𝐥 𝐖 Avec : l = largeur du pic à la base ; W = largeur du pic à mi-hauteur La hauteur équivalente à un plateau théorique h est : 𝐋𝐜 𝐡= 𝐍 où LC = longueur de la colonne et N = nombre de plateaux théoriques 6. Facteurs dépendant des conditions d'opération Le débit du gaz vecteur (phase gazeuse) ou du solvant (phase liquide) La hauteur d’un plateau théorique h peut être affectée par la vitesse du gaz vecteur ou son débit. En effet plus le débit du gaz vecteur est grand, plus le soluté migre rapidement et inversement car le débit modifie le coefficient de partage. Cette relation entre débit ou vitesse moyenne du gaz vecteur et la hauteur d’un plateau théorique moyenne h a été mise en évidence par Van Deemter (équation et figure ci-après). A dépend de la diffusion tourbillonnaire dans les canaux formés par les grains du support (colonnes remplies). A est inexistant dans une colonne capillaire. B est le facteur de la diffusion moléculaire dans la phase gazeuse. C dépend de la résistance au transfert de masse en phase liquide. Figure 6. Courbe de Van Deemter. Variation de la hauteur d’un plateau théorique en fonction du débit du gaz vecteur. 23 F. Chromatographie sur papier et sur couche mince La chromatographie sur papier (ou sur couche mince) est une technique de chromatographie en phase liquide. Pour effectuer une telle séparation, une petite quantité de la ou des solutions à analyser est déposée sur le bord d'une bande de papier de chromatographie (ou plaque CCM). Cet échantillon est adsorbé par le papier ; ce qui signifie que les molécules interagissent avec ce dernier et qu'elles auront tendance à rester au même endroit. Le papier est ensuite trempé dans un solvant (éluant : phase mobile) comme un mélange eau/éthanol et placé dans un récipient fermé. Pendant que le solvant (éluant) monte le long du papier par capillarité, il rencontre l'échantillon et l'entraîne. Les différentes substances constituant l'échantillon migrent à différentes vitesses selon qu'elles interagissent plus ou moins fortement avec le papier. Une fois l'opération terminée, généralement quand le front de solvant (éluant) est presque arrivé en haut du papier, le papier est retiré de la cuve et on laisse évaporer le solvant. Le résultat est appelé chromatogramme. Il y a plusieurs façons d'identifier les endroits où se trouvent les produits ainsi séparés : 1. les produits sont colorés (absorbent dans le visible), rien de spécial à faire. 2. les produits sont fluorescents, on peut les identifier sous une lampe ultraviolette. 3. sinon, il faut utiliser un révélateur (l’iode par exemple) qui réagira chimiquement avec les produits (en les transformant) et dont le résultat sera des taches apparentes. G. Chromatographie en phase gazeuse La chromatographie en phase gazeuse est une méthode de séparation des composés gazeux ou susceptibles d'être vaporisés par chauffage sans décomposition. Elle permet ainsi l'analyse de mélanges éventuellement très complexes dont les constituants peuvent différer d'une façon considérable par leur nature et leur volatilité. Un fluide appelé phase mobile parcourt un tube appelé colonne, renfermant un matériau solide servant de support à la phase stationnaire qui l'imprègne (appelé aussi solvant). A l'instant initial, le mélange à séparer est injecté à l'entrée de la colonne où il se dilue dans la phase mobile qui l'entraîne à travers celui- ci. Le temps de sortie de chaque pic, le " temps de rétention " caractérise qualitativement la substance concernée. L'amplitude de ces pics, ou encore l'aire limitée par ces pics et la prolongation de la ligne de base permet de mesurer la concentration de chaque soluté dans le mélange injecté, ce qui est le coté quantitatif de la CPG. 24 H. Chromatographie en phase liquide Selon la nature de la phase stationnaire et son interaction avec les molécules de soluté, les séparations chromatographiques sont classées en : Ø Chromatographie de partage en phase normale ou inversée Ø Chromatographie liquide de haute performance (HPLC) Ø Chromatographie d'adsorption, Ø Chromatographie d'exclusion stérique Ø Chromatographie sur échangeur d'ions (ou échangeuse d’ions), Ø Chromatographie d'affinité Ø Electrochromatographie 1. Chromatographie liquide de haute performance (HPLC) Principe : Les composés à séparer (solutés) sont mis en solution dans un solvant. Ce mélange est introduit dans la phase mobile liquide (éluant). Suivant la nature des molécules, elles interagissent plus ou moins avec la phase stationnaire dans un tube appelé colonne chromatographique. La phase mobile poussée par une pompe sous haute pression, parcourt le système chromatographique. Le mélange à analyser est injecté puis transporté au travers du système chromatographique. Les composés en solution se répartissent alors suivant leur affinité entre la phase mobile et la phase stationnaire. En sortie de colonne grâce à un détecteur approprié les différents solutés sont caractérisés par un pic. L'ensemble des pics enregistrés est appelé́ chromatogramme. 25 Figure 7. Injecteur à boucle. À gauche, le remplissage de la boucle. À droite, l’injection dans la colonne. 2. Chromatographie d'exclusion stérique 3. Chromatographie sur échangeur d'ions (ou échangeuse d’ions) 4. Chromatographie d'affinité 26